CC BY
22
Экспериментальная биология и медицина УДК 616.001.17:616-008.9-097
ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ АГОНИСТОВ ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОЖОГОВОЙ ТРАВМЕ
© Николаев С.Б., Быстрова Н.А., Ляшев Ю.Д.
Кафедра хирургических болезней ФПО, кафедра биологической химии, кафедра патофизиологии Курского государственного медицинского университета
Изучены иммунометаболические эффекты опиоидных пептидов (ОП) при экспериментальной ожоговой травме (ЭОТ). Исследовались показатели гуморального и клеточного иммунитета, функционально-метаболическая активность нейтрофилов (ФМАН), оксидантный и антиоксидантный статус, активность воспалительных реакций (ВР) и течение репаративных процессов (РП) в коже. Установлено, что ЭОТ приводит к развитию выраженных иммунометаболических нарушений. Введение ОП корригирует (в зависимости от дозы) ФМАН, стимулирует развитие обеих форм иммунного ответа, приводит к достоверному снижению концентрации продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови, повышению активности ферментов антиоксидантной системы, а также снижает активность ВР и стимулирует РП в коже. Причем по иммуномодулирующей и антиоксидантной активности при ЭОТ DSLEТ превосходит DAGO и ди-норфин А (1-13).
Ключевые слова: экспериментальная ожоговая травма, вторичный иммунодефицит, опиоидные пептиды, иммунометаболические эффекты, репаративные процессы.
THE IMMUNOMETABOLIC EFFECTS OF THE OPIOID RECEPTOR AGONISTS IN CASE OF THE EXPERIMETAL BURN INJURY Nikolaev S.B., Bystrova N.A., Lyashev Yu.D.
Surgery Department of Postgraduate Faculty, Biochemistry Department, Pathophysiology Department
of the Kursk State Medical University
The immunometabolic effects of the opioid peptides (OP) have been studied in case of the experimental burn injury (EBI). Humoral and cellular immune response indices, functional and metabolic activity of neutrophils (FMAN), oxidant and antioxidant status, the reparative processes (RP) and the skin inflammatory reactions (IR) have been investigated. It has been established that the EBI results in development of the marked immunometabolic disturbances. OP introduction corrects (depending on the dose) FMAN, stimulates the development of both immune response forms, results in the decrease in lipid peroxide oxidation product concentrations in the blood serum, raises the activity of antioxidant protection enzymes, and also decrease the activity of IR and stimulates RP in the skin. In case of the EBI, DSLET is more potent immunomodulator and antioxidant than DAGO and dynorphine A (1-13).
Key words: experimental burn injury, secondary immune deficiency, opioid peptides, immunometabolic effects, reparative processes.
Ожоговые поражения представляют собой вид травматической патологии, которая характеризуется сложными комплексами полисистемных сдвигов, охватывающих весь организм пораженного. Течение обширных термических поражений сопровождается дестабилизацией иммунного статуса с развитием вторичного иммунодефицита. Нарушение нормального течения окислительных процессов, лежащих в основе метаболизма всех клеток и определяющих адаптивную состоятельность организма к действию повреждающих факторов, приводит к формированию оксида-тивного стресса [3, 19, 25].
Широко известны факты о наличии тесной взаимосвязи между нейроэндокринной и иммунной системами. Наличие иммуномоду-лирующих свойств у нейропептидов существенно дополняет представления о механизмах передачи сигналов от нервной системы к иммунной [4, 20]. На иммунокомпетентных клетках обнаружены рецепторы ко многим известным нейропептидам. Являясь ведущим компонентом антистрессорной системы организма, опиоиды не только подавляют продукцию стрессорных гормонов (АКТГ, кор-тизола, катехоламинов), но и проявляют им-муномодуляторные свойства [5, 22, 24].
Вместе с тем не до конца выяснены механизмы влияния нейропептидов на состояние иммунной системы организма, репарацию и антиоксидантные свойства в норме и в условиях воздействия неблагоприятных факторов внешней среды.
В этой связи вызывает большой интерес перспектива использования природных и синтетических опиоидных пептидов, которые обладают уникальной совокупностью физиологических свойств [26] в качестве иммуно-модуляторов при различных иммунодефи-цитных состояниях, в том числе и при ожоговой травме.
Поэтому целью работы явилось установление иммуномодулирующей и антиокси-дантной активности различных классов опиоидных пептидов (DSLET, DAGO и ди-норфина А (1-13)) при термических ожогах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования выполнены на крысах Wistar обоего пола массой 180-220 г и мышах CBA обоего пола массой 18-20 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на стандартном пищевом режиме. Все исследования проводили с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (г. Страсбург, Франция, 1986). Животных выводили из опыта декапи-тацией под эфирным наркозом: контрольных с экспериментальной ожоговой травмой (ЭОТ) для получения сыворотки крови, эритроцитов и нейтрофилов периферической крови - на 1, 2, 6 и 12-е сутки после нанесения ожоговой травмы; для получения подколенных лимфатических узлов и ткани селезенки (при исследовании гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)) - на 6, 7, 11 и 17-е сутки после ЭОТ (через пять суток после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ)); животных с ЭОТ, получавших опиоидные пеп-
тиды, - на шестые сутки после моделирования ожога.
Термическую травму моделировали путем нанесения экспериментальным животным под эфирным наркозом ожога ШБ степени, охватывающего около 25-30% поверхности тела. Травму наносили на деэпилированную кожу спины с помощью электроприбора, поддерживающего температуру на уровне 100°С, при экспозиции 8 секунд для крыс и 4 секунды для мышей [12]. Непосредственная смертность после данной процедуры отсутствовала. В каждой экспериментальной группе получали гистологическое подтверждение соответствия глубины ожога ШБ степени.
В работе использованы синтетические препараты агонистов отдельных классов опиоидных рецепторов: DSLET (Тир-Д-Сер-Гли-Фен-Лей-Трп) - селективный агонист дельта-опиоидных рецепторов; DAGO (Тир-Д-Ала-Гли-Ы-Метил-Фен-Гли-ол) - селективный агонист мю-опиоидных рецепторов; динорфин А (1-13) (Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-Арг-Илей-Арг-Про-Лиз-Лей-Лиз) - селективный агонист каппа-рецепторов. Изучаемые пептиды применяли в эквимолярных дозах в следующем диапазоне: DAGO - 0,63; 6,3; 63 мкг на 1 кг массы тела, DSLET - 1; 10; 100 мкг на кг массы тела, динорфин А (1-13) - 2,02; 20,2; 202 мкг на 1 кг массы тела. Пептиды были синтезированы в лаборатории синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН.
Исследуемые опиоидные пептиды растворяли в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия и вводили пятикратно с интервалом в 24 часа внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл - мышам; 0,2 мл - крысам. Первую инъекцию производили непосредственно после нанесения ЭОТ.
Мышей иммунизировали однократным внутрибрюшинным введением ЭБ на 1, 2, 6 и 12-е сутки после ЭОТ. О выраженности ГИО судили по количеству антителообразующих клеток (АОК) [8] в селезенке через пять суток после иммунизации ЭБ.
ГЗТ у крыс индуцировали ЭБ. О выраженности ГЗТ судили по разнице массы регионарного и контралатерального лимфатических узлов (РМЛ) [16].
Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по индексу активности фагоцитоза (ИАФ) [10,17]. Кислородзависимая активность нейтрофилов оценивалась в тесте спонтанного и стимулированного зимозаном восстановления нитросинего тетразолия: вычисляли индекс стимуляции нейтрофилов (ИСН) и функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) [18].
Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) у крыс оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) ненасыщенных жирных кислот и малонового диаль-дегида (МДА) в сыворотке крови [14, 15]. Антиоксидантный статус оценивали по активности в эритроцитах каталазы [13] и общей антиокислительной активности сыворотки крови (АОА) [6].
Для оценки активности воспалительно-репаративных процессов в ожоговой ране мышам с термической травмой ШБ степени площадью около 25-30% общей поверхности тела дополнительно на 1, 2, 6 и 12-е сутки наносили по две стандартные ожоговые раны (СОР) на кожную складку с помощью специального электрода площадью 0,3 см2, нагреваемого электрической спиралью до 2000C. Для объективной количественной оценки скорости заживления ожоговой раны были использованы следующие критерии: время отторжения ожогового струпа - для характеристики активности воспалительных реакций; время эпителизации СОР - для интегральной оценки выраженности репаративно-пластических процессов [1].
Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средней арифметической (M) и ошибки средней (m). Гипотеза о нормальности распределения изучаемых признаков внутри группы проверялась с использованием критериев Шапиро-Уилка, Колмогорова-Смирнова. Достоверность статистических различий оценивалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа - ANOVA, критерия Ньюмена-Кейлса в программном комплексе "БИОСТАТИСТИКА для Windows".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении иммунометаболических нарушений, вызываемых ЭОТ, установлено, что у животных после нанесения термического
ожога показатели ГИО резко снижались по сравнению с аналогичными показателями ин-тактных животных. Наиболее выраженные изменения наблюдались в начальный период ожоговой травмы (первые шесть дней после ожога). Количество АОК в селезенке уже на первые сутки после ЭОТ уменьшалось в 4,5 раза (р<0,05) и достигало своего абсолютного минимума. На двенадцатые сутки после ЭОТ количество АОК в селезенке все еще было статистически достоверно ниже, чем у здоровых мышей.
ЭОТ приводила к значительному снижению показателей ГЗТ по сравнению с группой интактных животных. Уже на первые сутки после ЭОТ наблюдалась максимальная супрессия клеточного иммунитета: показатель РМЛ уменьшался в 2,5 раза (р<0,05). К двенадцатым суткам после экспериментальной ожоговой травмы величина РМЛ все еще оставалась достоверно ниже, чем у интакт-ных животных.
Установлено, что у обожженных животных развивалось выраженное и продолжительное нарушение ФМА полиморфноядер-ных лейкоцитов (ПЯЛ) периферической крови, выражавшееся в резкой активации кисло-родзависимых бактерицидных механизмов, при одновременном снижении числа фагоцитирующих клеток и среднего количества, поглощенных одним фагоцитом частиц. Максимальный дефицит фагоцитарной функции ПЯЛ наблюдался на шестые сутки после ЭОТ и совпадал с максимальной активацией в них кислородного метаболизма. К двенадцатым суткам после ЭОТ изучаемые показатели все еще достоверно отличались от показателей интактных животных. Выявленные изменения отражали эффект тотальной активации ПЯЛ после ожога, которая приводила к их деактивации и неспособности ответить респираторным взрывом на дополнительную стимуляцию антигеном.
В сыворотке крови содержание МДА и ДК уже на первые сутки после ЭОТ увеличивалось в 1,9 и 1,7 раза соответственно (р<0,05). Поскольку активность процессов ПОЛ в значительной степени зависит от активности ферментов системы антиоксидант-ной защиты, то следует отметить, что АОА уже на вторые сутки после экспериментальной ожоговой травмы компенсаторно увели-
чивалась в 1,2 раза (р<0,05). Однако на шестые сутки после ЭОТ активность процессов ПОЛ в сыворотке крови достигала максимума (МДА - 249% и ДК - 207% от уровня интакт-ных животных). Столь резкая активизация ПОЛ была связана с отсутствием адекватной ферментативной защиты в этот период: АОА на шестые сутки после ЭОТ снижалась в 2,1 раза (р<0,05). К двенадцатым суткам происходило повышение АОА, поэтому интенсивность ПОЛ снижалась, но не достигала уровня интактных животных.
Обширный и глубокий ожог приводил к значительной активизации воспалительных реакций и торможению репаративно-пластических процессов в коже. Эти нарушения были наиболее выраженными в первые дни после травмы. Время отторжения ожогового струпа СОР при нанесении ее на первые и вторые сутки после ЭОТ увеличивалось в 1,25 раза, а время эпителизации СОР - в 1,3 раза (p<0,05). На шестые сутки происходило частичное восстановление репаративного потенциала кожи мышей после ЭОТ. Однако полностью он восстанавливался лишь только к концу второй недели.
При исследовании иммунометаболиче-ских эффектов DSLET в условиях ЭОТ установлено, что в дозах 100 и 10 мкг/кг массы тела этот опиоидный пептид нормализовал развитие ГИО и ГЗТ, о чем свидетельствовало увеличение количества АОК, величины РМЛ до уровня интактных животных. DSLET в дозе 1 мкг/кг статистически достоверно корригировал данные показатели. Причем эффекты DSLET на развитие ГИО и ГЗТ в условиях ЭОТ так же, как и у интактных животных, зависели от дозы пептида: наибольшая доза вызывала более выраженную стимуляцию иммунологической реактивности (табл. 1).
В условиях экспериментальной ожоговой травмы DSLET в дозе 100 мкг/кг нормализовал все исследуемые показатели ФМА ней-трофилов; в дозе 10 мкг/кг достоверно кори-гировал их до уровня, определяемого на 1-2-е сутки после ЭОТ, а в дозе 1 мкг/кг увеличивал ИАФ в 1,8 раза, а также повышал ФРН и ИСН в 1,4 и 1,2 раза (p<0,05) (табл. 1).
В условиях экспериментальной ожоговой травмы DSLET в дозе 100 мкг/кг статистически достоверно повышал активность каталазы эритроцитов, АОА до 120 и 128% соответственно от уровня, определяемого у интактных животных, снижал до нормальных значений концентрацию МДА и ДК в сыворотке крови. В дозе 10 мкг/кг у животных с экспериментальной ожоговой травмой DSLET нормализовал активность антиоксидантных ферментов, при этом концентрация МДА и ДК в сыворотке крови снижалась до уровня интакт-ных животных. DSLET в дозе 1 мкг/кг не нормализовал, однако статистически достоверно повышал активность каталазы эритроцитов и АОА до 75 и 71% соответственно от уровня, определяемого у интактных животных. Концентрация МДА и ДК в сыворотке крови на фоне введения минимальной дозы DSLET у животных с ЭОТ достоверно снижалась. Таким образом, DSLET в дозах 100 и 10 мкг/кг эффективно корригировал нарушения оксидантного и антиоксидантного статуса, возникавшие у животных с ЭОТ (табл. 1).
При исследовании влияния опиоидного пептида DSLET на активность воспалитель-но-репаративных процессов в коже установлено, что в дозах 100, 10 мкг/кг он в 1,3 и 1,2 раза соответственно (р<0,05) ускорял отторжение ожогового струпа и эпителизацию СОР, восстанавливая репаративно-пластичес-кий потенциал кожи и снижая активность воспалительных реакций до уровня показателей интактных животных с СОР. DSLET в дозе 1 мкг/кг статистически достоверно уменьшал время отторжения ожогового струпа и эпителизации СОР в 1,1 раза.
При изучении иммунометаболических эффектов DAGO при ЭОТ установлено, что в дозе 63 мкг/кг массы тела этот опиоидный пептид нормализовал иммунологическую реактивность, о чем свидетельствовало увеличение количества АОК, величины РМЛ до уровня, определяемого у здоровых животных. В дозе 6,3 мкг/кг DAGO только лишь усиливал развитие иммунного ответа на ЭБ. В минимальной дозе DAGO не влиял на развитие ГИО и ГЗТ при ЭОТ (табл. 2).
Примечание: здесь и в последующих таблицах - АОК - 103/селезенку; РМЛ - мг; МДА - мкмоль/л; ДК - ДD2зз/1 мл; АОА - активность в относительных единицах; каталаза - ЕД на мл эритроцитов; ИАФ, ИСН, ФРН - индексы, выраженные в относительных единицах.
* - достоверность различий средних арифметических величин, р<0,05. Цифры рядом со звездочкой обозначают, по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны.
Таблица 1
Иммунометаболические эффекты DSLET при экспериментальной ожоговой травме
№ п/п Показатель Интакт- ные животные ЭОТ (6 сутки) Введение DSLET (100 мкг/кг) в условиях ЭОТ Введение DSLET (10 мкг/кг) в условиях ЭОТ Введение DSLET (1 мкг/кг) в условиях ЭОТ
Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5
1. АОК 13,5±0,6 3,0±0,3*1,3-5 16,0±0,7*UA5 12,7±0,5*2,3,5 8,1±0,4*1-4
2. РМЛ 4,32±0,32 1,73±0,21*1,3-5 5,34±0,36*1,2,4,5 4,09±0,26*2,3,5 3,14±0,23*1-4
3. ИАФ 71,5±7,2 13,5±1,6*13-5 83,8±7,4*2,4,5 41,8±4,9*1-3,5 24,5±2,5*1-4
4. ИСН 3,28±0,09 1,18±0,01*1,3-5 3,45±0,09*2,4,5 1,62±0,04*1-3,5 1,36±0,03*1-4
5. ФРН 25,4±1,2 11,6±0,7*1,3-5 25,1±1,2*2,4,5 20,2±1,0*1-3,5 16,2±0,8*1-4
6. МДА 11,7±1,0 29,2±1,7*1,3-5 10,8±0,9*245 14,6±1,2*2,3,5 21,3±1,4*1-4
7. ДК 1,88±0,13 3,94±0,26*1,3-5 1,76±0,11*2,4,5 2,15±0,14*2,3,5 2,87±0,19*1-4
8. АОА 0,65±0,05 0,31±0,03*1,3-5 0,83±0,07*1,2,5 0,67±0,06*2,5 0,46±0,05*1-4
9. Каталаза 13,0±0,8 7,6±0,6*1,3-5 15,7±0,9*UA5 12,8±0,8*2,35 9,8±0,7*1-4
У животных с экспериментальной ожоговой травмой DAGO в дозе 63 мкг/кг нормализовал все показатели ФМА нейтрофилов, за исключением ИСН. В дозе 6,3 мкг/кг повышал ИАФ в 1,9 раза, а также увеличивал ФРН и ИСН в 1,4 и 1,1 раза (p<0,05). В дозе 0,63 мкг/кг DAGO не влиял на показатели ФМА нейтрофилов у животных с ЭОТ (табл. 2).
Исследование влияния опиоидного пептида DAGO на оксидантный и антиоксидант-ный статус у животных с ЭОТ выявило следующие закономерности. В условиях экспериментальной ожоговой травмы DAGO в дозе 63 мкг/кг нормализовал активность антиок-сидантных ферментов, при этом концентрация продуктов ПОЛ снижалась и достигала уровня показателей интактных животных. DAGO в дозе 6,3 мкг/кг статистически достоверно повышал активность каталазы эритроцитов, АОА до 73 и 65% соответственно от уровня, определяемого у интактных животных. Концентрация продуктов ПОЛ на фоне введения средней дозы DAGO достоверно снижалась, однако полной нормализации не
наблюдалось. Опиоидный пептид DAGO в минимальной дозе не влиял на процессы ПОЛ и систему антиоксидантной защиты у животных в условиях ЭОТ. Таким образом, DAGO лишь в дозе 63 мкг/кг эффективно корригировал нарушения оксидантного и ан-тиоксидантного статуса, возникавшие у животных с ЭОТ (табл. 2).
При исследовании влияния опиоидного пептида DAGO на активность воспалительно-репаративных процессов в коже выявлено, что в дозе 63 мкг/кг он в 1,2 раза (р<0,05) ускорял отторжение ожогового струпа и эпите-лизацию СОР, восстанавливая репаративно-пластический потенциал кожи и снижая активность воспалительных реакций до уровня показателей интактных животных с СОР. В дозе 6,3 мкг/кг DAGO достоверно уменьшал время отторжения ожогового струпа и ускорял эпителизацию СОР в 1,1 раза (р<0,05), однако не нормализуя эти показатели, а в дозе 0,63 мкг/кг не влиял на течение воспали-тельно-репаративных процессов в коже на
Таблица 2
Иммунометаболические эффекты DAGO при экспериментальной ожоговой травме
№ п/п Показатель Интакт- ные животные ЭОТ (6 сутки) Введение DAGO (63 мкг/кг) в условиях ЭОТ Введение DAGO (6,3 мкг/кг) в условиях ЭОТ Введение DAGO (0,63 мкг/кг) в условиях ЭОТ
Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5
1. АОК 13,5±0,6 3,0±0,3*1,3,4 12,9±0,5*2'4'5 8,6±0,4*1-3'5 3,6±0,3*1'3'4
2. РМЛ 4,32±0,32 1,73±0,21*1,3,4 4,19±0,25*2'4'5 3,26±0,24*1-3'5 1,92±0,19*13'4
3. ИАФ 71,5±7,2 13,5±1,6*1,3,4 60,7±5,8*2'4'5 25,9±2,7*1-3'5 14,8±1,8*1,3,4
4. ИСН 3,28±0,09 1,18±0,01*134 2,49±0,06*1,2'4'5 1,34±0,02*1-3'5 1,19±0,01*1,3,4
5. ФРН 25,4±1,2 11,6±0,7*1,3,4 24,7±1,1*2'4'5 15,6±0,7*1-3'5 12,3±0,5*1'3'4
6. МДА 11,7± 1,0 29,2±1,7*1,3,4 13,9±1,1*2'4'5 21,8±1,6*1-3'5 28,3±1,8*1,3,4
7. ДК 1,88±0,13 3,94±0,26*1,3,4 2,25±0,15*2'4'5 3,16±0,22*1-3'5 4,03±0,29*1,3,4
8. АОА 0,65±0,05 0,31±0,03*1,3,4 0,63±0,05*2'4'5 0,42±0,04*1-3'5 0,30±0,03*1,3,4
9. Каталаза 13,0±0,8 7,6±0,6*1А4 13,2±0,7*2'4'5 9,5±0,6*1-3'5 7,4±0,05*1,3,4
фоне ЭОТ.
При исследовании иммунометаболиче-ских эффектов динорфина А (1-13) в условиях ЭОТ установлено, что этот опиоидный пептид в дозе 20,2 мкг/кг массы тела нормализовал развитие ГИО и ГЗТ, о чем свидетельствовало достоверное увеличение количества АОК и величины РМЛ до уровня ин-тактных животных. В дозах 202 и 2,02 мкг/кг динорфин А (1-13) не влиял на иммунологическую реактивность обожженных животных (табл. 3).
У животных с ЭОТ введение динорфина А (1-13) в дозе 202 мкг/кг не влияло на ИСН, ФРН, ИАФ; в дозе 20,2 мкг/кг доводило все показатели ФМА нейтрофилов до уровня, определяемого на 1-2-е сутки после ЭОТ. В дозе 2,02 мкг/кг динорфин А (1-13) не влиял на показатели ФМА нейтрофилов у животных с ЭОТ (табл. 3).
Изучение влияния опиоидного пептида динорфина А (1-13) на оксидантный и анти-оксидантный статус у животных в условиях ЭОТ выявило следующие закономерности. У животных с экспериментальной ожоговой травмой динорфин А (1-13) в дозе 202 мкг/кг статистически достоверно повышал актив-
ность каталазы эритроцитов и АОА до 75 и 62% соответственно от уровня, определяемого у интактных животных. Концентрация МДА и ДК в сыворотке крови на фоне введения динорфина А (1-13) в максимальной дозе у животных с ЭОТ достоверно снижалась. В дозе 20,2 мкг/кг динорфин А (1-13) нормализовал активность каталазы эритроцитов, статистически достоверно увеличивал АОА до 78% от уровня, определяемого у интактных крыс, и снижал интенсивность ПОЛ. Динор-фин А (1-13) в минимальной дозе не влиял на интенсивность процессов ПОЛ и систему ан-тиоксидантной защиты у животных в условиях ЭОТ. Таким образом, динорфин А (1-13) только лишь в дозе 20,2 мкг/кг значимо корригировал нарушения оксидантного и анти-оксидантного статуса, возникавшие у животных с ЭОТ (табл. 3).
При исследовании влияния динорфина А (1-13) на активность воспалительно-репаративных процессов в коже выявлено, что в дозе 20,2 мкг/кг этот опиоидный пептид статистически достоверно уменьшал время отторжения ожогового струпа и ускорял эпи-телизацию СОР в 1,2 раза, однако не нормализовал эти показатели, а в дозах 202 и 2,02
Таблица 3
Иммунометаболические эффекты динорфина А (1-13) при экспериментальной ожоговой травме
№ п/п Показатель Интакт- ные животные ЭОТ (6 сутки) Введение динорфина А (1-13) (202 мкг/кг) Введение динорфина А(1-13) (20,2 мкг/кг) Введение динорфина А(1-13) (2,02 мкг/кг)
в условиях ЭОТ в условиях ЭОТ в условиях ЭОТ
Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5
1. АОК 13,5±0,6 3,0±0,3*1,4 3,2±0,3*1,4 12,6±0,5*2,3,5 3,3±0,4*1,4
2. РМЛ 4,32±0,32 1,73±0,21*1,4 1,83±0,20*1,4 4,22±0,28*2,3,5 1,69±0,19*1,4
3. ИАФ 71,5±7,2 13,5±1,6*14 16,8±1,9*14 40,4±4,7*1-3,5 14,9±1,7*1,4
4. ИСН 3,28±0,09 1,18±0,01*1,4 1,20±0,01*1,4 1,54±0,03*1-35 1,18±0,01*1,4
5. ФРН 25,4±1,2 11,6±0,7*м 11,7±0,5*м 18,9±0,9*1-3,5 11,9±0,7*1,4
6. МДА 11,7±1,0 29,2±1,7*1,3,4 24,5±1,5*1А4 16,8±1,3*1-35 27,9±1,6*1,4
7. ДК 1,88±0,13 3,94±0,26*1,3,4 3,24±0,21*1,2,4 2,31±0,15*1-3,5 3,83±0,24*1,4
8. АОА 0,65±0,05 0,31±0,03*1,3,4 0,40±0,03*1,2,4, 0,51±0,04*1-3,5 0,28±0,03*1,3,4
9. Каталаза 13,0±0,8 7,6±0,6*1А4 9,7±0,б*1,2,4,5 11,9±0,7*2,3,5 7,8±0,5*1А4
мкг/кг не влиял на активность воспалительных реакций и течение репаративно-пластических процессов в коже на фоне ЭОТ.
Таким образом, развитие иммуносупрес-сии при ожоговой травме - сложный, комплексный процесс, связанный с реализацией целой совокупности факторов. При ожоге нарушается реализация как специфических, так и неспецифических механизмов иммунной защиты, наблюдается активация ПОЛ, изменяется цитокиновый профиль [25].
Регуляторные пептиды, в том числе и опиоидные, оказывают модулирующее влияние на функциональную активность органов и систем. Это подтверждается зависимостью эффекта пептидов от функционального состояния организма, используемой дозы, кратности и способа введения [20, 26].
В наших экспериментах иммунометабо-лические эффекты опиоидных пептидов у животных с ЭОТ проявлялись уменьшением супрессии гуморального и клеточного иммунного ответа, предупреждением угнетения ФМА, антиоксидантным действием. Реализация этих эффектов связана как с прямым влиянием опиоидных пептидов на иммуно-компетентные клетки через специфические рецепторы, так и с изменением активности
регуляторных систем [20, 21, 23]. Являясь ведущим компонентом стресс-лимитирующей системы организма, опиоидные пептиды предупреждают избыточную активацию гипота-ламо-гипофизарно-адреналовой системы [7], а супрессирующее действие высоких доз глюкокортикостероидов на иммунный ответ широко известно [11]. Синтетические опиои-ды в использованных нами дозах не проникают через неповрежденный гематоэнцефа-лический барьер, что, однако, не исключает их центрального механизма действия в условиях ожоговой травмы, когда происходит нарушение структуры и целостности биологических мембран.
Эндогенные опиоиды подвергаются быстрому энзиматическому гидролизу, однако время полужизни комплекса пептид-рецептор составляет около одного часа. Использованные в работе пептиды имеют в своей структуре изменения, которые повышают их устойчивость к действию эндопептидаз, а следовательно, и продолжительность присутствия в организме. Это особенно важно в условиях ожоговой травмы. Кроме того, связывание с рецептором запускает каскадное образование и выделение других пептидных и белковых регуляторов, образующих регуля-
торный континуум, способных корригировать иммунометаболические нарушения при ожоговой травме [2].
Выявленное антиоксидантное действие опиоидных пептидов в условиях ЭОТ обусловлено повышением активности каталазы и общей антиокислительной активности сыворотки крови в условиях оксидативного стресса, что обеспечивает снижение количества свободных радикалов и продуктов ПОЛ, а также угнетением синтеза некоторых про-стагландинов. По литературным данным, ан-тиоксидантный эффект опиоидов носит ре-цепторную природу, так как полностью отменяется их селективными антагонистами. Однако все еще остается открытым вопрос о возможных механизмах опиатергической регуляции активности ферментов системы ан-тиоксидантной защиты [9].
Таким образом, результаты проведенных экспериментов позволяют предположить, что реализация иммуномодулирующих эффектов опиоидных пептидов при ожоговой травме связана с функциональной перестройкой в системе лимфоцит-макрофаг-нейтрофил. Подобное действие опиоидных пептидов объясняется их модулирующим влиянием на гипо-таламо-гипофизарно-надпочечниковую систему, развитием анальгезии, а также прямым действием на клетки-мишени через специфические рецепторы, локализованные на клеточных мембранах. Перестройка ведущих ре-гуляторных систем: нейроэндокринной и иммунной, при использовании опиоидных пептидов, а также их местные эффекты, в том числе и уменьшение активности ПОЛ в очаге повреждения, вызывают закономерные изменения пролиферативной способности клеток, ускорение их дифференцировки, что и определяет развитие более быстрой эпителизации ожоговой раны.
На основании вышеизложенного можно сделать следующие выводы.
1. Селективные агонисты опиоидных дельта-, мю- и каппа-рецепторов DSLET, DAGO и динорфин А (1-13) оказывают корригирующее действие на развитие гуморального иммунного ответа, гиперчувствительности замедленного типа и отменяют угнетение функционально-метаболической активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови у животных с эксперименталь-
ной ожоговой травмой.
2. У животных с экспериментальной ожоговой травмой, получавших DSLET, DAGO и динорфин А (1-13), отмечается повышение активности ферментов антиоксидантной защиты и снижение интенсивности перекисно-го окисления липидов.
3. Опиоидные пептиды DSLET, DAGO и динорфин А (1-13) ускоряют течение репара-тивно-пластических процессов и снижают активность воспалительных реакций в стандартной ожоговой ране в условиях экспериментальной ожоговой травмы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахкямов Э.М., Долгушин И.И., Зурочка А.В., Чукичев А.В. Влияние А5-пептида, выделенного из нейтрофилов, на иммунную и воспа-лительно-репаративную реактивность обожженных мышей // Иммунология - 1999. -№ 5. - С. 27-30.
2. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. Новые роли высокостабильных олигопептидов, нейротро-финов и иммуномодуляторов в регуляторном континууме // Успехи физиол. наук. - 2003. -Т. 34, № 1. - С. 14-19.
3. Долгушин И.И., Эберт Л.Я., Лившиц Р.И. Иммунология травмы - Свердловск, 1989. -287 с.
4. Дубинин К.В., Захарова Л.А. Факторы, опосредующие иммуномодулирующий эффект мет-энкефалина: влияние дозы митогена, стадии клеточной активации, времени внесения опиоида // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1995. - Т. 119, № 4. - С. 398-401.
5. Зозуля А.А. Значение регуляторных пептидов в функционировании иммунной системы / А.А. Зозуля, Э.К. Пацакова // Иммунология. -
1986. - № 2. - С. 10-14.
6. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю. О. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липо-протеидов // Лаб. дело. - 1988. - № 5. -С. 59-62.
7. Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., Лазукова Т.В. Роль опиоидной системы в адаптации организма и защите сердца при стрессе // Успехи физиол. наук. - 1997. - Т. 28, № 1. - С. 75-96.
8. Мальберг К., Зигль Э. Метод локального гемолиза // Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля: Пер. с нем. - М.: Медицина,
1987. - С. 57-72.
9. Маслов Л.Н., Реброва Т.Ю. Сравнительный анализ кардиопротекторной активности анти-оксиданта дибунола и агонистов мю- и дель-
та-опиоидных рецепторов при окислительном стрессе // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2000. - Т. 63, № 3. - С. 24-28.
10. Медведев А.Н., Чаленко В.В. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. - 1991. - № 2. - С. 19-20.
11. Меерсон Ф.З., Пшеничникова М.Г. Стресс-лимитирующие системы организма и новые принципы профилактической кардиологии. -М.: Медицина, 1989. - 245 с.
12. Минухин В.В., Шахрай В.Г. Устройство для нанесения дозированного ожога мелким животным // Деп. во ВНИИМИ. - 1985. - № Д -9976.
13. Подильчак М.А. Клиническая энзимология -Киев, 1967. - 290 с.
14. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 63-64.
15. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. -М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
16. Федосеева В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В. и др. Руководство по иммунологическим и аллергологическим методам в гигиенических исследованиях. - М., 1993. - 319 с.
17. Фримель Г., Брок И. Основы иммунологии: Пер. с нем. - 5-е изд. - М.: Мир, 1986. - 254 с.
18. Щербаков В.И. Применение НСТ-теста для оценки чувствительности нейтрофилов к сти-
муляторам // Лаб. дело. - 1989. - № 1. -С. 30-33.
19. Gurbuz V., Corak A., Yegen B.C. et al. Oxidative organ damage in rat model of thermal injury: the effect of cyclosporin A // Burns. - 1997. -Vol. 23, № 1. - P. 37-42.
20. Marotti T., Batinic D. Enkephalins regulate in vitro antibody response of human lymphocytes // Period. Biol. - 1990. - Vol. 91, № 2. -P. 197-202.
21. Nelson C.J., Schneider G.M., Lysle D.T. Involvement of central mu- but not delta- or kappa-opioid receptors in immunomodulation // Brain. Behav. Immun. - 2000. - Vol. 14, № 3. -P. 170-184.
22. Sacerdote P., di San Secondo V.E., Sirchia G. et al. Endogenous opioids modulate allograft rejection time in mice: possible relation with Th1/Th2 cytokines // Clin. Exp. Immunol. - 1998. -Vol. 113, № 3. - P. 465-469.
23. Sibinga N.E., Goldstein A. Opioid peptides and opioid receptors in cells of the immune system // Ann. Rev. Immunol. - 1988. - Vol. 6. -P. 219-249.
24. Singh V.K., Narayan P., Yadav V.S. et al. Delta-opioid receptor antagonist inhibits immunomodulation by Met-enkephalin analogs // Neuroimmu-nomodulation. - 1999. - Vol. 6, № 5. -P. 355-360.
25. Sparkes B.G. Mechanisms of immune failure in burn injury // Vaccine. - 1993. - P. 504 - 510.
26. Vaccarino A.L., Olson G.A., Olson R.D., Kastin A.J. Endogenous opiates: 1998 // Peptides. -1999. - Vol. 20, № 12. - P. 1527-1574.
