CC BY
48
У
Si 8.
а
J
IP
sc с
S §
I
с
S §
к
<8 Jg.
t S?
Л
«g
8. S?
Sä
Л
s
¡5
£
ИММУНОМОРФОГЕНЕЗ У ПЕСЦОВ ПРИ ОРАЛЬНОЙ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА
И.И.Окулова, И.А.Домский, З.Н.Бельтюкова, В.А.Разницына1
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства им. проф. Б.М.Житкова РАСХН, г. Киров, е-mail: vniioz@mail.ru
1Вятская государственная сельскохозяйственная академия, г. Киров
В настоящее время для профилактики сальмонеллезной инфекции у сельскохозяйственных животных, птицы и пушных зверей разработаны и с успехом применяются аттенуированные штаммы сальмонелл (Шустер Б.Ю., Малахов Ю.А . с соавт., 1994).
Создание вакцины из аттенуирован-ных штаммов сальмонелл (Sal. typ-himurium № 3, Sal. dublin № 6, Sal. cholerae suis № 9) решило проблему эффективной профилактики этого инфекционного заболевания у пушных зверей (Домский И.А. с соавт., 1997, 2000, 2002, 2003). Анализ литературных данных свидетельствует, что наиболее эффективным является пероральный метод иммунизации живыми штаммами (Smith B.P, 1986). В результате пероральной иммунизации возникают все формы защиты - гуморальный, клеточный иммунитет, а также повышение местной резистентности тканей пищеварительного тракта (Першин Б.Б. 1980.; Воробьев А.А., 1973; Гайдамака А.В., 1990; Rettig H.I.,1971).
Целью нашей работы явилось изучение иммуноморфологии у песцов при иммунизации вакциной, содержащей аттеннуированные штаммы сальмонелл.
Материалы и методы. В работе использовали молодняк песцов (Aloplex lagopus) в возрасте пяти месяцев. Было сформировано 2 группы: опытная 20 зверей и контрольная 5 зверей (не-вакцинированные).
Животных опытной группы иммунизировали пероральновакциной,содержащей аттенуированные штаммы сальмонелл трех серотипов: Sal. tуphi-murium № 3, Sal. cholerae suis № 9, Sal. dublin № 6. Иммунизирующая доза вакцины (50 млрд. микробных тел) перемешивалась с разовой порцией корма и скармливалась зверям двукратно с интервалом 14 дней.
Животныхконтрольной группы не вакцинировали.
С целью изучения резистентности и специфического иммунитета у опытных животных брали кровь из вены бедра задней конечности (V.Saphena) до начала опытов и через 7, 14, 21, 28 дней после вакцинации для иммунологических реакций. Для морфологических исследований органов иммунной системы в вышеуказанные сроки после вакцинации зверей убивали и брали миндалины, подчелюстные лимфатические узлы, селезенку, которые фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина.
Для гистологического исследования материал обрабатывали по общепринятым методикам (Меркулов Г.А., 1969). Окрашивание проводили гематоксилином Майера и эозином. С целью дифференцировки клеточных элементов применяли окраску по Романовскому-Гимза. Подсчитывали количество и измеряли диаметр первичных и вторичных лимфоидных фолликулов в подчелюстных лимфатических узлах, селезенке и миндалинах. Морфометрические измерения органов иммунной системы проводили с использованием окуляр-микрометра МОВ-1-15 (мкм х 15) по всей площади среза при увеличении микроскоп МБИ - 3У42 (окуляр WF 10x18, объектив 4,0.10; 10/0.25) по Автандилову Г.Г. (1991). Фотографии сделаны камерой «DIGITAL» на микроскопе «GENAVAL» (окуляр HI100x1.25, объектив GF - Pw 10) В герминативном центре, паракорти-кальной зоне, промежуточных мозговых синусах, мозговых тяжах лимфатических узлов, а также в красной пульпе, герминативных центрах лимфоидных фолликулов селезенки подсчитывали количество бластных клеток, незрелых и зрелых плазматических клеток и число клеток с митозами. Подсчет клеточного состава производили в 50 полях зрения на микроскопе МБИ - 3У42, объектив 100/ 1.25.OIL, окуляр WF 10x18, специализированной сеткой С.Б. Стефанова (1985,1988). Идентификацию клеток проводили по Катинас Г.С. (1981).
Определение титра антител в реакции агглютинации (РА) проводили по Антонову Б.И. (1986). В качестве антигена для постановки реакции агглютинации использовали живые гомологичные штаммы сальмонелл, выращенные на мясо-пептонном агаре в течение 20 часов и смытые физраствором. Опсонофа-гоцитарную реакцию проводили по Лабинской А.С. (1978 г.). В качестве тест-микроорганизма при постановке иммунных реакций был использован вирулентный штамм Salmonella typhimurium №371, что характеризует специфичность полученных результатов опсоно-фагоцитарной реакции, поэтому полученные результаты можно рассматривать как специфические показатели, характеризующие иммунное состояние привитых зверей. Для оценки опсоно-фагоцитар-ной реакции использован числовой показатель Шритера.
Для статистической обработки цифровых материалов использовали общепринятые методы математической статистики, оценку достоверности проводили по критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1981).
При морфометрическом исследовании установлено, что диаметр лимфоидных фолликулов с развитым герминативным центром в селезенке (рис.1 б) увеличился на 7-й день после иммунизации в 1,6 раза (430,1±0,7мкм) (Р<0,001) при контроле 271,28±12,3 мкм. На 14-й день после вакцинации в селезенке диаметр лимфоидных фолликулов с герминативным центром уменьшился в 1,4 раза по сравнению с 7 днем иммунизации, а их количество увеличилось в 2,2 раза и составило 30,0±0,707 шт. (Р<0,001) при контроле 13,6±0,248 шт. В миндалинах диаметр лимфоидных фолликулов также увеличился на 7-й день
Рис. 1 а — селезенка. Бластные клетки В красной пульпе
Рис. 1 б — селезенка. Вторичный фолликул. Увеличение микроскопа: окуляр — И! 100x1/25, объектив — ОР — Р' 10
после вакцинации в 1,6 раза (681,36±18,7 мкм) (Р<0,001) при контроле 412,7±19,6 мкм, а на 14-й день после иммунизации количество лимфо-идных фолликулов увеличилось в 1,7 раза (12,4±1,03 шт.) (Р<0,01) при контроле 7,2±0,374 шт. В подчелюстных лимфатических узлах диаметр вторичных лимфоидных фолликулов на 7 после вакцинации увеличился в 1,4 раза (412,52±19,6 мкм) (Р<0,001), в контроле он составлял 291,7±7,79 мкм. На 14-й день после введения вакцины в подчелюстных лимфатических узлах диаметр вторичных лимфоидных фолликулов уменьшился по сравнению с 7 днем в 1,3 раза, а их количество увеличилось в 4 раза и составило 14,6±0,316 (Р<0,001) при контроле 4,0±316 шт.
Таким образом, чем сильнее антигенный стимул, тем шире и интенсивнее скопление пролиферирующих клеток в зародышевом центре. Первичный фолликул превращается в герминативный центр в течение примерно одной недели после активной иммунизации. Фолликулы увеличиваются в размерах, происходит увеличение и количество вторичных фолликулов с развитым герминативным центром. После завершения процесса иммуногенеза фолликул существенно уменьшается в размере.
Результаты морфологических исследований показали, что на 7-й день после иммунизации увеличилось количество бластных клеток в селезенке по сравнению с контролем в 2 раза (83,0±0,54 шт.) (Р<0,001), количество клеток с митозами увеличилось в 1,5 раза (29,8±0,31) (Р<0,001) (рис. 1а). В подчелюстных лимфатических узлах количество бластных клеток увеличилось в 2.9 раза (77.0±0.40), а клеток с митозами в 1.3,6 раза (17,4±0,40 шт.) (Р<0,001); в миндалинах количество бластных клеток увеличилось в 2.7 раза (75,8±0,583) (<0,001) (рис.2), а число клеток с митозами в 1.7 раза (19,8±0,37) (Р<0,001). Клеточный иммунитет подтверждается числовым показателем Шритера при опсоно-фагоцитарной реакции, который увеличился на 80% до 30,0±1,2 (Р<0,001). На 14-й день после иммунизации увеличилось количество незрелых плазматических клеток в селезенке в 1,3 раза (35,6±0,60 шт.) (Р<0,001), максимальное увеличение зрелых плазматических клеток отмечено на 21-й день после иммунизации в 2,2 раза
(39,0±0,31) (Р<0,001); в подчелюстных лимфатических узлах незрелых плазматических клеток увеличилось на 14-й день после введения вакцины в 2,3 раза (39,8±0,58 шт) (Р<0,001), зрелых плазматических клеток увеличилось также на 21-й день в 1,8 раз (30,8±0,66) (Р<0,001); в миндалинах незрелых плазматических клеток увеличилось в 1,8 раз на 14-й день после вакцинации (31,2±0,37 шт) (Р<0,001), а максимальное увеличение зрелых плазматических клеток на 21-й день в 1,9 раза (30,6±0,51) (Р<0,001). В эти же сроки титр специфических антител в реакции агглютинации повысился в 34 раза и составил 403,17 при контроле 11,89.
Таким образом, исходя из вышеуказанных данных, увеличение количества незрелых и зрелых плазматических клеток напрямую связано с повышением титра антител в сыворотке крови на 14-й день после иммунизации.
Полученные данные свидетельствуют, что у зверей, иммунизированных перорально вакциной, содержащей аттенуированные штаммы сальмонелл, происходит ярко выраженная иммунная реакция. Она характеризуется клеточной пролиферацией в лимфоидных органах, выражающейся в увеличении размера и количества вторичных лимфоидных фолликулов, количества бластных клеток, клеток с митозами, зрелых и незрелых лимфоцитов. В эти же сроки достоверно увеличивается показатель специфических антител в реакции РА и опсоно-фагоцитарная активность нейтрофилов, что подтверждает полноценную иммунную реакцию организма, обеспечивающую защиту зверей от сальмонеллезной инфекции.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Антонов Б.И. 1986. Лабораторные исследования в ветеринарии - бактериальные инфекции. - М.: Агропромиздат. 350 с.
Воробьев А.А. 1973. Теоретические и практические аспекты проблемы пе-роральной иммунизации на современном этапе. Микробиология. №7. С. 3-15.
Гайдамака А.В. 1990. Исследования иммунного статуса свиней в промышленных комплексах в связи с вакцинопрофилактикой сальмонеллеза: Авто-реф. дис... канд. биолог. наук. Харьков. 21 с.
Домский И.А. 2002. Оральная вакцинация пушных зверей против сальмонеллеза. Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию ВНИИОЗ.2 8-31.05. Киров. С. 548 -551.
Домский И.А., Бельтюкова З.Н. 2002. «Оценка иммунитета у пушных зверей, иммунизированных против сальмонеллеза». Материалы Международной научно-практической конференции «Проблемы восстановления и дальнейшего развития клеточного пушного звероводства и кролиководства России, посвященная 70-летию ГНУ НИИПЗК им.В.А.Афанасьева». 18-19 июня 2002 г., пос. Родники, Московская обл. С. 241-247.
Домский И.А., Кульминский А.Н. 2000. Характеристика гуморального иммунитета нутрий при оральной вакцинации против сальмонеллеза. Материалы Международной научно конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета (30-31 мая) 2000. Казань. 78 с.
Домский И.А., Кульминский А.Н. 1997. Сальмонеллез пушных зверей. Кролиководство и звероводство. №4. С. 24-25.
Лакин Г.Ф. 1989. Биометрия. - М.: С.105-107.
Лабинская А.С. 1981. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина. 392 с.
Меркулов Г.А. 1969. Курс патологогистологической техники. Ленинград: «Медицина».
Никольский В.В. 1968. Основы иммунитета животных. М. «Колос». 204 с.
Першин Б.Б. 1980. Вакцинация и местный иммунитет. Ленинград «Медицина». 210 с.
Шустер Б.Ю., Малахов Ю.А., Лебедев О.А., Ленев С.В. 1994. Специфическая профилактика сальмонеллеза сельскохозяйственных животных. Ветеринария. №2.
Reattig H.J. 1971. Die orale impfung mit inaktiviriten Mikroorganismen. Zehn Jahre Forschungsarbeit im Robert-Koch-Institut. //Bundesgesundheitblat, T. 14, №11, S.141-146.
Smith B.P. Immunity to Salmonella infection in cattle and application of vaccines. WHO, Munich, 13-17 October.
IV PP *
f JT-"
ы '-¿ft
• -
M
. s 1
и +Y?
*VbY Vj Ф
ma
'i ь ■ * b
xV* Vf
3
s-к su а.
-8H
к
Si
«
a о,
I
о к ff
à к
к
О
а.
к £
Рис. 2 а — бластные клетки в герминативном центре в миндалинах
Рис. 2 б — плазматические клетки в промежуточных синусах подчелюстных лимфатических узлах. Увеличение микроскопа: окуляр — И! 100x1/25, объектив — ОР — Р'м 10
