CC BY
64
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Т. С. Боброва, Ю. В. Чуев ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОПУХОЛЬ-АССОЦИИРОВАННЫХ БЕЛКОВ В ТКАНЯХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ, ШЕЙКИ МАТКИ, ЖЕЛУДКА С ПОМОЩЬю ИММУННЫХ СЫВОРОТОК И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Проведено исследование опухоль-ассоциированных белков в тканях больных раком яичников, шейки матки, желудка, а также в неизмененной слизистой желудка и плаценте. Применяли иммуноблоттинг и иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител 1 и антисывороток 2 и 3, полученных к белкам клеток НЕр-2 (рак гортани) и неизмененной слизистой желудка человека соответственно, и антисыворотки р25—67 к отдельным белкам клеток НЕр-2. В лизатах плаценты и неизмененной слизистой желудка с помощью антисывороток 2, 3 и р25—67 выявлены белки с разной молекулярной массой; в лизатах образцов рака шейки матки с помощью кроличьей антисыворотки р25—67 выявили р95—115, а с помощью антисыворотки 2, истощенной экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия, — р130—150. Истощение антисыворотки 2 в лизатах плаценты и неизмененной слизистой желудка происходило по белкам р26, р24, р93 и р130. Выявлено усиление свечения апикальной части клеток при обработке той же антисывороткой некоторых образцов неизмененной слизистой желудка. С помощью моноклональных антител Д11 выявлена экспрессия клетками НЕр-2 макрофагальных антигенов (р140), а с помощью моноклональных антител 1 — экспрессия р32—34 и р65—70 лизатами макрофагов, Т- и В-лимфоцитов здоровых доноров. При иммуногистохимическом исследовании с использованием антисывороток р25—67 неизмененная слизистая желудка экспрессировала р25, р50, р60 и р67. Предполагается, что антисыворотки 2 и 3, кроличья антисыворотка р25—67 и моноклональные антитела 1 выявляют рецепторные комплексы CD3/ТCR, мембранные иммуноглобулины ^ВД, SIgM-BCR, белки семейств классических Е- и Т-кадгеринов совместно с актинсвязывающими белками либо муциноподобные белки. Нам представляется важным продолжить это исследование с целью уточнения локализации и характеристик белков и возможностей использования полученных данных для диагностики опухолей.
Ключевые слова: опухоль-ассоциированные белки, иммуноблоттинг, иммуногистохимическое исследование.
Ранее нами получены Ас 1 (антисыворотка) и Ас 3 к поверхностным белкам клеток перевиваемых клеточных линий рака гортани (НЕр-2, НеLа-подобная) и молочной железы (Е16В, HeLa-подобная) соответственно и обнаружены белки, обозначенные как НеLа-ассоции-рованные антигены (НАА). Они определялись преимущественно при аденокарциноме желудка и метастазах этой опухоли в лимфатических узлах. Методом имму-ноблоттинга выявлено несколько белков с молекулярной массой 30; 39; 60; 67 и 170—190 кДа. Предполагалось, что НАА 1 имеет иммунологически активную субъединицу с молекулярной массой 39 кДа, а НАА 2 — с молекулярной
© Боброва Т. С., Чуев Ю. В., 2006 УДК 616-006.04-097:57.083.3
массой 170—190 кДа, причем последняя, вероятно, распадается на субъединицы с молекулярной массой 60—67 и 39 кДа.
Методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью Ас 1 и аффинно-очищенных элюатов антител НАА 1 выявлен в образцах высоко- и умереннодифференцированной аденокарциномы желудка и метастазах этой опухоли в лимфатических узлах. Положительная реакция обнаружена также при раке (цистаденокарциноме) яичников, полипах эндометрия и в некоторых клетках рака толстой кишки. Положительная реакция на НАА 2 (р170—190, р67, р60, р39) выявлена при раке желудка, в нормальной ткани молочной железы. Более слабая реакция на НАА 2 наблюдалась при раке молочной железы, что, возможно, связано с супрессией этих белков при
канцерогенезе [2; 6; 7]. С целью уточнения локализации белков и создания тест-систем для дополнительной иммунологической диагностики микрометастазов рака желудка с помощью стандартных методических подходов получены МКА 1 — IgG к белкам клеток НЕр-2. Методом иммуноблоттинга с помощью МКА 1 (моноклональные антитела) обнаружено семейство белков с молекулярной массой 30—32, 34—38, 55, 70, 180 и 240 кДа, главными из которых по интенсивности реакции и частоте обнаружения являются р34—38 и р55. Экспрессия р34—38 выявлена преимущественно у больных раком яичников, шейки матки, почки, толстой кишки, а также в плаценте [3; 4]. С целью уточнения молекулярной массы тест-системных белков получены мышиные и кроличьи Ас к отдельным белкам клеток НЕр-2.
Цели настоящей работы — (1) уточнение иммунологических характеристик кроличьих Ас 2, Ас 3, МКА 1 и молекулярной массы основных белков, выявляемых ими в лизатах неизмененной слизистой желудка, плаценты, а также образцов рака желудка, яичников и шейки матки; (2) уточнение иммунологических характеристик Ас, полученных к отдельным белкам (р25—67) клеток НЕр-2, определение молекулярной массы белков, перекрестно реагирующих с неизмененной слизистой желудка и плацентой, а также определение локализации белков, выявляемых Ас р25—67 при иммуногистохимическом исследовании.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы опухолевых тканей и тканей, окружающих опухоль (взяты на расстоянии 5 см от опухоли), получены из отдела патологической анатомии опухолей человека ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Ткани плаценты человека любезно предоставлены сотрудником лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН В. А. Шатской.
Клеточные линии НЕр-2
Клеточные линии НЕр-2 (рак гортани, НеLа-подоб-ные) культивировали в среде, содержащей 45% среды М199, 45% гидролизата лактальбумина, 10% сыворотки крупного рогатого скота, пенициллин и стрептомицин по 500 000 ед/л. Клетки снимали пипетированием с последующим отмыванием в среде Хенкса и центрифугированием при 200 д в течение 5—10 мин. Мембранные антигены клеток НЕр-2, экстрагированные 3М раствором КС1, и лизаты разных тканей готовили по методикам, описанным ранее. Использованы также клетки НЕр-2, выращенные на стеклах с последующей фиксацией холодным ацетоном в течение 10 мин [2; 6; 7]. Лимфоциты из крови здоровых доноров получали при отстаивании клеток крови в 1% растворе желатина в течение 3 ч при температуре 4°С. Полученные клетки отмывали забуференным физиологическим раствором с последующим центрифугированием при 200 д в течение 5 мин. Отмытые лимфоци-
ты переносили в среде М199 в пластиковые чашки Петри и отстаивали в течение 2 ч при температуре 37°С. Прикрепившиеся клетки (моноциты, макрофаги) снимали пипетированием, отмывали в среде М199 с последующим центрифугированием при 200 g и затем готовили лизаты. Неприкрепившиеся клетки отмывали и разливали в чашки Петри, предварительно покрытые антителами к IgM в боратном буфере рН 8,8. Через 1 ч удаляли надосадоч-ную жидкость с Т-лимфоцитами, которые затем отмывали средой М199. В-лимфоциты снимали пипетированием и тоже отмывали. Полученные Т- и В-лимфоциты использовали для получения лизатов.
Кроличьи и мышиные антисыворотки
Ас 1 получена к клеткам НЕр-2, экстрагированным 3М раствором КС1, Ас 2 — к полосе преципитации между Ас 1 и гомогенатом неизмененной слизистой желудка, Ас 3 — к клеткам Е16В, экстрагированным 3М раствором КС1. Аффинно-очищенную фракцию Ас 2 получали при обработке Ас 2 экстрактом клеток Е16В, пришитым к се-фарозе 4В («Pharmacia», Швеция). Последний выступал в качестве иммуносорбента. МКА 1 к экстракту клеток НЕр-2 получали по стандартной методике. Кроме того, в работе использованы иммуноглобулиновая фракция, выделенная из асцитической жидкости [3; 4], иммуноглобулиновая фракция одной из мышиных гибридом, полученных к белкам клеток НЕр-2 (МКА НЕр-2), и мышиная антисыворотка, полученная к лизату образцов рака яичников. Меченные пероксидазой и флюоресцеина изоти-оцианатом Ас к человеческим, кроличьим, мышиным иммуноглобулинам получены из Института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.
Для получения Ас к отдельным белкам клеток клеточной линии НЕр-2 кроликов и мышей иммунизировали полосой белков определенной молекулярной массы, перенесенных после полупрепаративного электрофореза на нитроцеллюлозу. Таким образом получены следующие Ас: Ас р25, Ас р34, Ас р39, Ас р40—46, Ас р50, Ас р60, Ас р67. МКА Д11 (к белкам макрофагов человека) и Ас к альбумину человека и любезно предоставлены сотрудниками лаборатории иммунохимии НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН Т. Д. Рудинской и Т. Л. Эрайзер.
Электрофорез, иммуноблоттинг и иммуногистохимическое исследование
Для проведения иммуноблоттинга 10—20 мкл лизата, содержащего 50—70 мкг белка, обрабатывали буферным раствором, содержащим 2 или 4% 2Р-меркаптоэтанола и 2% додецилсульфата натрия, и подвергали электрофорезу в 8% полиакриламидном геле по U. K. Laemmly [11]. Белки переносили на нитроцеллюлозный фильтр «Hybond-C-Extra» («Amersham», Великобритания) при напряженности электрического поля 2 В/см в течение 20 ч. Фильтры с белками обрабатывали по общепринятой
методике. Ас р25—67 использовали в разведении 1:1000, Ас 2 и Ас 3 — в разведении 1:500. Реакцию Ас с белками в лизатах тканей в ряде случаев выявляли с помощью вторых биотинилированных антител в соответствии с протоколом «Amersham Pharmacia Bioteck» (Швеция). МКА 1 использовали в разведении 1:2000 [2; 4].
Иммуногистохимические препараты готовили по описанной ранее методике [2; 6; 7]. Эндогенную перок-сидазу ингибировали 0,4% раствором азида натрия с 0,1% раствором перекиси водорода в забуференном физиологическом растворе. Далее срезы инкубировали во влажной камере с Ас в разведении 1:50 при температуре 4°С в течение 8—10 ч. После отмывки забуференным физиологическим раствором срезы обрабатывали антителами, меченными флюоресцеина изотиоцианатом, в разведении 1:50 в течение 30 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С помощью Ас р25—67, полученных к отдельным белкам перевиваемой клеточной линии НЕр-2, проведено исследование с целью уточнения молекулярной массы основных белков, выявленных нами ранее. Изучены лизаты образцов рака шейки матки, яичников, а также ткани плаценты и неизмененной слизистой желудка в нативных условиях и при денатурации. Лизат ткани плаценты использован, потому что ранее нами методом иммунодиффузии получены данные о частичной идентичности белков, выявляемых с помощью Ас 1 и 3 в плаценте и неизмененной слизистой желудка. Методом иммуноблоттинга мы решили уточнить молекулярную массу перекрестно реагирующих белков. Кроме того, ранее при использовании Ас 2, истощенной экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия, при непрямой иммунофлюоресценции получены предварительные данные не об ослаблении, а напротив, об усилении флюоресценции. В связи с этим мы решили определить молекулярную массу белка или белков истощенной Ас 2.
На рис 1, А представлены результаты иммуноблоттин-га лизатов образцов плаценты и неизмененной слизистой желудка. Обнаружено, что кроличья Ас р40—46 в лизатах образцов плаценты дает умеренную диффузную реакцию в районе р48—50, слабую реакцию в районах р26 и р33 и не реагирует с лизатами образцов неизмененной слизистой желудка. При использовании кроличьей Ас р39 в лизатах образцов плаценты выявлены умеренная диффузная реакция в районе р48—50, слабая реакция в районе р67—69, а в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка — умеренная реакция в районе р21 и слабая реакция в районе р33. В лизатах образцов плаценты Ас 3 интенсивно реагирует с белками в районах р30—32, р34 и р67, менее выраженная реакция отмечена в районах р33 и р150. При обработке лизатов образцов неизмененной слизистой желудка с помощью Ас 3 выявлена умеренная реакция в районе р21. При использовании Ас 2 в лизатах образцов плаценты отмечены интен-
- 250 кДа
-69 кДа -50 кДа -З5 кДа
-ЗО кДа -21 кДа
1 2 З 4 5 6 7 8 9 10 11 12
А
-250 кДа
-69 кДа -50 кДа
- З0 кДа
1 2 З 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1З 14 15 16
Б
Рисунок 1. Выявление белков в лизатах методом иммуноблоттинга .
А. Исследование образцов неизмененной слизистой желудка и плаценты: 1 — плацента, Ас р40—46 ; 2 — плацента, Ас р39; 3 — плацента, Ас 3; 4 — плацента, Ас 2; 5 — плацента, Ас 2, истощенная экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия; 6 — плацента, аффинно-очищенная фракция Ас 2; 7 — неизмененная слизистая желудка, Ас р40—46 ; 8 — неизмененная слизистая желудка, Ас р39; 9 — неизмененная слизистая желудка, Ас 3; 10 — неизмененная слизистая желудка, Ас 2; 11 — неизмененная слизистая желудка, Ас 2, истощенная экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия; 12 — неизмененная слизистая желудка, аффинно-очищенная фракция Ас 2. Б. Исследование образцов рака шейки матки: 1 — Ас 2, истощенная экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия, в условиях денатурации; 2 — Ас 2, истощенная экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия в нативных условиях; 3 — Ас 2 в условиях денатурации; 4 — Ас 2 в нативных условиях; 5 — Ас р67 в условиях денатурации; 6 — Ас 67 в нативных условиях; 7 — Ас р60 в условиях денатурации; 8 — Ас р60 в нативных условиях; 9 — Ас р50 в условиях денатурации; 10 — Ас р50 в нативных условиях; 11 — МКА (НЕр-2) в условиях денатурации; 12 — МКА (НЕр-2) в нативных условиях; 13 —мышиная Ас к лизату образцов рака яичников в условиях денатурации; 14 — мышиная Ас к лизату образцов рака яичников в нативных условиях; 15 — Ас А в условиях денатурации; 16 — Ас А в нативных условиях.
сивная диффузная реакция в районах р24, р26 и р48—50, умеренная реакция с тройным белком р87—90—93 и слабая реакция в районах р33, 35 и с двойным белком р130. В лизатах образцов неизмененной слизистой желудка Ас 2 дала умеренную реакцию с р26, р53 и р67. В лизатах образцов плаценты и неизмененной слизистой желудка Ас 2, истощенная экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия, реагирует с белками с той же молекулярной массой, что и Ас 2, за исключением р26.
При обработке Ас 2 лизатов образцов рака яичников выявлена умеренная реакция в районах р21 и р26 и слабая реакция в районах р30—38 и р67—70. Интересно, что при использовании Ас 2, истощенной экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия, отмечено ослабление реакции со всеми белками, в первую очередь с р26. Таким образом, истощение Ас 2 в лизатах образцов плаценты, неизмененной слизистой желудка и рака яичников отмечается по р26 и р93, а в лизатах образцов плаценты — еще и по двойным белкам р24 и р130. Аффинно-очищенная фракция Ас 2 в лизатах образцов плаценты слабо реагировала с белками с молекулярной массой 48—50 кДа и р87—90, а в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка давала отрицательную реакцию. Это противоречит данным, полученным ранее. Нами на парафиновых срезах неизмененной слизистой желудка и образцов рака желудка методом непрямой иммунофлюоресценции выявлена положительная реакция с помощью аффинно-очищенной фракции Ас 2. Кроме того, в гомогенатах неизмененной слизистой желудка при иммуноблоттинге с помощью Ас 2, на основе которой получен элюат антител, определены белки с молекулярной массой 30—36; 39 и 60—67—70 кДа (хотя белки р60—70 выявляли непостоянно). Возможно, отсутствие реакции связано с потерей активности белков в результате длительного хранения лизата образцов неизмененной слизистой желудка при температуре —20°С.
Таким образом, при исследовании лизатов образцов плаценты и неизмененной слизистой желудка показано, что Ас 2 положительно реагирует с белками этих лизатов, но молекулярные массы выявляемых при этом белков значительно отличаются. Различия в выявляемых с помощью Ас 2 и Ас 3 белках в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка и рака яичников незначительны. Детерминанта, с которой реагирует Ас 3 в образцах неизмененной слизистой желудка и плаценты, соответствует белкам с разной молекулярной массой (в первом случае это р21, во втором случае это р30—32, р33—34, р67, р150). Кроме того, р21, выявляемый с помощью Ас 3 в образцах неизмененной слизистой желудка, похож на детерминанту, выявляемую с помощью Ас р39 (табл. 1).
На рис. 1, Б представлены результаты иммуноблот-тинга лизатов образцов рака шейки матки в нативных условиях и при денатурации. В нативных условиях все вновь полученные Ас р25—67 выявили двойной белок р95—97. В условиях денатурации отмечена лишь слабая
реакция с двойным белком р65—67. С помощью Ас 3 выявлена умеренная реакция в районе р34 и слабая реакция в районе р65—70. В нативных условиях Ас 2 дала умеренную реакцию с р100—105 и р130—150, в условиях денатурации — слабую реакцию с р65—67.
С помощью Ас 2, истощенной экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия, выявлено усиление реакции в районе р 130— 150, что соответствует нашим предварительным данным, полученным на парафиновых срезах образцов неизмененной слизистой желудка в предыдущих исследованиях. Показано также, что в некоторых случаях при использовании истощенной Ас 2 отмечается усиление свечения образцов неизмененной слизистой желудка. На парафиновых срезах образцов высоко- и умереннодифференцированной аденокарциномы желудка такую реакцию определяли только в неизмененной слизистой. Таким образом, истощение Ас 2 экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия неоднозначно сказывается на ее иммунологической реактивности. При добавлении истощенной Ас 2 к лизатам образцов плаценты и неизмененной слизистой желудка утрачивается положительная реакция с р26, к лизатам образцов рака шейки матки — усиливается реакция в районе р 13 0—150. Можно предположить, что в лизатах образцов рака шейки матки р 13 0—150 либо обладают свойствами адгезии, либо являются рецепторами, а в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка и плаценты таких белков либо нет, либо детерминанта по каким-то причинам не выявляется (возможно, разрушена протеолитическими ферментами). Для выяснения причин этого явления необходимы дальнейшие исследования.
Взятая в качестве контроля Ас А в лизатах образцов рака шейки матки выявила только альбумин. Кроме того, в качестве отрицательного контроля использованы антитела к белкам клеток НЕр-2, секретируемые одной из мышиных гибридом, и мышиная Ас к лизату образцов рака яичников.
Все вновь полученные кроличьи Ас в нативных условиях в лизатах образцов рака шейки матки давали положительную реакцию в районе р95—97 и умеренную реакцию в районе р130—150. У Ас р60 положительная реакция была более интенсивной, а у Ас р67 — более слабой. В условиях денатурации (при добавлении 4% раствора 2Р-меркаптоэтанола) выявлено лишь слабое окрашивание двойной полосы с молекулярной массой 65—70 кДа. Кипячение и обработка 4% раствором 2Р-меркаптоэтано-ла приводили к исчезновению реакции кроличьей Ас с р95—97. Следовательно, в иммунной реакции участвуют белковые, а не олигосахаридные структуры и разрушение дисульфидных связей, по-видимому, также отрицательно влияет на активность исследуемых Ас. Остается неясным, почему Ас, полученные к полосам белка на нитроцеллюлозе с разной молекулярной массой, выявляли в лизатах образцов рака шейки матки белки с одинаковой молекулярной массой, отличной от молекулярной массы
Таблица 1
Выявление белков методом иммуноблоттинга в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка, плаценты, рака яичников, шейки матки и клетках НЕр-2 с помощью Ас и МКА
Ас и МКА Неизмененная слизистая желудка Плацента Рак яичников Рак шейки матки Клеточная линия НЕр-2
Ас р40—46 - р26 (±) р34 (±) р48—50 (++) НД НД ++
Ас р39 р21 (++) р33 (+) р48—50 (++) р67—70 (+) НД НД ++
Ас 2 р26 (++) р30 (+) р55 (++) р67 (+) р24 (+++) р26 (++) р48—50 (+++) р87—90—93 (+/++) р130—150 (+) р21 (++) р26 (++) р30—32 (+) р34—38 (++) р67—70(+) р87(+) р110 (++) р130—150 (++) ++
Ас 2, истощенная экстрактом клеток НЕр 2 в 3М растворе хлорида калия р26 (±) р55 (++) р67 (+) р24 (++) р26 (-) р48—50 (+++) р87—90 (++) р93 (±) р130(±) р21 (-) р26(-) р30—38 (±) р87 (-) р110 (++) р130—150 (++) НД
Элюат Ас 2 - р48—50 (+) р87—90 (+) р21 (±) р30—32 (±) р34—38 (±) НД НД
Ас 3 р21 (+) р33 (±) р30—32 (++) р33 (+) р34 (+++) р67—70 (+++) р150(+) р21 (+) р30—32 (+) р150(+) р34 (++) р60—67 (++) ++
Кроличьи Ас р25, Ас р34, Ас р50, Ас р60, Ас р67 НД НД НД р60—67 (+) р90—97 (+++) р130—150 (++) р25 (++) р39(++) р40—46 (++) р60 (++)
МКА 1б р25—28а р34 р55 р34—36а р150 р14а р25—28 р34 р53 р70—72 р34а р33—34 (++)
---отсутствие реакции; ± — очень слабая реакция; + — слабая реакция; ++ — умеренная реакция; +++ — интенсивная реакция;
НД — нет данных.
а Данные исследований, выполненных ранее.
б С помощью МКА 1 в макрофагах, Т- и В-лимфоцитах здоровых доноров выявлена экспрессия р32—34 и р65—70.
белка в полосах. Поскольку контрольные Ас не выявили интенсивной положительной реакции с р95—97, можно предположить, что эти белки не являются лектинами. Мышиные Ас реагировали с белками исследуемых образцов рака шейки матки намного слабее и в отличие от кроличьих Ас выявляли не р95—97, а р110—115 (табл. 1).
Методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью Ас р25—67 на парафиновых и криостатных срезах образцов неизмененной слизистой желудка выявляли в основном р25, р40—46, р50, р60 и р67. Слабая реакция на тех же препаратах отмечена с Ас р34 и Ас р39. Картина свечения, выявленная при использовании Ас р60, похожа на реакцию с Ас 2 и отмечается в тех же отделах слизистой желудка. С учетом данных о реакции иммун-
ных сывороток с высокомолекулярными белками можно предположить, что выявленные нами белки являются муцинами, продуктами распада муцинов или перекрестно реагируют с ними. Как полагают авторы, выявившие реакцию МКА к муцину 2 (МИС 2) с образцами рака толстой кишки, яичников, легкого, желудка и молочной железы, «перинуклеарное гранулярное свечение, возможно, отражает выявление белкового ядра в эндоплазматическом ретикулуме или аппарате Гольджи до завершения гли-козилирования. Отсутствие реакции МКА с капельками муцина и бокаловидными клетками предполагает слабое взаимодействие со зрелым муцином в неизмененной слизистой желудка. То, что не все клетки данного типа проявляют одинаковую экспрессию, предполагает раз-
ный фенотип или разную стадию созревания, которые возможны в продуцирующих муцин образцах морфологически сходных клеток» [17].
Мы предполагаем, что Ас 3 и некоторые Ас, полученные к отдельным белкам (Ас р34, Ас р40—46, Ас р50, Ас р67), возможно, выявляют незрелый муцин или муциноподобный белок, а Ас 2 и другие Ас (Ас р25, Ас р39, Ас р60) — зрелый муцин или муциноподобный домен в апикальной части клеток, созревающий (поскольку свечение слабое) в перинуклеарной зоне. Возможно, Ас 3 выявляет 1д-подобный трансмембранный домен молекул адгезии 1САМ, VCAM, RECAM. Следовательно, клетки перевиваемой клеточной линии НЕр-2 могут содержать 1д-подобный трансмембранный домен и созревающий муцин. Эти данные косвенно подтверждает то, что Ас 2, истощенная экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия, устраняет только перинукле-арное свечение, а истощенная белками неизмененной слизистой желудка, преципитированными 30% раствором сульфата аммония, — свечение и в перинуклеарной, и в апикальной частях клеток. При использовании Ас 2 отмечается также свечение межклеточного пространства, клеток (возможно, опухолевых, макрофагов или лейкоцитов) в русле крупных сосудов, а также их эндотелия, что, вероятно, обусловлено перекрестными реакциями с лейкоцитарными молекулами адгезии (табл. 2, рис. 2) [2; 6; 13—15; 19].
Ранее нами с помощью МКА 1 в лизатах образцов рака яичников (83%), неизмененной слизистой желудка (14%), рака шейки матки (38%) и плаценты выявлены р34—38,
а также р25—28, р50—55, р70—72 (образцы рака яичников, неизмененной слизистой желудка), р150 (образцы плаценты) [3; 4]. В данной работе показано, что МКА 1 выявляют в лизатах нормальных макрофагов В- и Т-лим-фоцитов р32—34, р65—70. Возможно, р65—70 является предшественником р32—34. В повторных экспериментах в лизатах Т-лимфоцитов МКА 1 выявили только р25—28. При исследовании клеток НЕр-2, фиксированных ацетоном, обнаружена умеренная положительная реакция с кроличьими Ас р25, Ас р39, Ас р40—46, Ас р60. МКА Д11 давали интенсивную реакцию с фиксированными клетками НЕр-2, что свидетельствует об экспрессии этими клетками макрофагальных белков (р140) [18]. Таким образом, клетки НЕр-2, возможно, экспрессируют белки, свойственные клеткам ретикулоэндотелиальной системы.
Белки, выявляемые Ас, по молекулярной массе и локализации схожи с лейкоцитарными молекулами адгезии (р90—95, р65—70, р50), классическими кадгеринами (р105, р110, р140), Т-клеточным рецепторным комплексом (CD3, р16, р20, р25—28) и макрофагальным колониестимулирующим фактором (M-CSFR, р110, р150, экспрессируется моноцитами, макрофагами и клетками плаценты). Что касается макрофагального колониестимулирующего фактора, возможно, с ним имеется лишь перекрестная иммунологическая реактивность (Ас 1 и Ас 3 в иммунодиффузии с белками из образцов плаценты выявляли лишь частичную идентичность).
Существует три главных семейства лейкоцитарных молекул адгезии: интегрины, 1д-родственные молекулы и се-лектины. Неизмененная слизистая желудка экспрессиру-
Таблица 2
Иммуногистохимическое выявление белков на парафиновых срезах неизмененной слизистой желудка с помощью Ас
Ас Иммуногистохимическая локализация белков в неизмененной слизистой желудка Подобные реакции (предположительно)
Ас р25 Свечение в просвете желез и в отдельных клетках фундального отдела Реакция со зрелым муциноподобным белком
Ас р34 Слабое диффузное перинуклеарное свечение Реакция с созревающим муциноподобным белком
Ас р39 Свечение в просвете желез Реакция со зрелым муциноподобным белком
Ас р40—46 Диффузное перинуклеарное свечение, свечение в просвете желез, в отдельных клетках фундального отдела; в некоторых препаратах — контурное перинуклеарное свечение Реакция со зрелым и с созревающим муциноподобными белками
Ас р50 Контурное перинуклеарное свечение Реакция с 1д-подобными белками
Ас р60 Свечение в апикальной части клеток, слабое диффузное перинуклеарное свечение Реакция со зрелым и с созревающим муциноподобными белками
Ас р67 Перинуклеарное свечение, свечение в отдельных клетках желез фундального отдела Реакция с созревающим муциноподобным белком
Ас 2 Свечение в апикальной части клеток, в том числе контурное в верхних отделах; слабое перинуклеарное свечение Реакция со зрелым, с созревающим муциноподобными белками и 1д-подобными белками
Ас 3 Перинуклеарное свечение Реакция с созревающим муциноподобным и 1д-подобными белками
~ * ' т
<sU
Tv -%Г
ч *■
я ,
‘.і:
Щ]
ет межклеточные молекулы адгезии, в частности ICAM-1, или CD54, причем ICAM-1 связывает CD11b/CD18 (Macl) и CD11a/CD18 (LFA-1, lymphocyte function associated). Возможно, Ас 2, Ас 3 и Ас р25—67 выявляют эпитоп, общий для семейства лейкоцитарных молекул адгезии. Это опосредованно подтверждается тем, что ранее мы наблюдали свечение на парафиновых срезах селезенки человека в районе белой пульпы, а также тем, что методом иммуно-
диффузии выявлена слабая реакция Ас 1 и Ас 3 с гомогенатами клеток селезенки человека (табл. 3) [8; 9; 13—15].
Непостоянство реакции при использовании Ас 2, истощенной экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия, можно объяснить снижением или отсутствием экспрессии молекул адгезии (или рецепторов) в разных образцах неизмененной слизистой желудка. Так, показано, что отсутствие или снижение экспрессии
Таблица 3
Предполагаемые родственные молекулы и их иммунологические и биохимические характеристики
Предполагаемые родственные молекулы Иммунологические и биохимические характеристики предполагаемых родственных молекул
Интегрины Большое семейство поверхностных гетеродимеров, состоящее по крайней мере из 11 а-субъединиц, нековалентно связанных с разными в-субъединицами. В нередуцирующих условиях имеют молекулярную массу 90 и 140 кДа, в редуцирующих — 105 кДа. Лейкоцитарные молекулы адгезии в2-интегрины — CD 11 b/CD18 (названный Мас-1) и CD 11C/CD18 находятся в гранулах гранулоцитов [13—15; 19]
1д-подобные молекулы К ним относятся CD2 (рецептор бараньих эритроцитов) и его лиганд CD58 (LFA-3), нейрональная молекула клеточной адгезии CD56 (NCAM) и сосудистая молекула адгезии VCAM-1, CD54 (ICAM-1, 90— 95 кДа), ICAM-2 и ICAM-3, связывающаяся с интегринами. Суперсемейство генов иммуноглобулинов кодирует 6 Ig-подобных доменов, имеющих внутридоменную сиквенсную схожесть, которые были разделены на подгруппы С1, С2 и V. Подгруппа С2 обнаружена преимущественно в молекулах клеточной адгезии (CAM), в том числе РЭА и ICAM-1 [13—15; 19]
L-селектин ^еи8, LAM -1) Человеческий гомолог мышиного рецептора периферических лимфатических узлов. Другие члены этого семейства — Е-селектин (ELAM-1, 110 кДа) и Р-селектин (CD62, PADGEM) [13—15; 19]
МАаСАМ-1 Обнаруживается на поверхности эндотелия и эпителия и имеет молекулярную массу 60 кДа. Один из трех тканеспецифических адрессинов (сосудистый адрессин слизистых). Имеет муциноподобный и Ig-подобный домены. Последний схож с а2 IgA1 и адгезивными рецепторами суперсемейства иммуноглобулинов, в особенности ICAM и VCAM-1. В норме MAdCAM-1 экспрессируется клетками кишечника. Значительное повышение его экспрессии выявлено при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона. Некоторые маленькие венулы в клеточном слое, примыкающем к маргинальным синусам вокруг узлов белой пульпы в селезенке, также экспрессируют MAdCAM-1 [13—15; 19]
Е-кадгерин Главный член суперсемейства кадгеринов — адгезионных молекул, принимающих участие в кальций-зависимых клеточных взаимодействиях. Большинство членов суперсемейства кадгеринов — трансмембранные гликопротеиды, пронизывающие плазматическую мембрану 1 раз. Внеклеточная часть молекулы кадгерина состоит из вариабельного числа так называемых кадгериновых доменов, высокогомологичных один другому. Классические кадгерины содержат по пять кадгериновых доменов. Цитоплазматический домен классических кадгеринов связан с цитоплазматическими катенинами, которые в свою очередь служат связующими звеньями между кадгеринами и актиновыми филаментами. К классическим кадгеринам I типа относятся Е-кадгерин (epithelial, эпителиальный), N-кадгерин (neural, нервный), Р-кадгерин (placental, плацентарный), VE-кадгерин (vascular endothelial, эндотелиальный) и R-кадгерин (retinal, сетчатки глаза). Трансфекция культивируемых мезенхимных клеток кДНК разных кадгеринов приводит к их эпителизации, в то время как ингибирование межклеточных взаимодействий антителами к кадгеринам — к потере клетками эпителиального фенотипа и стимуляции подвижности клеток и инвазии. Смена фенотипа опухолевых клеток (с эпителиального на мезенхимный) сопровождается повышением экспрессии N-кадгерина и снижением экспрессии Е- и Р-кадгеринов [5; 8; 9]
Т-кадгерин Зрелый Т-кадгерин — белок с молекулярной массой 105 кДа, его частично процессированный предшественник — белок с молекулярной массой 130 кДа. Потеря локуса 16q24, содержащего ген Т-кадгерина, коррелирует с развитием рака молочной железы, легкого, желудка и яичников. Т-кадгерин, как и другие гликофосфатидилинозитольные белки, локализован на клеточной поверхности в особых доменах плазматической мембраны — кавеолах и липидных плотах, в которых присутствуют также такие сигнальные молекулы, как G-белки, киназы семейства Src, белки RAS, а также трансмембранные рецепторы факторов роста [5]
Мембранные иммуноглобулины (Б1д) Входят в состав макромолекулярных комплексов, содержащих помимо SIg актин, белок с молекулярной массой 112 кДа (предполагают, что это а-актинин) и три белка с молекулярной массой 70—73 кДа. Обнаружено, что in vitro SIg связаны с актином через Gc-белок (сывороточный витамин^-связывающий белок с молекулярной массой 56 кДа, pI 4,8—5,1). SIgM мышиных В-лимфоцитов связаны с 2 поверхностными белками (р45 и р65), а SIg куриных В-лимфоцитов — с 2 актинсвязывающими белками (р55 и р34). На В-лимфоцитах человека обнаружен высокомолекулярный комплекс SIgM-BCR (поверхностный IgM-В-клеточный рецептор). Структура комплекса SIgM-BCR изучена. Она имеет сходство со структурой CD3/TCR [12; 16; 20]
Т-клеточный рецептор (TСR) Устоит из а- и в-гетеродимеров и узнает антигенный пептид, связанный с полиморфной молекулой, кодируемой генами главного комплекса гистосовместимости II класса. Показано, что Т-лимфоциты, инфильтрирующие опухоль in vivo, имеют ограниченный набор TCR, состоящих преимущественно из гомогенной в-цепи TCR. Предполагается, что TCR активируется через CD4 и р56 lck-тирозинкиназу [12; 16; 20]
Е-кадгерина наблюдается при многих опухолях человека, в том числе при раке толстой кишки, легкого, предстательной железы, мочевого пузыря, поджелудочной железы, шейки матки, пищевода и желудка, опухолях головы и шеи. В неизмененной слизистой желудка при окраске на Е-кадгерин отмечают базолатеральное окрашивание крипт эпителия желудка и двенадцатиперстной кишки и отсутствие окрашивания люминальной поверхности. Полагают, что Е-кадгерин играет главную роль в клеточной адгезии. Возможно, снижение экспрессии Е-кадге-рина на фоне инфекции, вызываемой Helicobacter pylori, может являться первым этапом развития рака желудка, поскольку ослабление клеточной адгезии облегчает подвижность эпителиальных клеток [9].
При использовании Ас 3 (но не Ас 2) отмечается базолатеральное свечение крипт, как при окрашивании на Е-кадгерин. Ас 2 дает слабое базолатеральное свечение и интенсивное свечение апикальной части клеток желез неизмененной слизистой желудка. Апикальная локализация характерна для Т-кадгерина. Это отмечено некоторыми исследователями при изучении поляризованных клеток кишечного эпителия. Ас р25—67 могут выявлять Е- и Т-кадгерины в комплексе с другими белками, например с в-катенином (р95—110) для Е-кадгерина, или с гликофосфа-тидилинозитолом (р110) для Т-кадгерина, или, возможно, с актинсвязывающими белками (р34, p65—70) (табл. 3) [5].
Ас 2, Ас 3 и Ас р39 выявляют в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка, плаценты и рака яичников р21, р24 и р26, и истощение Ас происходит преимущественно по р26 и частично по р24. После истощения Ас эти белки в лизатах этих образцов либо не выявляются, либо дают слабую положительную реакцию. По молекулярной массе р21, р24, р26 похожи на белки CD3/Т-клеточного рецепторного комплекса (CD3/TCR).
Проведенный нами ранее сиквенс р34—38 и р55 показал, что р34—38 является 8-областью в-цепи Т-клеточного рецептора. Белки CD3/TCR также могли быть элюированы вместе с актинсвязывающими белками при получении мембранных белков клеток НЕр-2. И хотя клетки НЕр-2 не являются Т-клеточной линией, экспрессия этих белков, по нашему мнению, возможна. Причиной этого является то, что снижение экспрессии Е- и Р-кадгеринов вызывает изменение фенотипа с эпителиального на мезенхимный (это явление отмечено некоторыми авторами) либо клетки НЕр-2, возможно, являются гибридами соматических клеток и макрофагов (или Т- либо В-лимфоцитов). CD3/ TCR, как и кадгерины, связан с катенин-актининовыми белками (95—110 кДа). В связи с этим р95—110, выявленные в лизатах образцов рака шейки матки, могут, например, быть а-актинином. Один из белков, выявляемых Ас 2 и Ас 3 в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка и плаценты, похож на Gc-белок с молекулярной массой 56 кДа, (pI 4,8—5,1). Однако подвижность основной массы исследованных белков, по предварительным данным, находится в другой зоне (табл. 3) [1; 4; 5; 20].
Таким образом, показано, что Ас 2, Ас 3 и Ас р25—67 выявляют в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка, плаценты и рака яичников белки с разной молекулярной массой. В лизатах образцов рака шейки матки сыворотки выявляют р95—115 и р130—150 (Ас 3 выявляет еще и р34—38). Реакция с р130—150 усиливается при добавлении Ас 2, истощенной экстрактом клеток НЕр-2 в 3М растворе хлорида калия, что, возможно, связано с присутствием в лизатах образцов рака шейки матки рецепторов либо молекул адгезии. Различия в выявлении белков кроличьей Ас р25—67 (р95—97) и мышиной Ас р25—67 (р110—115) может объясняться тем, что кроличья Ас реагирует со зрелым белком (р95—97), а мышиная — с частично процессированным предшественником или тем, что мышиная Ас получена к другому эпитопу.
Истощение Ас 2 экстрактом клеток НЕр-2 в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка и плаценты происходит по р26. Методом иммуноблоттинга с помощью Ас 2 в лизатах образцов плаценты выявлен двойной р24, реакция с которым после обработки блотов истощенной Ас 2 полностью не исчезает. Ни Ас 3, ни Ас р25—67 не выявили этот белок в лизатах образцов неизмененной слизистой желудка, плаценты, рака яичников и шейки матки. Показано, что кипячение и обработка 4% раствором 2Р-меркаптоэтанола приводили к исчезновению реакции кроличьей Ас с р95—97. По-видимому, в основе этой иммунной реакции лежат белковые, а не олигосаха-ридные структуры, и разрушение дисульфидных связей тоже отрицательно сказывается на иммунологической реактивности исследуемых Ас.
На фиксированных клетках НЕр-2 с помощью полученных Ас выявлена экспрессия р25, р39, р40—46 и р60, а с помощью МКА Д11 — макрофагального антигена (р140). С помощью МКА 1 в лизатах макрофагов, Т- и В-лимфо-цитов здоровых доноров выявлена экспрессия р32—34 и р65—70. Таким образом, клетки НЕр-2 экспрессируют белки, свойственные клеткам ретикулоэндотелиаль-ной системы. Предполагается, что Ас2, Ас 3, Ас р25—67 и МКА 1 выявляют либо белки CD3/ТCR, мембранные иммуноглобулины ^д), рецепторные комплексы SIgM-BCR, белки семейств классических Е- и Т-кадгеринов совместно с актинсвязывающими белками, либо муциноподобные белки (табл. 3) [5; 13—17; 19; 20].
Методом непрямой иммунофлюоресценции на парафиновых и криостатных срезах неизмененной слизистой желудка выявлены р25, р40—46, р50, р60 и р67. Иммуно-гистохимическая картина, полученная с помощью Ас 2, Ас 3, Ас р25—67, очень похожа на картину, получаемую при выявлении муцинов разной степени зрелости. Полагают, что опухолевые клетки более интенсивно экспрессируют зрелый муцин, чем неопухолевые [17]. В связи с этим мы считаем, что необходимо продолжить данное исследование с целью уточнения локализации и характеристик белков (р25—67) и использования полученных данных для диагностики злокачественных новообразований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Боброва Т. С. Характеристика клеток HеLа и HeLa-подобных клеток // Экспер. онкол. — 1993. — Т. 14. — С. 24—30.
2. Боброва Т. С., Чуев Ю. В. HeLa-ассоциированный антиген-2. Локализация в нормальных и опухолевых тканях // Экспер. онкол. — 1997. — Т. 19. — С. 129—133.
3. Боброва Т. С., Чуев Ю. В., Морозов В. А. Иммунологические и биохимические характеристики семейства белков, ассоциированных с некоторыми карциномами человека // Вестн. РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2001. — №3. — С. 25—31.
4. Боброва Т. С., Чуев Ю. В., Морозов В. А. Мышиные моноклональные антитела к HеLa-ассоциированномy антигену: распределение антигена в лизатах нормальных и опухолевых тканей // Экспер. онкол. — 2000. — Т. 22. — С. 118—125.
5. Иванов Д. Б., Филиппова М. П., Ткачук В. А. Структура и функции классических кадгеринов // Биохимия. — 2001. — Т. 66, №10. — С. 1450—1464.
6. Bobrova T. S., Kryukova I. N., Chuev Yu. V. et al. Antigen shared by HeLa-like human cell line and gastric mucosa // Neoplasma. — 1991. — Vol. 33. — P. 313—322.
7. Bobrova T. S., Smirnov A. V. HeLa-associated antigen-2. I. Identification and properties // Exp. Oncol. — 1997. — Vol. 19. — P. 124—128.
8. Charalabopoulos K., Binolis J., Karkabounas S. Adhesion molecules in carcinogenesis // Exp. Oncol. — 2002. — Vol. 24. — P. 249—257.
9. Charalabopoulos K., Papalimneou V., Evangelou A. et al. Is the E-Cadherin downregulation observed in Helicobacter pylori infection associated with gastric cancer development? An additional element in the disease jigsaw // Exp. Oncol. — 2003. — Vol. 25. — P. 270—273.
10. Gupta S. K., Woda B. A. Ligand-induced association of surface immunoglobulin with the detergent insoluble cytoskeleton may involve alpha-actinin // J. Immunol. — 1988. — Vol. 140. — P. 176—182.
11. Laemmly U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4 // Nature. — 1970. — Vol. 227. — P. 680—685.
12. Leprince C., Draves K. E., Geahlen R. L. et al. CD22 associates with the human surface IgM-B-cell antigen receptor complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1993. — Vol. 90. — P. 3236—3240.
13. Leung E., Kanvar R. K., Kanvar J. R. et al. Mucosal vascular ad-dressin cell adhesion molecule-1 is expressed outside the endothelial lineage on fibroblasts and melanoma cells // Immunol. Cell Biol. — 2003. — Vol. 81, N 4. — P. 320—327.
14. Maenpaa A., Jaaskelainen J., Carpen O. et al. Expression of in-tegrins and other adhesion molecules on NK cells; impact of IL-2 on short- and long-term cultures // Int. J. Cancer. — 1993. — Vol. 53. — P. 850—855.
15. Oshima T., Pavlick K. P., Laroux F. S. et al. Regulation and distribution of MAdCAM-1 in endothelial cells in vitro // Am. J. Physiol. Cell Physiol. — 2001. — Vol. 281. — P. 1096—1105.
16. Petrini M., Emerson D. L., Galbraith R. M. Linkage between surface immunoglobulin and cytoskeleton of lymphocytes may involve Gc protein // Nature. — 1983. — Vol. 306. — P. 73—78.
17. Reis C. A., David L., Nielsen P. A. et al. Immunohistochemi-cal study of MUC5AC expression in human gastric carcinomas using a novel monoclonal antibody // Int. J. Cancer. — 1997. — Vol. 74. — P. 112—121.
18. Rudinskaya T. D., Poltoranina V. S., Baranov V. N. et al. D11, a novel monoclonal antibody specific for human mature macrophages and peripheral blood monocytes // Immunol. Letters. — 1992. — Vol. 33. — P. 1—7.
19. Sasaki M., Elrod J. W., Jordan P. et al. CYP450 dietary inhibitors attenuate TNF-а-stimulated endothelial molecule expression and leukocyte adhesion // Am. J. Physiol. Cell Physiol. — 2004. — Vol. 286. — P. 1—17.
20. Suzuki M., Koseki H., Mizutani Y. et al. Expansion of murine T cells bearing a unique T cell receptor beta-chain in Friend virus-induced tumor in situ // J. Immunol. — 1992. — Vol. 148. — P. 2968—2973.
Поступила 15.02.2006
T. S. Bobrova, Yu. V. Chuev IMMUNOLOGIC AND IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF TUMOR-ASSOCIATED PROTEINS IN PATIENTS WITH OVARIAN, CERVICAL OR GASTRIC CANCERS USING IMMUNE SERA AND MONOCLONAL ANTIBODIES
Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
Study of tumor-associated proteins was performed in tissue specimens from patients with ovarian, cervical or gastric cancers, and in intact gastric mucosa and placenta. The study involved immunoblotting and immu-nohistochemistry using monoclonal antibody 1 and antisera 2 and 3 to HEp-2 cell (laryngeal cancer) proteins and normal gastric mucosa respectively, and antiserum p25—67 to HEp-2 cell individual proteins. Proteins of different molecular weight were discovered in placental and intact gastric mucosal lysates using antisera 2, 3 and p25—67; p95—115 was found in cervical cancer lysates using rabbit antiserum p25—67, and p130—150 was found using antiserum 2 depleted with HEp-2 extract in 3M potassium chloride. Antiserum 2 depletion of p26, p24, p93 and p130 was found in placental and intact gastric mucosal lysates. Increased fluorescence was found in apical cell portion after treatment of some intact gastric mucosal specimens with the same antiserum. Monoclonal antibody D11 was used to discover macrophagal antigen (p140) expression on HEp-2, and antibody 1 helped to find p32—34 and p65—70 in lysates of macrophages, T- and B-lymphocytes from healthy donors. Immunohistochemical study using antiserum p25—67 discovered p25, p50, p60 and p67 expression in intact gastric mucosa. Antisera 2 and 3, rabbit antiserum p25—67 and monoclonal antibody 1 are thought to recognize CD3/TCR complexes, membrane immunoglobulins (SIg), SIgM-BCR, classical proteins from the E- and T-cad-herin family together with antibinding proteins or mucin-like proteins. We think it reasonable to continue this study to define more accurately location and characteristics of proteins as well as to assess potential use of these findings in tumor diagnosis.
Key words: tumor-associated proteins, immunoblotting, immunohistochemical study.
