CC BY
8
ИММУНОПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО КОЛИЦИНА Е2 НА МОДЕЛИ ПНЕВМОНИИ ВИРУСНОГО ГЕНЕЗА У БЕЛЫХ МЫШЕЙ
М.А. Азямов, канд. вет. наук, ведущий научный сотрудник
Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н.В. Рудницкого (Россия, г. Киров)
DOI:10.24412/2500-1000-2022-11-1-7-12
Аннотация. Цель исследования - изучение иммунопротективного действия рекомби-нантного колицина Е2 ^ее Со1Е2) на модели пневмонии вирусного генеза у белых мышей. Были сформированы три группы нелинейных белых мышей. Первая (контрольная) интак-таная, мышам второй (подопытной) группы вводили интраназально по 50 мкл полинози-новую-полицитидиловую кислоту и через 24 часа 50 мкл (на мышь) вирусосодержащий раствор аденовируса 2 типа крупного рогатого скота. Животных третьей группы, после введения заражающих агентов, подвергали курсу внутрибрюшинных инъекций Rec ColE2 в дозе 0,1 мл (100 мг) на голову один раз в сутки в течение 8 дней. На 11-ые сутки мышей декапитировали. Методом проточной цитометрии проводили иммунофенотипирование Т-лимфоцитов в крови. Методом иммуноферментного анализа определяли цитокины, де-фензины и сурфактантный белок А. Во второй группе отмечали возрастание в крови Т-лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+ и CD25+, а также количество интерлейкина1 в (^-1Р), интерлейкина-2 (^-2), интерферона-гамма (Ш^у), фактора некроза опухолей (Т^-а), сурфактантного белка А (Б.Р-А), дефензинов а1 и в1 (DEFa1, DEFв1).
Получены достоверные данные о выраженном иммунопротективном действии Кес Со1Е2 на клеточный иммунитет белых мышей. Установлено, что препарат снижал уровень CD3+, CD4+, CD8+ и CD25+ в крови животных до физиологического и нормализовал количественные показатели К-1в, К-2, Ш^у, TNF-a, DEFa1, DEFв1 и БР-А.
Ключевые слова: аденовирус 2 типа, белые мыши, дефензины, иммунофенотипирова-ние, клеточный иммунитет, метод проточной цитометрии, рекомбинантный колицин Е2, Т-лимфоциты, цитокины.
Антропогенное воздействие на экологию планеты приводит к ускорению изменения генома вирусов. Такая ситуация создает угрозу возникновения сложно-контролируемых эпидемических и эпизоотических процессов.
Возбудители аденовирусной инфекции обладают высокой скоростью репликации, выраженной латенцией, способностью связываться с белками крови, что ведет к угнетению гуморального и клеточного иммунитета и достоверно подтверждается высокими показателями заболеваемости людей и животных при мониторинге вирусных заболеваний [1, 2].
Аденовирусы, в силу своего филогенетического развития, обладают высокой устойчивостью к химическим детергентам и длительно сохраняются во внешней среде [3]. Широкое применение в лечебной практике синтезированных лекарственных
препаратов вызывает появление резистентных вариантов аденовирусов, обусловленных изменениями тиамидинкиназы и ДНК-полимеразы пораженных клеток [4].
Некоторые варианты аденовирусов все чаще приобретают устойчивость к интер-феронам путем генной мутации или инги-бированием передачи сигналов интерферона после связывания его с рецептором [5].
Большинство противовирусных препаратов, несмотря на достаточно высокую терапевтическую эффективность обладают нефротокичностью, гепатотоксичностью, кардиваскулярной токсичностью и другим побочным действием [6].
В связи с этим, изучение новых препаратов для снижения репликации аденовирусов и исследование ответных реакций иммунитета на моделях in vivo может по-
мочь в объяснении некоторых аспектов иммунопатогенеза аденовирусных инфекций.
Целью работы являлось изучение им-мунопротективного действия рекомби-нантного колицина Е2 (патент №2188233 от 2708.2002, ТУ 9337-010-00008064-01) на модели пневмонии вирусного генеза у белых мышей.
Материалы и методы
Иммунопротективное действие реком-бинантного колицина Е2 (Rec ColE2) исследовали на модели пневмонии вирусного генеза у белых мышей.
Были сформированы три группы из нелинейных белых мышей-самцов с массой тела 25,0±1,0 г по 10 животных в каждой группе. Животных содержали при естественном режиме освещения и свободном доступе к воде и пище. Эксперименты выполняли в соответствие с международными рекомендациями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для исследований, от 18 марта 1986 года. Мыши первой (контрольной) интактной группы не подвергались манипуляциям. Животным второй и третьей (подопытных) групп интраназально вводили по 50 мкл на мышь раствора натриевой соли (20 мкг/мл) полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (Poly I:C), как индуктор воспаления вирусного генеза, способствующий возможности заражения мышей аденовирусом второго типа крупного рогатого скота. Через сутки мышам вышеуказанных групп интраназально в дозе 50 мкл на животное вводили вируссо-держащую суспензию аденовируса второго типа крупного рогатого скота, выделенного из экссудата носовой полости больного телёнка. Вирусосодержащая суспензия с инфекционной активностью 6,5 LgT^50ta на культуре клеток MDBK (Madin Darby Bull Kidney) в дозе 50мкл составляла 5LD50 для беспородных белых мышей в присутствии полиинозиновой-полицитидиловой кислоты.
Через 24 часа после введения аденовируса второго типа (Adv2) животным третьей (подопытной) группы вводили Rec ColE2 внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл
(100 мкг Rec ColE2) один раз в сутки в течение 8 суток.
Наблюдение за белыми мышами осуществляли в течение 10 суток. Гибели среди переболевших мышей подопытных групп не отмечали.
После 10 суток мышей всех трех групп усыпляли декапитацией с взятием крови от каждого животного. Эритроциты в исследуемых пробах крови удаляли раствором BD FASK Lysin solution с последующим трехразовым отмыванием. Для иммунофе-нотипирования Т-лимфоцитов использовали моноклональные антитела меченые флюоресцеиномизотиоционатом к CD4 и CD85 (Caltag Inoitrogen) и к CD3, CD8 -фикоэритрином (BD Biosciences Farmingen). Содержание субпопуляций Т-лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии на проточном цитометре Facs Calibur (Becton Dicrinson).
Количество цитокинов - интерлейкина-1ß (Il-1ß), интерлейкина-2 (Il-2), гамма-интерферона (IFN-y), фактора некроза опухолей альфа (TNF-a) в крови мышей определяли методом иммуноферментного анализа диагностикумами Clon Cloud Co (США) и Cusabio Biotech Co (Китай) на иммуноферментном анализаторе Zenyth 340 (Anthos).
Количество дефензинов al (DEFa1), дефензинов ßl (DEFßl) и легочного сур-фактантного белка А (SP-A) в крови экспериментальных животных определяли методом ИФА диагностикумами Clon Cloud Co (США), Agilent Technologies (США).
Статистическую обработку данных проводили по программе Statistica [7].
Результаты и обсуждения
Известно, что Toll-подобные рецепторы (TLR) играют первичную роль в распознавании общих для всех патогенов молекул [8] Poly I:C, используемая в исследовании, как широко применяемый индуктор модели вирусного воспаления взаимодействовала в клетках с Toll-подобными рецепторами TLR-3, вызывала повреждение эндотелия лёгких и альвеолярной ткани и включал воспалительную реакцию. Действие Adv2 усиливало провоспалительный эффект с нарушением клеточно-
опосредованного иммунитета. Происходило разрушение эндотелия и альвеол лёгких, с высвобождением в кровеносные сосуды сурфактантного белка S-PA, обладающего способностью стимулировать хемотаксис фагоцитов и продукцию провос-палительных цитокинов, что подтверждалось пятикратным повышением количества S-PA в крови белых мышей второй (подопытной) группы по сравнению с показателями S-PA в крови мышей первой (контрольной) интактной группы (таблица).
Через 10 суток заражения в крови животных второй (подопытной) группы отмечали значительное повышение Т-хелперов CD4+ 22,76±0,58, по сравнению с 3,24±0,62 CD4+ первой (контрольной) группы, что вызвало повышение и
ГЬ2 в крови мышей второй подопытной группы на 50%, по сравнению с показате-
Таблица 1. Изучение влияния рекомбин<
Активация пролиферации иммунофер-ментных клеток и увеличение синтеза IFN-Y и фактора некроза опухоли TNF-a в крови мышей второй (подопытной) группы под воздействием Poly I:C и Adv-2 индуцировали повышенную экспрессию DEFa1 и DEFpi. Дефензины этих структурных групп блокировали вирусные рецепторы и взаимодействовали с инфицированными альвеолоцитами и клетками бронхиального эпителия. Но увеличение их количества
лями интерферона первой (контрольной) интактной группы. Повышение ^N-7 и ГЬ2 связано с воздействием на клетки-мишени CD4+ и ингибированием вирусной репликации.
Значительное возрастание количества CD8+ и СД25+ в крови зараженных белых мышей второй (подопытной) группы рассматривалось, как попытка компенсации и адаптации организма к воспалительному процессу за счёт тимацитов и зрелых Т-лимфоцитов (таблица). Повышение в крови CD3+ лимфоцитов указывало на остроту процесса и усиление цитоксичности к пораженным клеткам. Также отмечали увеличение количества провоспалительного интерлейкина ГЬ-1р, запускающего каскад цитокиновых реакций связанный с разрушением клеток бронхиального эпителия и альвеолоцитов второго типа.
юго колицина Е2 на клеточный иммунитет
в крови белых мышей второй подопытной группы не повлияло на развитие вирусного процесса (таблица).
В крови животных третьей подопытной группы после 8-дневного курса внутри-брюшинных инъекций Rec Со1Е2 отмечали нормализацию количества CD4+, CD8+ и CD3+ в связи с подавлением инфекционно-токсического синдрома и снижением про-ливерации Т-лимфоцитов в кровяные сосуды [9, 10, 11]. Известно о То1-зависимой
в модели вирусной пневмонии у белых мышей
Показатели Первая группа n=10 контрольная интактная Вторая группа n=10 подопытная Poly I:C+Adv2 Третья группа n=10 подопытная после курса Rec ColE2
CD3+(106W 3,86±0,54 14,8±0,18* 5,05±0,46**
CD4+(106W 3,24±0,62 22,76±0,58* 4,26±0,35**
CD8+(106W 2,32±0,12 16,24±0,88* 3,42±0,82**
CD25+(106W 0,24±0,04 4,19±0,27* 0,36±0,18**
ЕЬ-1в(пг/мл) 154,2±16,9 610,5±11,8* 137,9±8,12**
ЕЬ-2(пг/мл) 520,4±21,5 1140,8±14,2* 630,4±15,8**
Ш№у(пг/мл) 824,5±11,84 1245,9±12,5 955,8±19,5
TNF-a(пг/мл) 386,8±10,88 890,56±15,37* 420,5±9,88**
DEFa1(пг/мл) 41,4±7,25 590,4±18,25* 52,2±8,15**
DEFPHnr/мл) 28,8±5,16 340,8±21,2* 38,4±4,13**
SP-А^г/мл) 14,5±0,28 72,5±1,24* 16,2±0,85**
*Р<0,5 — по отношению к первой (контрольной) интактной группе; **Р<0,5 — по отношению ко второй (подопытной) группе.
системе транслокации у колицинов и сходстве действия колицинов с механизмом действия фагов [12, 13]. Есть вероятность, что при воздействии Rec Со1Е2 на проницаемость альвеолоцитов и эпителиальных клеток дыхательного тракта и активации TLR-системы, повышалась возможность распознавания генома Adv-2. Кроме того, Rec Со1Е2 активировал DEFa1, который ингибировал аденовирус, предотвращал раскрытие вируса и высвобождение эндосомального белка IV во время проникновения в клетку. При этом связывание дифензина с участием капсида вируса в области пептонов, блокировало этапы снятия покрытия для высвобождения белка VI аденовируса [14]. В дальнейшем количество DEFa1 и DEFP1 приходили в физиологическую норму (таблица). В крови животных третьей подопытной группы отмечали снижение количества CD25+ и, соответственно, снижение экспрессии противовоспалительных цито-кинов ГЬ-2 и ТКР-а. На значительное снижение вирусной репликации у белых мышей третьей подопытной группы указывало 57%-ное снижение количества №N-7 по сравнению с данным показателем во второй подопытной группе.
Заключение
В результате выполненных исследований установлено, что при поражении организма белых мышей при интраназальном
введении Poly I:C и Adv-2 на 11-й день эксперимента отмечалось резкое повышение Т-лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+ и CD25+ в виде ответной реакции клеточного иммунитета. Повышение противовоспалительных цитокинов IL-ip, IL-2, IFN-7 и TNF-a указывало на острый воспалительный процесс вирусного генеза. Повышение SP-A в крови зараженных белых мышей указывало на разрушение клеток бронхиального эпителия и альвеолоцитов.
Значительное увеличение количества DEFal и DEFpi отражало активную противовирусную дефензиновую защиту организма при заражении Adv-2.
Отмечалось выраженное иммунопро-тективное действие Rec ColE2 на клеточный иммунитет белых мышей после инъекционного курса. В ходе исследований установлена нормализация показателей CD Т-лимфоцитов различных популяций и соответствующее снижение количества в крови экспериментальных мышей провос-палительных цитокинов до уровня значений интактных животных.
Отмечалась активация Rec ColE2 дефе-нзинов DEFal и DEFpi, свидетельствующая об их роли в подавлении вирусного процесса.
Полученные результаты подтверждают достоверное влияние Rec ColE2 на активацию клеточного иммунитета у белых мышей при вирусном заражении Adv-2.
Библиографический список
1. Lvov N.I., Peredelsky E.V., Grishin I.S. Frequency of isolation of adenovirus in young people from organized and the clinical significance of relevant serotypes 3rd Pan European // Congress of Militery Medicine: scientific abstracts. - Belgrade, 2014. - 139 p.
2. Гаффаров Х.З. Ретроспективный анализ респираторно-кишечных вирусов, циркулирующих среди поголовья крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2013. - Т. 216. - С. 78-84.
3. Chapron C.D. Detection of astroviruses, enteroviruses and adenoviruses types 40 and 41 in surface waters collected and evaluated by the information collection rule and integrated cell culture-nested PCR procedure // Applied and Environmental Microbiology. - 2000. - № 66. -P. 2520-2525.
4. Romanowski E.G., Gordon Y.J., Araullo-Cruz T. The antiviral resistance and replication of cidofovir-resistant adenovirus variants in the New Zealand white rabbit ocular model // Invest Ophtalmol Vis Sci. - 2001. - V. 42. - №8. - P. 1812-1815.
5. Lehmkuhl H.D., Habbs L.A. Serologic and hexon phylogenetic analysis of ruminant adenoviruses // Arch. Virol. - 2008. - № 153. - P. 891-897.
6. Coca S.P., Perazella M.A. Rapid communication: acute renal failure associated with tenofovir: evidence of drug-induced nephrotoxicity // Am J Med Sci. - 2002. - V. 324. №6. -P. 342-344.
7. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М.: МедиаСфера. 2002. - 312 с.
8. Салмина А.Б., Бойцова Е.Б., Моргун А.В., Панина Ю.А., Горина Я.В., Писарева Н.В., Нода М., Кутищева И.А., Мартынова Г.П. Экспрессия NLRP3 инфламмасом церебрального эндотелия при воспалении вирусного генеза in vitro // Бюллетень сибирской медицины. - 2017. - №16 (4). - С. 242-249. DOI: 10.20538/1682-0363-2017-4-242-249
9. Азямов М.А., Тихонов И.В., Девришов Д.А. Получение гибридного колицина Е2 // Ветеринарная медицина. - 2002. - №1. - С. 13. http://www.veterinarymedicine.ru/num1-2002.html.
10. Азямов М.А., Воронин Е.С., Тихонов И.В., Девришов Д.А., Маслов С.А., Зверьков Д.А. Изучение биологических свойств гибридного колицина Е2, полученного с использованием питательных сред из непищевого сырья // Тезисы докл. Всероссийской науч.-практич. конф., посвящ. 30-летию ВНИТИБП. - Щелково, М.: РСХА, 2001. - С. 356357.
11. Азямов М.А. Штамм бактерий B.subtilis pbColE2 - продуцент гибридного колицина Е2, используемый для получения ветеринарного препарата. Патент №2188233 от 27.08.2002.
12. Gratia J.P. Colicins in the Encyclopedia of Genetics // Academic Press. 2001. - P. 417418. Doi:Org/10.1006/Rwgn.2001.0245
13. Smith J.G., Silvestry M., Lindert S., Lu W., Nemerow G.R., Stewart Ph.L. Insight into the mechanisms of adenovirus capsid disassembly from studies of defensin neutralization // PLoS Pathog. 2010 Jun 24. №6 (6): e1000959. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000959
14. Sharma O., Zakharov S.D., Zhalnina M.V., Yamashita E., Cramer W.A. Handbook of Biologically Active Peptides //Academic Press. 2013. P. 93-100. DOI: ORG/10.1016/B978-0-12-385095-9.00017-8.
THE IMMUNOPROTECTIVE RECOMBINANT COLICIN E2 ACTION ON A VIRAL GENESIS'S PNEUMONIA WHITE MICE'S MODEL
M.A. Azyamov, Candidate of Veterinary Sciences, Leading Researcher Federal Agricultural Research Center of North-East named N.V. Rudnitskiy (Russia, Kirov)
Abstract. The research goal - to explore the immunoprotective recombinant colicin E2 (Rec ColE2) action on a viral genesis's pneumonia in white mice's model. The three groups of nonlinear white mice were formed. The first (control) was intact. The second (experimental) mice's group were administered intranasally 50 mcl polynosinic:polycitidylic acid and after 24 hours 50 mcl of adenovirus type 2 of cattle solution (on the mouse). The third group's animals droved inside the peritoneum of Rec ColE2 in a dose of 0,1 ml (100 mg) per head for 8 days once day. The mice were decapitated on the 11th day. Immunophenotyping of T-lymphocytes in the blood was performed by flow cytometry. Cytokines, defensins, and surfactant protein A were determined by enzyme immunoassay. In the second group, an increase in the blood of T-lymphocytes CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+, as well as the amount of interleukin 1 ft (IL-lft), interleukin-2 (IL-2), interferon-gamma (IFN-y), tumor necrosis factor (TNF-a), surfactant protein A (SP-A), defensins a1 and ftl (DEFal, DEFftl).
Reliable data were obtained on the pronounced immunoprotective effect of Rec ColE2 on the cellular immunity of white mice. It was found that the drug reduced the level of CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ in the blood of animals to physiological levels and normalized the quantitative indicators of IL-lft, IL-2, IFN-y, TNF-a, DEFal, DEFftl and SP-A.
Keywords: adenovirus type 2 of cattle, defensins, CD T-lymphocytes, cellular immunity, cy-tokins, cytometry cell analysis, immunophenotyping, recombinant colicin E2, white mice.
