CC BY
71
УДК 582.912.46:547.965
ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСОВ ШРОТА ПОЛЫНИ ГОРЬКОЙ (ABTEMISIAABSINTHIOML) ПРИ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
Курский государственный медицинский университет
Д.П. СЕВЕРИН U.E. СИПЛИВАЯ В.Я.ЯЦЮК
e-mail: [email protected]
В статье изложены результаты исследования иммунометабо-лической эффективности липофильного и гидрофильного комплексов, выделенных из шрота Польши горькой после получения настойки, при стафилококковой инфекции. Установлено, что комплексы, выделенные из шрота Польши горькой, проявляют выраженную анальгетическую, противовоспалительную и антимикробную активность. Липофильный и гидрофильный комплексы в условиях стафилококковой инфекции оказывают антиоксидантное и иммуностимулирующее действие.
Ключевые слова: шрот Польши горькой, стафилококковая инфекция, иммунометаболическая эффективность.
Введение. В настоящее время отмечается рост инфекционных заболеваний, возбудителями которых являются стафилококки: воспалительные заболевания легких, почек, печени и многие другие [15]. Инфекционные патологии сопровождаются чрезмерной активацией окислительных процессов, что приводит к срыву антиоксидантной защиты, нарушению структуры клеточных мембран, выходу в кровяное русло продуктов повышенного метаболизма клеток, приводящих к развитию метаболической иммуносупрессии [7, 9, 16]. Указанные нарушения могут быть одной из причин изменения чувствительности клеток к лекарственным препаратам.
При инфекционной патологии, и в частности при стафилококковой инфекции, широко используются антибиотики различных групп, которые наряду с мощным бактерицидным действием вызывают усугубление иммунометаболических нарушений, что диктует необходимость дополнительной коррекции. В последнее время в комплексное лечение все большего количества заболеваний входят средства растительного происхождения, характеризующиеся низкой токсичностью, широким спектром фармакологической активности, минимальным количеством побочных реакций при длительном применении. Особенный интерес представляет, наряду с внедрением в офи-цинальную медицину новых растений, ресурсосберегающее использование отходов промышленной переработки разрешенного к применению растительного сырья. К числу таких объектов относится полынь горькая, которая в официнальной медицине используется в виде настойки как желчегонное и средство для возбуждения аппетита.
Целью работы было исследование иммунометаболической эффективности комплексов биологически активных веществ, выделенных из шрота полыни горькой, при введении стафилококка.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования служили липофильный комплекс, представляющий собой смесь каротиноидов, терпеноидов, хлорофилла, жирных кислот и других органических веществ (комплекс А), и полисахаридный комплекс (комплекс В), полученные из шрота полыни горькой.
Опыт проводили на крысах Вистар массой 150-200 г и мышах СВА массой 19-21 г. Модель генерализованной стафилококковой инфекции воспроизводили путем заражения животных суточной агаровой культурой Staphylococcus aureus, приготовленной на 0,9% растворе натрия хлорида. Животных инфицировали внутрибрюшинной инъекцией предварительно оттитрованных доз стафилококка, содержащих lxio8 или 2хiо9 микробных тел (летальная доза) в объеме од или 0,5 мл. Наблюдение за инфицированными летальной дозой мышами проводили в течение ю дней с момента инфицирования. На протяжении этого периода определяли выживаемость мышей в процентах по отношению к контролю. Для исследования биологической активности комплекс А растворяли в оливковом масле, а комплекс В в воде. Комплексы А и В вводили внутрибрюшинно, однократно, растворенные в 0,5 или од мл растворителя.
Исследовали различные виды фармакологической активности. Предварительно определяли острую токсичность на здоровых животных по методике [14]. С этой целью мышам внутрибрюшинно вводили комплекс А в дозах от 3 мг/кг до 15 мг/кг или комплекс В в дозах от 50 мг/кг до 250 мг/кг в од мл соответствующего растворителя. Наблюдение за животными проводили в течение 24 часов. Исследование анальгетической активности комплексов А и В проводили на мышах с
использованием методики «уксусных корчей» и модели формалиновой болевой реакции [2, 13]. «Уксусные корчи» вызывали внутрибрюшинным введением 3% уксусной кислоты в дозе 300 мг/кг. В течение 20 минут после инъекции уксусной кислоты учитывали количество судорожных сокращений брюшных мышц. Формалиновую болевую реакцию вызывали введением мышам под кожу спинки 25 мкл 0,5% раствора формалина. Оценку активности исследуемого комплекса проводили подсчитыванием числа болевых реагирований - облизывания брюшка или спинки в течение первых 5 минут (I фаза) и от 15 до 20 минут (II фаза). Для изучения анальгетической активности комплекс А вводили внутрибрюшинно, однократно, в дозе 3 мг/кг, а комплекс В в дозе 50 мг/кг, в качестве препарата сравнения использовали анальгин в дозе 5 мг/кг.
Модель острого асептического воспаления воспроизводили введением в подушечку правой задней лапки 0,05 мл 3,5% раствора формалина на физиологическом растворе [12]. Результаты влияния комплексов А и В на тяжесть воспалительного отека оценивали через 24 часа после инъекции формалина по разнице масс воспаленных и контрольных лапок по отношению к весу животных.
Изучение антимикробной активности проводили методом диффузии в агар и методом серийных разведений. Для определения антимикробной активности комплексов А и В в отношении Staphylococcus aureus, готовили суспензии в следующих разведениях: 2000 мкг/мл, юоо мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 65 мкг/мл, 32 мкг/мл на стерильном физиологическом растворе.
Иммунометаболическую эффективность комплексов оценивали по антиоксидантной, им-муномодулирующей и протективной активностям. Антиоксидантную активность комплексов А и В определяли вначале invitro по методике [ю]. Оценку антиоксидантной активности (АОА) и антиоксидантной способности (АОС) проводили по формулам 1 и 2:
V1 xCxlO , 1
1) А0А=—- и 2) АОС =-,
1 V2 АОА
где Vi - объем раствора определяемого комплекса, пошедшего на титрование калия перманганата, мл; V2 - объем раствора калия перманганата, мл; С - концентрация раствора определяемого комплекса, в %.
Для оценки антиоксидантной активности комплексов invivo в сыворотке крови определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) [и], ацилгидроперекисей (АГП) [l], оценивали активность супероксиддисмутазы эритроцитов (СОД) [5]. Для определения влияния комплексов на развитие иммунного ответа у инфицированных стафилококком животных определяли интенсивность гуморального иммунного ответа по количеству антителообразующих клеток в селезенке (АОК) по методике [6] и выраженность гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) по разнице масс подколенных лимфатических узлов (РМЛ) и разнице количества кариоцитов (РКЛ) по методике [8]. ГИО индуцировали эритроцитами барана (ЭБ), которые вводили внутрибрюшинно, однократно, из расчета lxios клеток на 1 кг массы тела. Для индукции ГЗТ внутрибрюшинно вводили lxio6 ЭБ (сенсибилизирующая доза). Через 4 суток в подушечку правой лапки вводили lxio8 ЭБ (разрешающая доза). Одновременно с введением ЭБ (для ГЗТ сенсибилизирующей дозы) внутрибрюшинно вводили комплексы А и В в количестве 3 мг/кг и 50 мг/кг соответственно.
Статистическую обработку результатов проводили путем вычисления средних арифметических изучаемых показателей и их стандартных отклонений. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни [3,4].
Результаты исследования и их обсуждение. Определение острой токсичности комплексов А и В показало, что исследуемые комплексы обладают низкой токсичностью, так как при введении изучаемых доз ни одно животное не погибло в течение 24 часов. Оценка анальгетической активности комплексов А и В показала более высокую активность комплекса А как при кини-новой болевой реакции (модель «уксусных корчей»), так и антиоцептивную активность в обеих фазах формирования болевой реакции. Оценка интенсивности воспалительного процесса показала, что комплекс А проявляет выраженное противовоспалительное действие, интенсивность отека снижается на 28,8 % (табл. l).
Таблица 1
Противовоспалительная активность комплекса А
Условия опыта Доза, мг/кг Оценка воспаления
Интенсивность отека, % ИГ
1. Контроль (масло) 0,2 0 -
2. Масло+формалин 0,2 100 89,4
3. Формалин+комплекс А 3 71,2 56,2
Изучение антистафилококковой активности изучаемых доз комплексов А и В показало высокую чувствительность Staphylococcus aureus к действию обоих комплексов. Наиболее активные дозы лежат в пределах от 65 мкг/мл до 500 мкг/мл и выше.
Определение антиоксидантной активности invivo показало, что комплексы А и В проявляют достаточно высокую антиоксидантную активность, которая сопоставима с аналогичной активностью аскорбиновой кислоты. Результаты по изучению антиоксидантной активности invivo комплексов А и В представлены в табл. 2.
Таблица 2
Антиоксидантная активность комплексов А и В у животных при введении стафилококка
Условия опыта СОД, ЕД/мл эритроцитов АГП,АД233/мл МДА, мкмолъ/л
1. Контроль (здоровые крысы) 57,2±5,1 1,8±0,2 38,1±3,2
2. Введение стафилококка 35,1±4,2*1 2,9±о,з*1 6з,1±5,4*1
3. Введение стафилококка и комплекса А 54,2±4,8*2 1,6±0,2*2 34,3±2,9*2
4. Введение стафилококка и комплекса В 51,8±4,4*2 1,5±о,Г2 32,9±2,8*2
• - достоверные отличии при р<0,05.
Приведенные в таблице данные убедительно показывают, что комплексы А и В проявляют выраженные антиоксидантные свойства на модели стафилококковой инфекции.
При стафилококковой инфекции наблюдается резкое снижение иммунологической реактивности организма. Изучение влияния комплексов А и В на интенсивность ГИО и ГЗТ на Т-зависимый антиген - эритроциты барана (ЭБ) в условиях стафилококковой инфекции показало их достоверную иммуностимулирующую активность (табл. 3).
Таблица 3
Иммуномодулирующая активность комплексов А и В у животных при введении стафилококка
Условия опыта АОК, юз/селезенка РМЛ, мг РКЛхю6
1. Контроль 28,4±2,7 4,6±о,4 5Д±о,5
2. Введение стафилококка 14,2±1,5*1 З^о.З*1 3>9±°>3*1
3. Введение стафилококка и комплекса А 2б,2±2,2*2 4,2±о,4*2 4,6±о,4*2
4. Введение стафилококка и комплекса В 29,1±2,6*2 4,7±о,4*2 5,2±О,5*2
Примечание: * - достоверные отличии при р<0,05.
Оценка протективной активности комплексов А и В показала, что в группах мышей, инфицированных летальной дозой стафилококка, к ю-му дню погибло 100% животных; в группе животных, получавших комплекс А, - 45%; в группе мышей, получавших комплекс В, - 35%. Полученные результаты свидетельствуют о достаточно высокой протективной активности выделенных комплексов.
Выводы. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что липо-фильный и гидрофильный комплексы, выделенные из шрота полыни горькой, проявляют выраженную антиоксидантную и иммуностимулирующую активность, наряду с этим показано, что выделенные комплексы проявляют широкий диапазон фармакологической активности: анальгети-ческую, противовоспалительную, антимикробную.
Литература
1. Бенисевич, В.И. Образование перекисей непредельных жирных кислот в оболочке эритроцитов при болезни Маркиафава-Микели / В.И. Бенисевич, Л.И. Идельсон // Вопросы медицинской химии. - 1973- ~~ Т. 19, вып. 6. - С. 596-599.
2. Гацура, В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ / В.В. Гацура. - М. ¡Медицина, 1974- ~МЗ с-
3. Гублер, Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов / Е.В. Гублер. - Л.: Медицина, 1978. -294 с.
4. Гублер, Е.В. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях / Е.В. Гублер, А.А. Генкин. - Л.: Медицина, 1973.-141 с.
5. Макаренко, Е.В. Комплексное определение активности супероксиддисмутазы и глутатионредукга-зы в эритроцитах больных с хроническими заболеваниями печени / Е.В. Макаренко // Лабораторное дело. -1988. - № il. - С. 48-50.
6. Мальберг, К. Метод локального гемолиза / К. Мальберг, Э. Зигль // Иммунологические методы : пер. с англ. - М. : Медицина, 1987. - С. 262-267.
7. Маянский, А.Н. Феномен высокоизбирательного взаимодействия между нейтрофилами человека и стафилококком / А.Н. Маянский, Т.В. Коликова, H.A. Маянский // Иммунология. - 1997- - № 3. - С. 25-28.
8. Руководство по иммунологическим методам в гигиенических исследованиях / Т.В. Федосеева, Л.В. Порядин, Л.В. Ковальчук и др. - М., 1993. - 319 с.
9. Снимщикова, И.А. Иммунопатогенетическая и клиническая характеристика эффективности локальной иммунокоррекции при некоторых гнойно-воспалительных заболеваниях / И.А. Снимщикова : авто-реф. дис.... д-ра мед. наук. - Курск,2001. - 42 с.
10. Способ определения антиоксидантной активности : пат. 2170930 Рос. Федерация: МПК7С Ol N 33/50, G Ol N 33/52 / Т.В. Максимова, И.И. Никулина, В.П. Пахомов [и др.]; заявитель и патентообладатель Моск. мед.акад. - № 22000111126/14; заявл. 05.05.2000; опубл. 20.07.2001.
11. Стальная, И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. - М. : Медицина, 1977. - С. 66-68.
12. Стрельников, Ю.Е. Сравнительная характеристика противовоспалительного действия некоторых пиримидиновых производных / Ю.Е. Стрелков // Фармакология и токсикология. - i960. - Т. 23, № 6. -С. 526-531.
13. Тринус, Ф.11. Методы скрининга и фармакологического изучения противовоспалительных, аналь-гезирующих и жаропонижающих веществ : метод, руководство /Ф.П. Тринус, В.М. Клебанов, H.A. Мохорт. -Киев, 1974. - 29 с.
14. Штабский, Б.М. К методике определения среднесмертельных доз и концентраций химических веществ / Б.М.Штабский //Гигиена и санитария. - 1980. - № 10. - С. 49-61.
15. Kaganii, К. Ranseiishogakuzasshi/L.Horhammer, L. Farkas, H. Wagner // J.JapAssoc.Infec.Diseases. -1997. - V. 71, № il. - P. 1108-1112.
16. Yamada, H. Studies on polysaccharides from Angelica acutiloba / H. Yamada, H. Kiyohara // Mol. Immunol. - 1985. - V. 22, № 3. - P. 295-304.
IMMUNOMETABOUC EFFICIENCY OF ARTEMISIA ABSINTHIUM L EXTRACTION CAKE COMPLEXES AT THE STAPHYLOCOCCOSIS
In this article we have presented the results of immunometabolic efficiency researching of lipophilic and hydrophilic complexes, allocated from Artemisia absinthium L. extraction cake after receiving tincture, at a staphylococcosis. It is established, that the complexes, allocated from Artemisia absinthium L. extraction cake, show expressed analgesic, anti-inflammatory and antimicrobic activities. In the conditions of a staphylococcosis, lipophilic and hydrophilic complexes have antioxidant and immunostimulating effects.
Keywords: extraction cake of Artemisia absinthium L., staphylococcosis, immunometabolic efficiency.
Й.Р. SEVERIN L.E. SIPLIVAYA V.Y.YATSUK
Kursk State Medical University e-mail: [email protected]
