CC BY
141
© Коллектив авторов, 2007 УДК 616.981.42:576.8.097.3
иммунологические ПАРАЛЛЕЛИ у ЛИЦ, положительно реагирующих на бруцеллез
П.Н. Попов, О.М. Павлова, И.В. Санникова Ставропольская государственная медицинская академия
В очагах бруцеллезной инфекции часто выявляются лица без клинических проявлений болезни, у которых при плановом обследовании или обращении по поводу других заболеваний обнаруживаются положительные серологические реакции на бруцеллез и/или положительная проба Бюрне.
Понятие «положительно реагирующий на бруцеллез» впервые было введено и включено в классификацию бруцеллеза Е.С. Белозеровым [1], который объяснял положительные реакции длительным контактом с возбудителем лиц, находящихся в очаге, сенсибилизацией их и проэпидемичиванием. С иммунологической точки зрения подобный процесс сходен с реакцией организма на введение вакцины. До сих пор данное понятие существует как эпидемиологическое и лица с положительными реакциями на бруцеллез не подлежат регистрации. Однако остается неясной дальнейшая судьба этих пациентов, тем более, что они продолжают находиться в очаге и возможна манифестация процесса за счет реинфекции.
Не изучен иммунопатогенез данного состояния в свете современных достижений науки, а именно не проводилась ПЦР диагностика возбудителя, не изучалось состояние неспецифической реактивности, клеточного и гуморального иммунитета [2, 3]. Изучение иммунопатогенеза, по нашему мнению, даст возможность расшифровать понятие «положительно реагирующие на бруцеллез» и выяснить - не являются ли данные лица больными субклинической формой бруцеллеза. Изучение данной проблемы имеет и важное прогностическое значение.
Материал и методы. Нами наблюдались 74 больных, отнесенных к группе положительно реагирующих на бруцеллез. Возраст пациентов колебался от 19 до 56 лет, преобладали лица трудоспособного возраста (20-49 лет). Мужчин было 48, женщин 26. Все больные - сельские жители, 72% из них работали в животноводстве, многие имели личные подсобные хозяйства (коровы, овцы).
У всех пациентов отсутствовали клинические признаки болезни.
Обследование больных проводилось на базе бруцеллезного центра г. Ставрополя и включало в себя проведение бактериологических исследований крови, серологических исследований (реакция Райта, Хеддль-
сона, РПГА), постановку пробы Бюрне. У всех больных проводилось определение возбудителя методом ПЦР с использованием наборов ООО «Амплисенс» ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (Москва).
Иммунологические исследования проведены у 30 пациентов. Проводилось изучение относительного и абсолютного количества основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток периферической крови (лейкоциты, лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, субпопуляций мононуклеарных клеток с фенотипом СD3, CD4, CD8, CD16, CD21), определение IgA, IgM, IgG, HCT-теста. Контрольную группу составили 30 здоровых лиц.
У 20 пациентов определяли уровень продукции цитокинов - ФНОа, ИЛір, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6 методом иммуноферментного анализа на планшетном фотометре «Labsystems IEMS Reader MF» (Финляндия) с помощью наборов реагентов ТОО «Протеиновый контур» (Россия). Контролем служили 20 практических здоровых людей.
Статистическая обработка результатов проводилась на компьютере PENTIUM IV с использованием программы «Primer Biostatistic 4.03 for Windows».
Результаты и обсуждение Положительная реакция Хеддльсона была выявлена у 54 больных (72,9±5,2%), резко положительная - у 6 (8,1±3,2%), реакция была отрицательной у 14 пациентов (18,0±4,6%). Реакция Райта была слабо положительной у 9 (9,5±3,4%) больных, у остальных она была отрицательной. РПГА в титрах 1:50 и 1:100 определялась у 15 (19,1±4,6%) пациентов. Сомнительная проба Бюрне наблюдалась у 20 (27,0±5,2%), слабо положительная -у 25 (33,8±5,5%) положительно реагирующих лиц. Обращает внимание, что ДНК бруцелл в периферической крови положительно реагирующих лиц выявлялась у 7 (17,5±6,0%) больных.
Бактериологическим методом ни у одного из обследованных бруцелла выделена не была. Это подтверждает высокую диагностическую ценность ПЦР при бруцеллезе в целом и, в частности, у положительно реагирующих на бруцеллез по сравнению с общепринятыми методами диагностики. Положительный результат данного метода позволяет отнести положительно реагирующих лиц к больным субклинической формой бруцеллеза.
И оригинальные исследования. инфекционные болезни
Изучение неспецифической реактивности показателей клеточного и гуморального иммунитета у лиц, положительно реагирующих на бруцеллез, позволило выделить ряд существенных изменений в иммунном статусе.
Количество лейкоцитов в периферической крови у обследованных лиц составляло 5,94±0,35х109/л, что достоверно не отличалось от нормы (6,18±0,25х109/л, Р>0,05). Аналогичным образом не отличалось от данных контроля процентное содержание и абсолютное количество нейтрофилов (61,5±1,19% и 3,69±0,25х109/ л соответственно), а также относительное и абсолютное количество лимфоцитов (33,3±1,23% и 1,95±
0,12х109/л, Р>0,05).
В отличие от этого процентное содержание моноцитов в периферической крови у лиц с положительной реакцией на бруцеллез составило 2,73±0,3%, что было достоверно ниже нормы (5,53±0,39%, Р<0,001). Абсолютное количество моноцитов у обследованных пациентов также было достоверно снижено (соответственно 0,17±0,02х109/л и 0,34±0,03х109/л, Р<0,001).
Таким образом, у пациентов, положительно реагирующих на бруцеллез, при определении процентного и абсолютного содержания основных иммунокомпе-тентных клеток периферической крови выявлено достоверное снижение процентного и абсолютного количества моноцитов. Это, видимо, является следствием миграции моноцитов из крови в ткани и проявлением неспецифический реакции иммунитета на инфекционный агент.
При изучении субпопуляционного состава моно-нуклеарных клеток периферической крови с использованием моноклональных антител были получены следующие результаты.
Процентное содержание СD3 лимфоцитов составило у обследованных пациентов 53,2±1,25%, будучи не отличимым от нормы (55,1±0,84%). Абсолютное количество CD3 лимфоцитов составило 1,12±0,05х109/л, что было достоверно ниже нормальных значений (1,31±0,06х109/л, Р<0,05).
Процентное содержание CD4 лимфоцитов у обследованных лиц не отличалось от нормы (40,4±0,82% и 42,4±1,09%). При этом абсолютное количество CD4 лимфоцитов было достоверно снижено (0,85±0,05х109/л и 1,01±0,04х109/л соответственно, Р<0,05).
Не отличалось от нормальных показателей процентное и абсолютное количество CD8 (12,0±0,43% и
0,29±0,02х109/л), а также процентное содержание и абсолютное количество CD21 лимфоцитов (10,3±0,77% и 0,22±0,02х109/л).
Процентное содержание CD16 лимфоцитов у положительно реагирующих на бруцеллез лиц составило 6,3±0,23%, что характеризовалось достоверным повышением (5,2±0,28%, Р<0,01). Абсолютное количество этих клеток достоверно от нормы не отличалось (0,13±0,01х109/л и 0,12±0,01х109/л, Р>0,05).
Таким образом, у пациентов, положительно реагирующих на бруцеллез, наблюдается снижение абсолютного количества CD3 и CD4 лимфоцитов и увеличение процентного содержания CD16 лимфоцитов, что свидетельствует о имеющихся нарушениях Т-кле-точного иммунитета.
Поскольку количественные показатели субпопуляций иммунокомпетентных клеток не позволяют достоверно судить об их функциональной активности
и характере межклеточных взаимосвязей, у положительно реагирующих на бруцеллез лиц была изучена активность нейтрофилов по данным НСТ-теста, активность макрофагов на основании продукции ИЛ1Р и ФНОа, а также активность гуморального иммунитета путем определения ^ в сыворотке крови, уровня ИЛ4 и ИЛ6 и активности клеточного иммунитета по количеству синтезированных ИЛ2 и ИЛ4.
Активность нейтрофилов, по данным спонтанного НСТ-теста, составила у обследованных пациентов 21,8±0,95%, что было достоверно выше нормы (16,1±0,78%, Р<0,001). Стимулированный НСТ-тест был снижен (соответственно 46,7±1,29% и 52,5±1,84%, Р<0,05). В норме стимулированный НСТ-тест превышает спонтанный в 3,3 раза. У положительно реагирующих лиц стимулированный НСТ-тест возрастал в 2,1 раза, (Р<0,001). Это свидетельствует о снижении компенсаторно-приспособительных реакций у лиц, положительно реагирующих на бруцеллез.
Уровень ^А у обследованных пациентов достоверно превышал норму (соответственно 1,33±0,1г/л и 1,03±0,06 г/л, Р<0,05). Уровень ^М и IgG составил соответственно 2,66±0,11 г/л и 18,32±1,24 г/л, что достоверно не отличалось от нормальных значений (2,84±0,13 г/л и 15,41±1,02 г/л соответственно).
Базальная и стимулированная продукция ФНОа у положительно реагирующих на бруцеллез составила 1187±30,63 и 3366±237,3 пкг/мл и достоверно не отличалась от нормы (1364±113,5 и 3286±24,52 пкг/мл). В норме в ответ на стимуляцию синтез ФНОа моно-нуклеарными клетками возрастал в три раза, тогда как у положительно реагирующих лиц - в 2,5 раза, что свидетельствует о некотором снижении компенсаторных возможностей макрофагов. Уровень базальной и стимулированной продукции мононуклеарными клетками ИЛ1В составил 151,1±8,13 и 313,5±32,79 пкг/мл, что не отличалось от нормы (156,1±8,1 и 296,1±16,7 пкг/мл соответственно).
Таким образом, у положительно реагирующих на бруцеллез лиц активность макрофагов, по данным изучения продукции ФНОа и ИЛ1В, не претерпевает существенных отклонений от нормы.
При определении синтеза ИЛ2, отражающего активность Т-хелперов, выявлено, что базальная продукция его снижена и составляет 167,4±7,34 пкг/мл, (в норме 148,6±4,27 пкг/мл, Р<0,05). Стимулированная продукция ИЛ2 была также ниже нормы (174,7±5,43 и 232,9±7,86 пкг/мл соответственно, Р<0,001). В норме после стимуляции уровень ИЛ2 возрастал в 1,4 раза. У положительно реагирующих на бруцеллез продукция ИЛ2 повышалась в ответ на стимуляцию в 1,2 раза, что указывает на снижение резерва активности Т-хелперов, которые обеспечивают дифференцировку Т-лимфоцитов в реакции специфической клеточной цитотоксичности.
Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ4 у обследованных лиц составляла соответственно 24,3±0,45 и 34,1±1,3 пкг/мл, что достоверно не отличалось от нормы (25,5±0,82 и 36,9±1,15 пкг/мл). В ответ на стимуляцию синтез ИЛ4 у обследованных лиц возрастал соответственно уровню у здоровых (в 1,4 раза).
Для оценки активности дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки оценивалась спонтанная и стимулированная продукция ИЛ6 в сме-
шанной культуре мононуклеарных клеток периферической крови in vitro. Результаты определения данного цитокина показали, что его спонтанная и стимулированная продукция в случаях положительной реакции на бруцеллез составила соответственно 8746±99,2 и 9336±93,6 пкг/мл, что не отличалось от нормы (8876±77,66 и 9470±94,95 пкг/мл). Это свидетельствует о сохранении резервных возможностей стимуляции В-лимфоцитов у обследованной категории лиц.
Резюмируя полученные результаты можно констатировать следующее. У обследованных лиц, положительно реагирующих на бруцеллез, выявлено умеренное увеличение количества CD16 лимфоцитов, повышение активности нейтрофилов по данным НСТ-теста и увеличение продукция IgA, что свидетельствует об увеличении неспецифической реактивности. В то же время снижение абсолютного количества моноцитов, CD3 и CD4 лимфоцитов на фоне низкой продукции ИЛ2 указывает на нарушение специфической клеточной цитотоксичности.
Таким образом, наличие у 17,5% лиц, положительно реагирующих на бруцеллез, умеренно выраженных изменений субпопуляционного состава и функциональной активности иммунокомпетентных клеток периферической крови позволяет утверждать, что по меньшей мере часть из этих пациентов следует рассматривать как больных бруцеллезом с субклини-ческим течением болезни. При положительных эпидемиологических данных им необходимо устанавливать профессиональный характер заболевания.
Выводы
1. ПЦР-диагностика бруцеллеза является арбитражным тестом в диагностике субклинических форм болезни у положительно реагирующих на бруцеллез. В 17,5% случаев положительно реагирующие лица являются больными субклинической формой бруцеллеза.
2. У положительно реагирующих на бруцеллез лиц наблюдается умеренное повышение неспецифической реактивности иммунной системы за счет увеличения функции нейтрофилов и снижения активности клеточного иммунитета (уменьшения количества и функциональной активности Т-хелперов). Существенных изменений гуморального иммунитета не выявлено.
3. Полученные данные позволяют с новых позиций трактовать иммунопатогенез у положительно реагирующих на бруцеллез и подвергнуть сомнению определение данного понятия только как эпидемиологического.
4. Положительно реагирующие на бруцеллез лица подлежат диспансерному наблюдению в течение года, а в очагах бруцеллеза - до 3-5 лет. При обследовании данных пациентов наряду с общепринятыми методами рекомендуется включить ПЦР- диагностику и тесты для оценки неспецифической реактивности организма и состояния клеточного иммунитета.
иммунологические ПАРАЛЛЕЛИ у ЛИЦ, положительно реагирующих на бруцеллез
П.Н. ПОПОВ, О.М. ПАВЛОВА,
И.В. САННИКОВА
У 74 пациентов, отнесенных к группе «положительно реагирующих» на бруцеллез, изучены диагностическая ценность серологических методов, проба Бюрне и метода ПЦР для определения ДНК бруцелл. У 30 пациентов определялся субпопуляционный состав и функциональная активность им-мунокомпетентных клеток периферической крови (CD3, CD4, CD8, CD16, CD21, НСТ-тест IgA, IgM, IgG, ФНОа, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6). Полученные данные позволяют с новых позиций трактовать иммунопатогенез у лиц положительно реагирующих на бруцеллез и подвергнуть сомнению определение данного понятия только как эпидемиологического. Определение возбудителя методом ПЦР в 17,5% случаев дало положительные результаты, что позволяет отнести данных лиц к больным субклинической формой болезни. У обследованных выявлено снижение клеточного иммунитета без существенных изменений гуморального.
Ключевые слова: бруцеллез, положительно реагирующие на бруцеллез, иммунопатогенез
IMMUNOLOGICAL PARALLELS IN PATIENTS WITH POSITIvE REACTIONS TO BRUCELLOSIS
popov p.n., pavlova O.M., sannikova i.v.
Diagnostic value of serologic methods, Bume tests and polymerase chain reaction (PCR) was investigated in 74 adult patients related to the group of «positively reacting» on brucellosis. Subpopulation structure of immunocompetent cells of peripheral blood (CD3, CD4, CD8, CD16, CD21, HCT-test, IgA, IgM, IgG, IL2, IL4, and IL6) was investigated in 30 patients. The received data allow to discuss from new positions immunopathogenesis in the persons «positively reacting» on brucellosis and to call in question definitions of the given concept only as an epidemiological one. PCR was positive in 17,5 % of cases allowing to diagnose subclinical form of the disease. Reduction of cellular immunity without essential changes of humoral immunity has been revealed in the examined patients.
Key words: brucellosis, «positively reacting», immun-opathogenesis
Литература
1. Белозеров, Е.С. Бруцеллез / Е.С. Белозеров. - Л.: Медицина, 1985.- 184 с.
2. Нагоев, Б.С. Очерки о нейтрофильном гранулоците / Б.С. Нагоев. - Нальчик, 1986. - 168 с.
