Иммуномодулирующие свойства гликозидов мурамоилдипептида с алифатическими агликонами с 10-с 14 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 26 (65). 2013. № 2. С. 216-221.

УДК 547.963.1

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ГЛИКОЗИДОВ МУРАМОИЛДИПЕПТИДА С АЛИФАТИЧЕСКИМИ АГЛИКОНАМИ С10-С14

Земляков А.Е., Цикалова В.Н.

Таврический национальный университет им. В. И. Вернадского, Симферополь, Украина

E-mail: alex_z56@mail ru

Изучена стимуляция ß-алкилгликозидами мурамоилдипептида антиинфекционной резистентности мышей к заражению Staphylococcus aureus и Escherichia coli. Исследовано прямое цитотоксическое действие этих гликопептидов на клетки эритробластного лейкоза человека К-562 и мононуклеарные клетки крови (МНК), а также их влияние на продукцию МНК естественных киллеров и пролиферативную активность.

Ключевые слова: мурамоилдипептиды; гликозиды мурамоилдипептида, антинфекционная резистентность, цитотоксичность, пролиферация.

ВВЕДЕНИЕ

На иммуностимулирующую активность липофильных производных N-ацетилмурамоил-Ь-аланил-О-изоглутамина (мурамоилдипептида, MDP)

существенное влияние оказывает структура липофильной компоненты и реализующееся при этом определенное соотношение гидрофильно-липофильных свойств. ß-Гликозиды MDP с линейными алифатическими агликонами С4-С8 [1, 2], обладающие амфифильными свойствами, показали высокую иммуностимулирующую активность в различных тестах in vitro и in vivo, превышающую действие самого мурамоилдипептида [2]. В частности, ß-гептилгликозид MDP проявил себя как эффективный адъювант [3], стимулятор антиинфекционной резистентности [4] и препарат для иммунотерапии опухолей [5].

Другую группу составили более липофильные алкил-О-гликозиды мурамоилдипептида с агликонами Сю-С^. Установлено, что ß-децил-МОР обладает умеренным протективным эффектом в отношении зараженных гриппом мышей, ß-децил- и ß-додецил-МОР ингибируют бактериальную биолюминесценцию [6], а ß-гексадецил-МОР [1] стимулирует продукцию ряда монокинов [7].

В данном сообщении приводятся результаты изучения иммуномодулирующей активности ß-децил- (2а), ß-додецил- (2b), ß-тетрадецил- (2с) гликозидов мурамоилдипептида в ряде экспериментов in vitro и in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез гликозидов МОР 2а-с описан в [6]. В качестве референс-контроля в ряде тестов использовали МОР (1). Спектры :Н ЯМР получены на приборе Varían VXR-

300 (300 МГц), спектры COSY на спектрометре Varían Mercury 400, растворитель -ДМСО-^б, внутренний стандарт - Me4Si. Приведены химические сдвиги (5-шкала) и константы спин-спинового взаимодействия (J, Гц).

Тестирование протективной активности производных MDP, а также их влияния на ЕК-активность МНК и прямое цитотоксическое действие проводили по методикам, приведенных в [8, 9]. Результаты биологических исследований любезно предоставлены д.м.н., профессором О.В. Калюжиным (НИИ морфологии человека РАМН, Москва, РФ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структура b-алкилгликозидов MDP 2а-с была подтверждена данными :Н ЯМР-спектроскопии (см. Табл.). С целью более точного отнесения ряда сигналов, в т. ч. аномерного протона и амидных протонов, был поучен спектр COSY для g-бензилового эфира производного 2b (Рис. 1).

, ^ OH

HO O

O

Me^ h

// N O

Me N H

^ OR NHAc

O COOH

1. R = H

2. R = (CH2)nCH3

n = 9 (a), 11 (b), 13 (c)

CONH

F1 Cppm)

Рис. 1. Фрагмент спектра COSY b-додецилгликозида 2b.

Первоначальное исследование способности гликозидов мурамоилдипептида 2а-с в диапазоне доз 2 - 200 мкг/мышь стимулировать резистентность мышей к бактериальному поражению, проведенное на модели сепсиса, вызываемого внутрибрюшинным введением летальной дозы Staphylococcus aureus, не позволило выявить каких-либо закономерностей. Все соединения проявили 100% защитный эффект. Поэтому повторный эксперимент проводили с использованием доз 0,1, 2 и 40 мкг/мышь. Данные, приведенные на Рис. 2А, свидетельствуют о том, что наибольшее протективное действие оказывали b-децил- и b-додецилгликозиды MDP 2а,Ь в дозе 40 мкг/мышь. Для этих соединений наблюдается четкий дозозависимый эффект.

Таблица

Характеристические сигналы ХН ЯМР-спектров соединений 2а-с

Группа или атом Химические сдвиги, м.д. (КССВ, Гц)

2а 2b 2c

OR: СН2СН3 0,87т 0,85т 0,87т

(СН2)П 1,24м, 1,45м 1,24м, 1,43м 1,24м, 1,44м, 1,56м

Mur: Н1 (Ju) 4,25д (8,5) 4,26д (8,5) 4,25д (8,5)

NAc 1,76с 1,75с 1,76с

NH 7,73д 7,79д 7,76д

C4-OH 5,18уд 5,25уд 5,16уд

C6-OH 4,55ут 4,54ут 4,53ут

СНзСНСО 1,24м 1,23м 1,23м

Ala: СН3СН 1,24м 1,23м 1,23м

NH 7,38д 7,39д 7,41 д

iGln: у-СН2 2,19т 2,19т 2,17т

Р-СН2 1,73м, 1,97м 1,73м, 1,97м 1,71м, 1,96м

œNH2 6,99с, 7,26с 7,05с, 7,30с 6,98с, 7,25с

NH 8,04д 8,10д 8,13д

Изучение протективного эффекта гликозидов 2а-с к заражению мышей Escherichia coli показало оппозитные результаты (см. Рис. 2Б). Наиболее активным был Ь-тетрадецил-MDP 2с в дозе 1 мкг/мышь.

Для гликозидных производных 2а-с также было изучено прямое действие на клетки эритробластного лейкоза человека К-562 и мононуклеарные клетки крови (МНК) (Рис. 3). Тетрадецилгликозид MDP 2с продемонстрировал достоверное цитотоксическое действие на опухолевые клетки только в концентрации 200 мкг/мл. Два других гликозида мурамоилдипептида не влияли на жизнеспособность лейкозных клеток. Повышение цитотоксической активности гликозидов MDP с ростом липофильности ранее отмечалось для b-диалкилметилгликозидов мурамоилдипептида [9]. Все три исследуемых гликозида практически не влияли на МНК здоровых клеток.

Выживаемость, % 100

60

40

20

□ 40 мкг/мышь

□ 2 мкг/мышь

□ 0,1 мкг/мышь

г

I

Выживаемость, % 80 т

60

40

20

□ 20 мкг/мышь

□ 1 мкг/мышь

□ 0,05 мкг/мышь

I

MDP

(2a)

(А)

(2b) (2c)

MDP

(2a) (2b)

(Б)

(2c)

Рис. 2 Влияние гликозидов MDP 2а-с на протективный эффект к заражению мышей культурой S. aureus (109 клеток/мышь) (А) и Е. coli (2107 клеток/мышь) (Б).

При совместной инкубации клеток К-562, чувствительных к естественным киллерам (ЕК), и МНК, обработанных тестируемыми веществами, существенные цитотоксические эффекты отмечались только для концентраций 20 и 200 мкг/мл (Рис. 3). При этом для тетрадецилгликозида MDP 2с характерна собственная высокая цитотоксичность. В тоже время эффекты ß-децил- и ß-додецилгликозидов MDP 2а,Ь в основном связаны со способностью индуцировать ЕК-активность МНК.

ЦИ (%)

□ МНК □ К-562 Пакт. МНК + К-562

I П I п

Mill!

2 20 200 2 20 200 2 20 200 2 20 200 МНК (1) (2а) (2Ь) (2с)

Рис. 3. Влияние гликозидов МБР 2а-с на ЕК-активность МНК и прямое цитотоксическое действие на клетки К-562 и МНК; ЦИ - цитотоксический индекс.

Важность определенного гидрофильно-липофильного баланса для проявления биологической активности гликозидных производных мурамоилдипептида еще раз подчеркивают результаты изучения пролиферативной активности МНК (Рис. 4). Только Ь-додецилгликозид МБР 2Ь достоверно стимулировал пролиферацию.

0

0

1,5 1,20,9 0,6 0,3 0

□ 200 м кг/мл □ 20 м кг/мл □ 2 мкг/мл

—<

MDP

(2a)

(2b)

(2c)

Рис. 4. Влияние гликозидов MDP 2а-с на пролиферативную активность МНК;

ИП - индекс пролиферации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Установлен протективный эффект при заражении мышей культурой S. aureus для ß-децил- и Ь-додецил-MDP в дозе 40 мкг/мышь и в случае Е. coli - для ß-тетрадецил-MDP в дозе 1 мкг/мышь.

2. Выявлено цитотоксическое действие Ь-тетрадецил-MDP на клетки эритробластного лейкоза человека К-562 и стимуляцию ЕК-активности МНК ß-децил- и Ь-додецил-MDP.

3. Из исследуемой группы гликопептидов только Ь-додецил-MDP достоверно стимулировал пролиферативную активность МНК.

Список литературы

1. Земляков А.Е. Синтез гликозидных аналогов №ацетилмурамоил^-аланил-Б-изоглутамина / А.Е. Земляков, В.Я. Чирва // Химия природн. соедин. - 1987. - № 5. - С.714-718.

2. Земляков А.Е. Гликозиды N-ацетилмурамоил-Ь-аланил-Б-изоглутамина. Синтез и исследование влияния конфигурации гликозидной связи и природы агликона на биологическую активность / А.Е. Земляков, В.В. Цикалов, О.В. Калюжин [и др.] // Биоорган. химия. - 2003. - Т. 29, № 3. - С. 316-322.

3. Калюжин О.В. Иммуномодулирующая активность Р-гептилгликозид-мурамоилдипептида in vivo / О.В. Калюжин, Н.С. Захарова, М.В. Брицина [и др.] // Бюл. экспер. биол. - 1999. - № 11. - С. 553-554.

4. Калюжин О.В. Стимуляция неспецифической резистентности мышей Р-гептилгликозид-мурамоилдипептидом / О.В. Калюжин, В.В. Калюжин, А.Е. Земляков [и др.] // Бюл. экспер. биол.

- 1999. - № 5. - С. 543-545.

5. Калюжин О.В. Амфифильный дериват мурамилдипептида в терапии мышиной лимфомы EL-4 / О.В. Калюжин, М.В. Нелюбов, Ф.Н. Кузовлев [и др.] // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. - 2001.

- № 1. - С. 45-46.

6. Земляков А.Е. Синтез и биологическое действие липофильных Р-алкилгликозидов мурамоилдипептида / А.Е. Земляков, В.Н. Цикалова, В.В. Цикалов [и др.] // Журн. орг. фарм. хiмii.

- 2005. - Т. 3, вип. 3(11). - С. 52-57.

7. Медведев А.Э. Изучение иммуномодуляторной активности новых производных мурамоилдипептида in vitro / А.Э. Медведев, Б.Б. Фукс, Н.В. Бовин [и др.] // Бюлл. экспер. биол. -1992. - № 12. - С. 626-628.

8. Земляков А.Е. Синтез и протективное антиинфекционное действие аномеров липофильных гликозидов №ацетилмурамоил^-аланил-Б-изоглутамина / А.Е. Земляков, В.Н. Цикалова, В.В. Цикалов [и др.] // Биоорган. химия. - 2006. - Т. 32, № 4. - С. 424-431.

9. Земляков А. Е. ß-Диалкилметилгликозиды К-ацетилмурамоил-Ь-аланил^-изоглутамина: синтез, протективное антиинфекционное и цитотоксическое действие / А.Е. Земляков, В.Н. Цикалова, В.В. Цикалов [и др.] // Биоорган. химия. - 2008. - Т. 34, № 1. - С. 114-120.

References

1. Zemlyakov A. E. and Chirva V. Ya. Chem. Nat. Comp., 595 (1987).

2. Zemlyakov A. E., Tsikalov V. V., Kalyuzhin O. V., Kur'yanov V. O., and Chirva V. Ya. Rus. J. Bioorg. Chem., 29, 286 (2003).

3. Kalyuzhin O. V., Zaharova N. S., Britsina M. V., Zemlyakov A. E., and Kalyuzhin V. V. Byull. Eksp. Biol., 553 (1999).

4. Kalyuzhin O. V., Kalyuzhin V. V., Zemlyakov A. E., Elkina S. I., Shkalev M. V., and Sergeev V. V. Byull. Eksp. Biol, 543 (1999).

5. Kalyuzhin O. V., Nelyubov M. V., Kuzovlev F. N., Kalyuzhina M. I., Zemlyakov A. E., Shkalev M. V., Mulik E. L., and Karaulov A. V. Vopr. Biol. Med. Farm. Khim., 45 (2001).

6. Zemlyakov A. E., Tsikalova V. N., Tsikalov V. V., Chirva V. Ya., Maligina V. Yu., Katsev A. M., and Krivorutchenko Yu. Zh. Org. Farm. Khim., 3, 52 (2005).

7. Medvedev A. E., Fucks B. B., Bovin N. V., and Zemlyakov A. E. Byull. Eksp. Biol, 626 (1992).

8. Zemlyakov A. E., Tsikalova V. N., Tsikalov V. V., Chirva V. Ya., Mulik E. L., and Kalyuzhin O. V. Rus. J. Bioorg. Chem., 32, 382 (2006).

9. Zemlyakov A. E., Tsikalova V. N., Tsikalov V. V., Chirva V. Ya., Mulik E. L., Kuzovlev F. N., Kalyuzhin O. V., and Kiselevsky M. V. Rus. J. Bioorg. Chem., 34, 103 (2008).

Земляков O.G. 1муномодулюючи властивост глiкозидiв мурамошдипептиду з алiфатичними аглжонами С10-С14 / O.G. Земляков, В.М. Цикалова // Вчеш записки Тавршського нацюнального ушверситету iм. В.1. Вернадського. Сeрiя „Бюлопя, хiмiя". - 2013. - Т. 26 (65), № 2. - С. 216-221. Вивчено стимулящя ß-алкшгакозидами мурамошдипептиду антшнфекцшно! резистентност мишей до зараження Staphylococcus aureus i Escherichia coli. Дослщжено пряма цитотоксична дiя цих глiкопептидiв на кйтини еритробластного лейкозу людини К-562 i мононуклеарш кйтини кровi (МНК), а також !х вплив на продукщю МНК природних кiлерiв i пролiферативну актившсть Ключовi слова: мурамошдипептиди; глкозиди мурамошдипептиду, антшнфекцшна резистентшсть, цитотоксичшсть, пролiферацiя.

Zemlyakov A.E. The immunomodulatory properties of muramyl dipeptide glycosides with aliphatic aglycones С10-С14 / A.E. Zemlyakov, V.N. Tsikalova // Scientific Notes of Taurida V.Vernadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2013. - Vol. 26 (65), No. 2. - Р. 216-221.

Immunomodulatory activity of ß-decyl-, ß-dodecyl- and ß-tetradecylglycosides of muramyl dipeptide in a series of experiments in vitro and in vivo was studied. The structure of glycopeptides were confirmed by 'H NMR spectroscopy and COSY experiments.

The ability of muramyl dipeptide glycosides stimulate antibacterial resistance of mice by introperitonal introduction of lethal dose of Staphylococcus aureus and Escherichia coli was investigated. The maximum protective action provided ß-decyl- and ß-dodecylglycosides MDP in the dose of 40 mg/mouse (S. aureus) and ß-tetradecyl- MDP in a dose of 1 mg/mouse (E. coli).

Direct action of glycoside derivatives were studied on the human erythroleukemia cells and blood mononuclear cells (BMC). Significant cytotoxic effect on tumor cells was showed ß-tetradecyl-MDP at a concentration of 200 g/ml only.

Joint incubation of cells K-562, which are sensitive to natural killer (NC), and activated BMC were revealed the ability of the ß-decyl- and ß-dodecylglycosides MDP induce the spontaneous NK activity in BMC population. From the study group glycopeptides reliably stimulated the proliferative activity of BMC ß-dodecyl-MDP only. Keywords: muramyl dipeptides, glycosides of muramyl dipeptide, anti-infections resistance, cytotoxicity, proliferation.

Поступила в редакцию 16.05.2013 г.