Иммунологические методы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская иммунология 2001, Т. 3, №2 © 2001, СПб РО РА АКИ

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

КЛИНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНЫХ РЕАКЦИЙ

Базарный В.В., Петрович Н.С., Левчик Н.К., Беспалова В.В., Цвиренко С.В.

Уральская государственная медицинская академия, Областная клиническая больница Л? 1, Уральский НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии; г.Екатеринбург

Среди лабораторных иммунологических тестов, характеризующих резистентность организма, особое место занимают показатели фагоцитоза. Вследствие своей неспецифично-сги они весьма лабильны, поэтому быстро и заметно реагируют на различные патогены еще до появления развернутых признаков заболевания. Однако следует признать, что экстраполяция данных о состоянии фагоцитарного звена иммунной системы в клиническую практику представляет определенные сложности. Это определило цель нашей работы - оценить клинико-диагностическое значение стандартных показателей состояния нсйтрофилов - основных фагоцитов периферической крови.

Нами проведено обследование 165 пациентов с урогенитальным хламидиозом и 85 пациентов с заболеваниями суставов различной природы. Фагоцитарную активность нейт-рофилов оценивали по их способности поглощать инертные частицы латекса или эритроциты (формалииизированные и сенсибилизированные специфическим антигеном). Кислородный метаболизм нсйтрофилов изучали в ИСТ-тесте (спонтанном и стимулированном), учет реакции проводили фотометрически. У пациентов с урогенитальным хламидиозом также определяли интенсивность дегрануляции нейтрофи-лов (по секреции лизоцима) после контакта с специфическим антигеном. Цитохимически оценивали активность мие-лопероксидазы и катионных белков. Для изучения соотношения общих и локальных фагоцитарных реакций указанные параметры изучали одновременно в крови и синовиальной жидкости.

На основании проведенных исследований было установлено, что показатели состояния фагоцитов периферической крови характеризуют, прежде всего, активность патологического процесса (при этом обнаружена высокая корреляция с уровнем острофазовых реак гантов) и отражают его динамику. Также показано, что локальные фагоцитарные реакции (в синовиальной жидкости при артритах) более выражены по сравнению с системными. Определенные изменения фагоцитарной активности (поглотительная способность, миелоперокеидаза, стимулированный НСТ-тсст) позволяют оценивать эффективность терапии хламидийпой инфекции до получения клинико-лабораторной верификации санации. Нарушение дегрануляции нейтрофилов при урогенитальном хламиднозе позволяет прогнозировать развитие осложнений заболевания.

Таким образом, показатели состояния фагоцитов периферической крови целесообразно включать в лабораторный мониторинг для оценки активности процесса, прогнозирования эффективности терапии и возможности развития осложнений.

РАЗРАБОТКА СКРИНИНГ-ТЕСТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В КРОВИ ТИРОКСИНА И 17а-ГИДР0КСИПР0ГЕСТЕР0НА НА ОСНОВЕ ЛАНТАНИДНОГО ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА

Бекман Н.И., Ларичева С.Ю.

ГНИИ биологического приборостроения,

Москва, Россия

Ранняя диагностика врожденных заболеваний позволяет своевременно проводить эффективную терапию и предотвращать тяжелые неврологические и метаболические нарушения развития ребенка. К числу наиболее серьезных патологий относятся врожденный гипотиреоз и врожденная гиперплазия надпочечников, важнейшими маркерами которых являются, соответственно, пониженный уровень тироксина (Т4), и повышенный уровень 17а-гидроксипрогестерона (17 ОН-Р) в крови. Для постановки диагноза в первые дни жизни ребенка до появления развернутой клинической картины заболевания необходим скрининг новорожденных на содержание этих гормонов в крови.

Целью данной работы была разработка высокочувствительных и специфичных количественных тестов на содержание гормонов Т4 и 17 ОН-Р в крови человека на основе метода диссоциативно-усиленного лантанидного флуоресцентного иммуноанализа (ЛИФА).

Для выявления обоих низкомолекулярных гормонов используется конкурентный твердофазный иммуноанализ с применением меченых европием специфических антител к гормонам и конъюгатов гормонов с белком-носителем, сорбированных на планшет для микротитрования. Флуоресценция ионов европия измеряется после экстракции в усиливающий раствор. Результаты анализа регистрируются с помощью флуориметра с временным разрешением на длине волны 615 нм. Интенсивность флуоресценции обратно пропорциональна количеству гормона в образце. В качестве образцов могут быть использованы как сухие пятна крови, так и сыворотка крови человека. В иммуноанализе Т4 используются моноклональные антитела к тироксину, тогда как в иммуноанализе 170Н-Р - высокоспецифичные поликлональные антитела, перекрестная реакция которых с прогестероном составляет менее 0,01%.

Применение ЛИФА позволило проводить измерение гормонов в клинически значимом интервале концентраций (0 -100 нг/мл - для 17 ОН-Р , и 0 - 300 нг/мл сыворотки - для Т4). Чувствительность определения концентрации Т4 в пятне крови диаметром 3 мм (3 мкл крови) - менее 0,15 нг в пересчете па мл сыворотки.

Параллельное измерение концентрации Т4 в сухих пятнах крови новорожденных (исследовано 73 образца) разработанным методом и набором ”Delfia1M Neonatal Thyroxine (Т )” (Финляндия), показало наличие корреляции результатов (г=0,94, р=0,01). Разработанные скрининг-тесты для количественного определения уровня тироксина и 17а-гидроксип-рогестерона в крови человека методом лантанидного имму-нофлуоресцентиого анализа положены в основу создаваемых в настоящее время тест-систем для ранней диагностики врожденных аномалий у новорожденных.

К ОЦЕНКЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЯКУЛЯТА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ПРОСТАТИТОМ

Бобков Ю.А., Галкина О.В., Горбачев А.Г., Аль-Шукри С.Х., Тотолян А.А.

Санкт-Петербургский Государственный университет им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Россия

Введение. Предположить о наличии воспаления предстательной железы можно, прежде всего, по характеру изменений показателей эякулята, характеризующих состояние местного иммунного ответа (лейкоциты, иммуноглобулины, ци-токины). Однако изменение иммунологических показателей, определяемых в биологических жидкостях, могут быть связаны с различными факторами (состояние гистогемагическо-го барьера и т.д.). Основной целью работы явилось определение факторов, влияющих на изменений иммунологических показателей эякулята у больных хроническим простатитом.

Материалы и методы. Был исследован эякулят и сыворотка крови 35 больных хроническим простатитом в возрасте от 18 до 58 лет. Произведен подсчет лейкоцитов в эякуляте. С помощью иммуноферментных тест-систем была определена концентрация 1§А, ^М, 1§0, 1^Е, подклассов 1«0 (1цС 1,

1§02, ^вЗ и ^С4), интерлейкина-8, альбумин определялся фотометрическим способом. Определение альбумина в эякуляте и в крови было проведено для оценки состояния гисто-гематического барьера в предстательной железе на основании того, что альбумин синтезируется гепатоцптами и может попасть в эякулят только из кровотока.

Основные результаты. При проведении корреляционного анализа были выявлены положительные корреляционные связи между концентрациями ^А (г=0,39; р<0,05). ^в2 (1-0,82; р<0.0001), 1§вЗ 0-0.62; р<0,005) в сывортке крови и в эякуляте. Зависимости между концентрациями иммуноглобулинов других классов и подклассов, а также альбумином в исследуемых жидкостях не получены. Однако выявлены взаимосвязи между содержанием альбумина и в^А (1-0,89; р<0,05), и ^А (г=0,55; р<0,005), 1цС1 и (г=0,55; р<0,05), а при про-иведенпи многофакторного анализа было установлено, что основной фактор состоит из концентрации альбумина, 1«0, в^А,

1, ^03. Полученные результаты можут быть объяснены тем, что эякулят является биологической жидкостью, состоящей из секрета нескольких половых желез, объемы которых могут значительно варьировать, и его многокомпонентность может оказывать влияние на концентрации иммуноглобулинов. Влиянием мнокомпонентности эякулята можно объяснить и отсутствие зависимостей между концентрацией иммуноглобулинов, интерлейкина-8 и количеством лейкоцитов в эякуляте. Однако при помощи множественного регрессионного анализа была установлена взаимосвязь между количеством лейкоцитов, содержанием альбумина и ^СЗ в эякуляте у больных хроническим простатитом: ^СЗ = -0,346 + 0,55 х (альбумин)2+ 0,01 х (количество лейкоцитов)2 (Я:=0,48; Р=7,36; р<0,01). На основании полученной зависимости можно говорить о том, что повышение концентрации иммуноглобулина ^03 в эякуляте может быть связано как и с увеличением количества лейкоцитов, характеризующих активность воспалительного процесса, так и с увеличением концентрации альбумина. Зависимость содержания ^СЗ от концентрации альбумина свидетельствует о влиянии объема секрета половых желез на концентрацию данного иммуноглобулина.

Выводы. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том что на значения иммунологических показателей

эякулята может оказывать влияние высокая степень варьирования объема секрета предстательной железы и семенных пузырьков, что необходимо учитывать при оценке результатов иммунологического исследования эякулята.

ОПТИМИЗАЦИЯ ОПТИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ ПОВЕРХНОСТНОГО ПЛАЗМ0НН0Г0 РЕЗОНАНСА ПУТЕМ БИОХИМИЧЕСКОЙ ПАССИВАЦИИ СЕНСОРНОЙ ПОВЕРХНОСТИ

Болтовец П.Н., Костюкевич Е.В., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М.

Институт физики полупроводников НАН Украины, Киев, Украина

Введение. Одним из наиболее динамично развивающихся направлений биосенсорики является разработка приборов на основе оптоэлектронных чувствительных элементов использующих эффект поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Данный метод является прямым, количественным и недеструктивным, он позволяет наблюдать за иммунохими-ческим взаимодействием в реальном режиме времени и не требует радиоактивной либо флюоресцентной метки. Однако, при использовании подобного типа систем основной задачей является сохранение нативного состояния биомолекул на поверхности сенсора, поскольку немодифицированная металлическая пленка может оказывать деструктивное влияние на молекулы, а именно: непосредственный контакт с металлической поверхностью может привести к денатурации молекул; рецепторные центры ориентированы произвольным образом; при таком способе иммобилизации наблюдается высокий уровень неспецифического связывания. Для преодоления этих проблем необходимо формирование промежуточного буферного слоя между поверхностью металла и белком.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка такого способа модификации поверхности металлической (в данном случае золотой) пленки, который, будучи прозрачным для лучей света, обеспечивал бы надежную изоляцию биологических молекул от поверхности золота, в от же время не оказывая деструктивного влияния на саму эту поверхность. С этой точки зрения представляется рациональной предварительная обработка золотой пленки в парах сероводорода, поскольку при этом образуется прочная связь между атомами золота и серы, что позволяет сформировать плотноупакованный защитный слой на поверхности золота.

Материалы и методы. Исследования проводились с помощью ППР-спектрометра “ПЛАЗМОН” (источник возбуждения GaAs лазер, Л=670 нм), разработанном в Институте физики полупроводников НАН Украины. Стеклянные пластинки (/; =1,61) со свеженапыленным через промежуточный адгезивный слой хрома (1-1,5 нм) слоем золота (50 нм) предварительно обрабатывались смесью “пиранья” (H,0,-H2S04 в соотношении 1:3) для удаления органических загрязнений. Обработанные таким образом пластинки закреплялись на поддерживающей стеклянной призме (/? =1,61) при помощи иммерсионной жидкости (полифениловый эфир, /) =1,6). Фосфатный (pH 7,2) и глициновый (pH 2,2) буферы готовились по стандартным методикам. В качестве модельной системы использовались куриные иммуноглобулины (ChlgG) и кроличьи антитела к ним (AntiChlgG) (“Sigma”). Для формирования на поверхности золота сероводородной пленки пластинки выдерживались в герметически закрытой камере в атмосфере сероводорода, создаваемой химической реакцией FeS+HCl в течение суток.

Основные результаты. Исследования проводились следующим образом: на предварительно обработанную в парах сероводорода поверхность сенсора наносился раствор AntiChlgG, после отмывания буфером несвязавшегося белка вносился раствор ChlgG п проводилась реакция взаимодействия антиген-антитело. Контрольный эксперимент проводился на не обработанной поверхностти золота. Специфичность связывания контролировалась посредством обработки поверхности глициновым буфером (pH 2,2): в случае специфического связывания ChlgG полностью смывался с поверхности, в случае неспецифнческого связывания разрыва связи не происходило. Было показано, что лишь в случае предварительной обработки поверхности золота в парах сероводорода связывание получается истинно специфичным, а следовательно сохраняется нативное состояние биомолекул.

Заключение. Предложенный способ формирования биохимических структур на поверхности оптического преобразователя открывает новые возможности для разработки био-сенсорных методов, пригодных для быстрой и количественной диагностики иммунопатологических процессов.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТОЯНИЯ ИММУНИТЕТА ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КРУПНЫХ БРОНХОВ В НОРМЕ

Боровская Т.Ф., Курпас Э.Х., Горнславец С.Н., Рыбальченко Я.Н., Волков А.В., Фролова Е.А.

Хабаровский филиал ДНЦ ФПД СО РАМИ - НИИ охраны материнства и детства, 301 Окружной клинический военный госпиталь,

Хабаровск, Россия

Введение. Иммунная система слизистых формирует защитный барьер, предохраняющий организм хозяина от различного рода чужеродных агентов, в том числе от болезнетворных воздействий различной патогенной и условно-пато-генной микрофлоры (Беляков И.М., 1997). В связи с этим слизистые оболочки как барьерные органы участвуют в презентации организму антигенов не только при патологии, но и в норме. Поэтому в их структуре заложены компоненты иммунной системы.

Цель исследования. Определить количественный состав различных типов иммунокомпетентных клеток в периферической крови и слизистой оболочке крупных бронхов в группе здоровых лиц.

Материал и методы. С помощью моноклональных антител изучали состояние клеточного звена иммунитета в слизистой оболочке крупных бронхов и периферической крови у здоровых лиц. Забор кусочков слизистой оболочки крупных бронхов производили при использовании бронхоскопа Olympus BF type ГГ-10 (Япония) на уровне среднедолевого и нижнедолевого бронхов справа биопсийными щипцами Moden ЕВ-20С. Выделение лимфоцитов из ткани проводили по методу C.J1, Несгерчук с соавт. (1994). Результаты учитывали на проточном цитофлюориметре FACScan фирмы “Becton Dickinson”.

Основные результаты. Сравнительный анализ показателей клеточного звена иммунитета периферической крови здоровых (п= 137) и слизистой оболочки крупных бронхов у лиц, не имевших обострения хронического бронхита в течение последних двух лет (группа контроля) (п=19), показал наличие в слизистой оболочке крупных бронхов значительного увеличения относительного числа лимфоцитов (48,35±3,12%)

в структуре общего количества лейкоцитов (2,71 ±0,27 х 101' г/ л гомогената ткани слизистой). При этом в слизистой оболочке крупных бронхов на фоне уменьшения процентного содержания Т-лимфоцитов (34,08±4,45%) (р<0,01) имеет место увеличение уровня лимфоцитов, несущих на мембране клеток антигены CD22* (43,4718,83) (р<0,001), CD25+ (41,90±8,03) (р<0,001), CD16 (31,6±5,74) (р<0,05) по сравнению с показателями периферической крови. Количество Т-хелперов (CD4 ) и Т-супрессоров (CD8 ) и, соответственно, иммунорегулятор-ный индекс (CD4 /CD8 ) был аналогичен показателям периферической крови.

Заключение. По-видимому, постоянное антигенное воздействие, которому подвергаются слизистые оболочки легочной системы вне заболевания, является одной из причин, стимулирующих защитные функции иммунной системы, ассоциированной со слизистыми оболочками, что проявляется высоким содержанием клеток цитолитического и цитотокси-ческого ряда, а также Т-лимфоцитов в слизистой оболочке бронхиального дерева, в частности, крупных бронхов.

ПРОЦЕНТНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК (ИК)

ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ИЗМЕНЕНИЙ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КРУПНЫХ БРОНХОВ (СОКБ)

ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОМ ПРОЦЕССЕ

Боровская Т.Ф., Курпас Э.Х., Рыбальченко Я.Н., Волков А.В., Горнславец С.Н., Бачалдин C.J1.

Хабаровский филиал ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства, 301 Окружной клинический военный госпиталь, Дальневосточный государственный медицинский университет, Хабаровск, Россия

Введение. Участие иммунной системы в развитии воспалительного процесса слизистых оболочек в настоящее неоспоримо. Но до сих пор актуальным остается вопрос, какие ИК играют роль в формировании необратимых изменений слизистой, а какие из них участвуют в восстановлении ее структуры.

Цель исследования. Определить роли типов ИК в сохранении структурного гомеостаза СОКБ при воспалительном процессе.

Материалы и методы. Материалом для исследования служили бронхобиоптаты СОКБ 78 больных острой пневмонией. Клоны ИК в биоптатах СОКБ определяли с помощью МКА фирмы Caltag (Burlingame, СА) на проточном цитометре FACScan фирмы Beckton Dickinson (США). Процессы клеточного деления изучали методом авторадиографии (Епифанова О.И. с соавт., 1977). Для определения степени выраженности патоморфологических изменений использовали морфологические и морфометрические методы (Автандилов Г.Г., 1990).

Основные результаты. Проведенные исследования позволили выявить 5 вариантов структурных особенностей слизистой. Первый вариант изменений СОКБ характеризовался низким уровнем пролиферативной активности, увеличением числа бокаловидных клеток в высоком многорядном цилиндрическом эпителии, а также выраженной клеточной инфильтрацией собственной пластинки. Меченые №-тимидином эпите-лиоциты располагались в базальном слое. При этом регистрировали максимальое содержание CD3 ,CD14 клеток, высокое

- CD20 , и низкое - CD8+, CD 16*, CD7+, CD5 лимфоцитов.

Иммунорегулято^ный индекс (ИРИ) составил 2,55 за счет снижения числа CD8 клеток, а уровень ИК, несущих маркер апоп-тоза (CD95 ), был в пределах средних значений. При втором варианте структурных изменений СОКБ регистрировали высокий уровень пролиферативной активности при умеренном повышении количества бокаловидных клеток и межэпители-альных лимфоцитов (МЭЛ) в кубическом многорядном эпителии с формированием папиллом. Меченые Н3-тимидином эпи-телиоциты располагались в средней трети эпителиальной выстилки. Уровень ИК не удалось определить. Для третьего варианта было характерно: низкий уровень пролиферативной активности эпителия при высокой интенсивности мечения, наличие единичных бокаловидных клеток и минимального количества МЭЛ в метаплазированном кубическом многорядном эпителии. Меченые Н3-тимидином клетки располагались в основном в среднем и поверхностном слоях эпителия. Данный вариант состояния СОКБ формируется за счет участия ИК, несущих на мембране CD5 , CDllb , HLA-DR, а также CD3 , CD7*, CD45*, CD95 . ИРИ при этом составил 1,64. Высокая степень деструкции СОКБ при четвертом варианте изменений в виде плоского неороговевающего эпителия с интенсивным мечением эпителиоцитов сопровождалась дисбалансом ИК, несущих на мембране лимфоцитов CD20 , CD4 , CD95 , CD25 , CD 16* (максимальный уровень), CD8 (минимальное количество). Соотношение субпопуляций CD4 /CD8 составило 3,73 за счет резкого увеличения CD4 при минимальном количестве CD8 . Меченые Н3-тимидином клетки располагаются в один слой, сразу над базальной мембраной. Пятый вариант характеризовался наличием участков эпителиальной выстилки в виде камбиальных клеток с элементами мечения Н3-тимидином и без них. Уровень пролиферативной активности эпителия был низким. Клеточные элементы в незначительном количестве равномерно распределены в собственной пластинке СОКБ. При этом преобладали на мембране CD8 , CD95 , CD38 при минимальном количестве CD3 , CD20 , CD14 , CDllb . ИРИ был низким (0,96) за счет высокого уровня CD8 .

Заключение. В патогенезе воспалительного процесса одна из ведущих ролей принадлежит иммунным механизмам. Местная клеточная защита формируется межклеточными взаимодействиями клеток лимфоидного и гранулоцитарно-макро-фагального ряда, эпителиальной выстилки. В зависимости от их количества в очаге поражения и функциональных потенций формируются патоморфологические изменения структуры СОКБ той или иной степени выраженности. Показано, что варианты морфологических изменений являются стадиями обновления эпителиальной выстилки и восстановления структуры СОКБ в динамике патологического процесса.

ПОКАЗАТЕЛИ ТКАНЕВОГО (МЕСТНОГО) ИММУНИТЕТА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ АНТРАЛЬНОГО ОТДЕЛА ЖЕЛУДКА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ АКТИВНОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА У ДЕТЕЙ

Боровская Т.Ф., Наумова JI.A., Рыбальченко Я.Н.

Хабаровский филиал ДНЦ ФПД СО РАМН -НИИ охраны материнства и детства, г. Хабаровск, Россия

Введение. Значительная распространенность болезней органов пищеварения, в том числе желудка и двенадцатиперстной кишки, у детей и склонность их к дальнейшему росту, а так же затяжному, рецидивирующему течению в значительной мере связана с состоянием иммунологической реактивности организма.

Цель. Выявить взаимосвязь определенных иммунокомпе-тентных клеток с уровнем активности воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка у детей с хроническими гастродуоденитами в периоде обострения.

Материалы и методы. Материалом для исследования служили биоптаты слизистой оболочки антрального отдела желудка 30 детей (средний возраст- 11,04±0,12 лет) с хронической гастродуоденальной патологией в периоде обострения (до лечения). Тип иммунокомпетентных клеток в биоптатах определяли с помощью МКА фирмы Caltag (Burlingame, СА) на проточном цитометре FACScan фирмы Beckton Dickinson (США). При определении степени выраженности патоморфологических изменений слизистой оболочки желудка пользовались Сиднейской классификацией и визуально-аналоговой шкалой (Dixon М. et al., 1996).

Основные результаты. Анализ количественного и качественного состава иммунокомпетентных клеток проводили в зависимости от выраженности нейтрофильной инфильтрации

- основного показателя активности воспалительного процесса в слизистой оболочке. Сравнивали показатели клеточного звена иммунитета в слизистой оболочке желудка в трех группах: отсутствие нейтрофилов, слабая и значительная степень выраженности нейтрофильной инфильтрации. Нами выявлена следующая закономерность: при увеличении выраженности нейтрофильного инфильтрата возрастает количество лимфоцитов, экспрессирующих определенные антигены (CD2 , CD7*, CD38+, CD22 , CD50+, HLA-DR). Кроме того, относительное содержание всех лимфоцитов также коррелировало с количеством нейтрофилов в инфильтрате - до 95,14±19,83% при значительной нейтрофильной инфильтрации. При значительной степени инфильтрации регистрировали статистически значимые отличия от соответствующих показателей клеточного иммунитета слизистой оболочки больных с отсутствием нейтрофильного инфильтрата как незрелых миелоидных клеток (CD7+=41,60±8,35%), так и зрелых В-(CD22+=42,64±8,20%) и Т-лимфоцитов (CD2 =43,12+10,62%). Отмечали повышение уровня лимфоцитов, несущих на мембране антиген CD50 (ICAM-3) - молекулу адгезии и межклеточного взаимодействия, усиливающую анти-lg индуцированную активацию В-клеток и миграцию лейкоцитов сквозь стенку сосудов в очаг воспаления. Повышалась экспрессия антигенов, характерных для активированных форм лимфоцитов -HLA-DR (31,67+7,23%) и CD38 (плазматические клетки, ти-моциты, активированные Т-клетки, 34,25±7,35%).

Заключение. Таким образом, в острой фазе хронического патологии воспалительного процесса в слизистой оболочке антрального отдела желудка у детей увеличивается содержание иммунокомпетентных клеток различной степени зрелости и дифференцировки в зависимости от активности воспалительного процесса.

СОЗДАНИЕ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА И ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА МЕТОДОМ ЛАНТАНИДНОГО ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА

Быченкова Т.А., Грабкина Г.И., Короткова Н.Н.

ГНИИ биологического приборостроения, Москва, Россия

Количественное определение уровня альфа-фетопротеи-на (АФП) и хорионического гонадотропина (ХГЧ) является основой для диагностики некоторых врожденных аномалий

плода (дефектов нервной трубки, передней брюшной стенки, синдрома Дауна) и различных онкологических заболеваний. Существенной проблемой является использование для диагностики таких тестов, которые удовлетворяют требованиям по чувствительности, специфичности и диапазону измеряемых концентраций. В настоящее время обеспечить широкий диапазон выявляемых концентраций АФП и ХГч (0-1 ООО МЕ/ мл), высокую чувствительность и специфичность способен лантанидный иммунофлуоресцентный анализ (ЛИФА).

Целью данной работы была разработка на основе ЛИФА высокочувствительных и специфичных тестов для определения АФП и ХГЧ в крови человека.

Разработанные тест-системы АФП-ЛИФА и ХГЧ-ЛИФА основаны на принципе иммунофлуоресцентного анализа с использованием двух моноклональных антител с различной эпитопной специфичностью к АФП или ХГЧ. Анализ проводится в одну стадию с образованием иммунного комплекса. Анализируемые пробы образуют сандвич между моноклональными антителами, сорбированным на поверхности полисти-рольных стрипов, и вторыми моноклональными антителами, конъюгированными с ионами европия. Усиливающий раствор позволяет диссоциировать ионам европия из иммунного комплекса с образованием сильно флуоресцирующих хелатов с компонентами раствора. Интенсивность флуоресценции ионов европия прямо пропорциональна количеству АФП и ХГЧ в образце. Результаты анализа регистрируются с помощью флу-ориметра с временным разрешением на длине волны 615 нм.

Применение ЛИФА позволило проводить определение маркеров в сыворотке крови в широком интервале концентраций (0-1000 МЕ/мл - для АФП , 15-1000 МЕ/ л - для ХГЧ).

При параллельном измерении концентраций ХГч в сыворотках крови пациентов (исследовано 78 образцов) установлена корреляция между наборами ХГ'ч-ЛИФА и b-HCG EIA Cobas Core, Швейцария (r=0,90; р=0,01).

Набор АФП-ЛИФА прошел медицинские испытания, в результате которых было установлено соответствие результатов определения АФП в тестируемых образцах (78 образцов) клиническому состоянию пациентов и наличие корреляции с наборами других фирм (“ИФА-АФП”, Алкор-БИО, Санкт-Петербург; AFP-EIA, Cobas Core.Hoffmann - La Roche, Ltd,Швейцария). (1-0.998: p=(),()l).

Набор АФП-ЛИФА рекомендован для серийного производства для внедрения в медицинскую практику.

На основе разработанных методов в настоящее время проводятся исследования по созданию тест-систем для определения АФП и ХГЧ в сухих пятнах крови беременных женщин, что позволит решить проблему пренатального контроля врожденных патологий в России.

АУТОАНТИТЕЛА К ТИРОПЕРОКСИДАЗЕ И ТИРОГЛОБУЛИНУ ЧЕЛОВЕКА КАК НОВЫЕ РЕАГЕНТЫ В ИММУНОАНАЛИЗЕ ТИРЕОИДНЫХ АНТИГЕНОВ

Вашкевич И.И., Киселева Е.П., Сурвнло Л.И., Свиридов О.В.

Институт биоорганической химии НАН Беларуси, г. Минск

Впервые разработаны биохимические системы для радио-иммунного анализа тиропероксидазы (ТПО) и тироглобулина (Тг) человека с использованием специфических аутоантител. Каждая из двух систем включает лиофилизованные препараты аутоантител человека к соответствующему антигену, ра-диойодированного антигена, калибровочных проб на основе

чистых ТПО либо Тг и твердофазный белок А в качестве оса-дителя. Препараты аутоантител к ТПО и Тг получены из предварительно отобранных сывороток больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы методом аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованными антигенами (Тг либо микросомальный антиген). Использование различных титров аутоангител к тиреоидным антигенам позволило создать несколько вариантов систем радиоиммунного анализа ТПО и Тг человека, отличающихся по чувствительности определения и предназначенных для решения конкретных задач клинической диагностики и прикладной биохимии.

Аналитическая система для радиоиммунного анализа ТПО была использована для изучения распределения этого белка по фракциям гомогената ткани щитовидной железы. Выявлены различия в относительных концентрациях ТПО в митохондриях, микросомах и супернатанте в зависимости от диагноза (аутоиммунные заболевания щитовидной железы либо тиреоидные патологии другой природы) и условий хранения ткани. Показана возможность использования объединенной митохондриально-микросомальной фракции гомогената, характеризующейся высоким содержанием ТПО, в качестве источника получения чистой ТПО методами хроматографии с использованием высокоспецифичных антител к этому белку.

СОЗДАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ К (32 - ГЛИКОПРОТЕИНУ 1

Гарбузенко Т.С., Петёвка Н.В., Колесникова Т.С., Чистякова А.В., Кривицкая Н.И., Сальников К.В.

Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови М3 РБ,

Минск, Республика Беларусь

Введение. В настоящее время всё большую актуальность приобретает синдром, описанный Hughes и Harris, в основе которого лежит развитие аутоиммунных реакций к фосфолипидам, находящимся на мембранах эритроцитов, клетках эндотелия сосудов, клетках нервной системы, получивший название антифос-фолипидного синдрома (АФС). Спектр клинических проявлений АФС чрезвычайно разнообразен, поскольку при АФС могут поражаться сосуды любого калибра и локализации. В рамках АФС описаны патология центральной нервной системы, сердечнососудистой системы - поражение клапанов сердца, инфаркт миокарда, атеросклеротическое поражение сосудов, нарушение функции почек и легких и различные формы акушерской патологии самопроизвольные аборты, внутриутробная гибель плода, задержка развития плода, преждевременные роды. В связи с разнообразием клинических проявлений и несвоевременной диагностикой пациенты с АФС безуспешно лечатся у специалистов узкого профиля - кардиологов, ревматологов, невропатологов, акушеров-гинекологов и др., нередко подвергаясь необоснованным манипуляциям. Среди иммунологических тестов наиболее специфичным и позволяющим определить тромбогенный риск при АФС является выявление антител К Р,-гликопротеину I (анти-РДТП). Несомненным достоинством данного теста является высокая его специфичность: наличие высоких титров анти-(3,ГП1 у пациентов с клиническими проявлениями, но при отрицательных результатах анализов на АКА и ВА, позволяет установить диагноз первичного АФС. Кроме того, количественное определение титров антител дает возможность контроля эффективности проводимой терапии.

Цель и методы исследования. Очистка и выделение РДТ11 для создания иммуноферментного метода для выявления анти-Р,ГП1 аутоантител у пациентов с АФС.

Материалы и методы. (3,ГП1 был выделен из пула сыворотки крови человека, как описано Polz et al. (Int. J. Biochem 11: 256-270) методом аффинной хроматографии на гепариновой колонке (Bio-Rad, СА, USA). Связавшиеся белки были элюированы градиентом соли (NaCl 0,03-0,35 М) в Трис-НС1 0,02М pH 8,0. Фракции проанализированы методом электрофореза в 12% ПААГ в нередуцирующих условиях. Фракции, содержащие искомый белок, после диализа были снова нанесены на гепариновую колонку и процедура очистки была повторена. Собранные фракции были диализованы против CH,COONa 0,05М, NaCl 0,05 М, pH 4,8 и нанесены на колонку с карбоксиметилцеллюлозой (Bio-Rad, СА, USA), уравновешенной тем же буфером. Несвязавшийся с карбоксиметилцеллюлозой (З^ГП 1 был собран и чистота проверена электрофорезом в ПААГ.

Основные результаты. Очищенный (3,ГП1 (95% чистоты) был использован для создания иммунофсрментной тест-системы в качестве адсорбированного в лунках микропланшета. Были исследованы различные условия сорбции антигена и условия инкубации образцов сыворотки крови больных с установленным диагнозом АФС и здоровых доноров. В результате наиболее оптимальными оказались следующие условия анализа: антиген сорбировали в лунках микропланшета Maxisorb (Nunc, Denmark) в концентрации 5 f.ig/ml в 0,1 М карбонатном буфере pH 9,6. Неспецифические центры связывания были блокированы 2% раствором желатина (Bio-Rad, СА, USA), образцы сыворотки разводили 1/100 в ФСБ-Твин-

20 0,05% и инкубировали 2 часа при комнатной температуре и непрерывном встряхивании. Далее в лунках инкубировали пероксидазный конъюгат антител против IgG человека (Abbott, Germany). Отмывку производили раствором ФСБ-Твин-20 0,05%. Оптическая плотность в лунках микропланшета, где исследовалась сыворотка больных с установленным диагнозом АФС, в некоторых случаях была выше на порядок по отношению к таковой для здоровых доноров.

Заключение. Исследования показали, что (З^ГП 1 может быть легко выделен из сыворотки крови человека использованием двукратной аффинной очистки на гепариновой колонке и этапа ионообменной хроматографии. С помощью созданного на основе очищенного (3,ГП 1 иммуноферментного метода можно достоверно определить повышение содержания анти-(32ГП1 антител в сыворотке крови больных с клиническими проявлениями АФС, что может быть использовано для дифференциальной диагностики АФС.

ИММУНОМАГНИТНАЯ СЕПАРАЦИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Голенкина Е.А., Иванов П.К., Полосухина Е.Р., Филиппов В.И., Ершов O.JI.

НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН;

НИЦ “МедБиоСпектр”

Иммуномагнитная сепарация является высокоэффективным методом направленного разделения гетерогенных клеточных суспензий. Метод может быть использован для получения чистых популяций гемопоэтических клеток человека, в том числе, редких в циркуляции CD34 клеток-предшественников гемопоэза.

Цель работы. Создание системы иммуномагнитной сепарации для выделения гемопоэтических клеток человека.

Материалы и методы. Полистироловые магнитные микросферы синтезировали методом эмульсионной полимериза-

ции; для получения иммуноспецифических магнитоуправляемых конъюгатов использовали моноклональные антитела к CD3 (ICO-90), анти-С04 (ICO-86), анти-С020 (ICO-180) и анти-С034 (ICO-115), поликлональные антитела барана к Fc-фрагментам иммуноглобулинов мыши (НПЦ ’’МедБиоСпектр”). Селекцию проводили на модельных смесях клеточных линий и мононуклеарных клетках периферической крови здоровых доноров. Эффективность селекции оценивали с помощью иммунофлуоресцентного анализа экспрессии соответствующих антигенов до и после сепарации на проточном цитофлуориметре (FACScan, Becton Dickinson).

Результаты. Разработана технология синтеза полистиро-ловых магнитных микросфер, получены иммуноспецифичес-кие магнитоуправляемые конъюгаты на основе моноклональных антител к поверхностным маркерам CD3, CD4, CD20 и CD34 гемопоэтических клеток человека и поликлональных антител к Fc-фрагментам иммуноглобулинов мыши. Полученные конъюгаты специфически связывались с клетками-мишенями. Эффективность проводимой иммуномагнитной селекции Т- и В-лимфоцитов и CD34 гемопоэтических клеток-предшественников составляла 95-98%.

Заключение. Созданная система иммуномагнитной сепарации может быть рекомендована к использованию в научно-исследовательской и клинической практике при выделении гемопоэтических клеток человека.

ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА ГИБРИДОМЫ-ПРОДУЦЕНТА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К G-CSF ЧЕЛОВЕКА

Голубцова Н.В., Барышников К.А., Иванов П.К., Молодык А.А., Барышников А.Ю.

НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН,

Москва, Россия

Гранулоцитарный колонне - стимулирующий фактор (G-CSF) играет важную роль в кроветворении, влияя на гранулоцитарный росток гемапоэза и активируя зрелые клетки этого ростка. Его первоначальная идентификация была связана с разработкой методов получения колоний кроветворных клеток in vitro. Позднее были клонированы гены этого фактора. Остается актуальной проблема выделения G-CSF как из природных, так и из рекомбинантных источников. Эффективным методом очистки является аффинная хроматография с использованием моноклональных антител (МКА), специфичных к этому фактору. МКА к G-CSF человека могут также найти применение в иммунохимических методах выявления и количественной оценки G-CSF в клинических образцах.

Цель исследования. Получение штамма гибридомы-про-дуцента МКА к G-CSF человека.

Материалы и методы. Гибридомная линия получена стандартным методом слияния спленоцитов иммунизированной мыши линии BALB/C с клетками миеломы NS-1. Для иммунизации использовали коммерческий препарат G-CSF Granocyte (Rhone-Poulenc Rorer, France). Для наработки препаративных количеств МКА к G-CSF стабильные клоны-продуценты инокулировали внутрибрюшинно мышам линии BALB/C и отбирали асцитную жидкость, содержащую МКА. Выявление среди образующихся клонов гибридом требуемой специфичности, оценку реактивности МКА в культуральной жидкости стабильных клонов-продуцентов и асцитных жидкостях проводили твердофазным иммуноферментным методом, используя в качестве антигена коммерческий препарат

G-CSF Granocytc. Класс и изотнп продуцируемых МКА определяли с помощью набора для иммуноферментного анализа ISOStrip (Boeringer Mannheim, USA)

Результаты, получен штамм гибридных культивируемых клеток- Mus muscithts L., продуцирующих МКА к G-CSF человека IgGl изотипа, которому присвоено название ICO-220.

Заключение. МКА ICO-220 могут быть рекомендованы для использования при выделениии G-CSF человека иммуно-химичсскими методами, а также для количественного определения G-CSF в составе МФА-наборов.

УРОВНЬ АУТОАНТИТЕЛ К СУБЪЕДИНИЦАМ ГЛУТАТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ КАК СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ ПРИ ЭПИЛЕПСИИ

Гранстрсм O.K., Базарова В.Г., Гаппосва М.У.

Институт мозга человека РАН,

Санкт-Петербург, Россия

Введение. В последние годы признается важная роль повреждения глутаматных рецепторов в патогенезе различных заболеваний ЦНС, в том числе эпилепсии. Установлено, что AM РА тип глутаматных рецепторов существенно влияет на механизм гипервозбудимости, лежащий в основе патогенеза эпилепсии. Показано повышение уровня аутоантител (аАт) к субъединицам GluR 1 АМРА рецепторам в крови больных эпилепсией, коррелирующее с тяжестью клинической симптоматики. Для выявления аАт к GluRl у больных в лаборатории молекулярной нейробиологии ИМЧ РАН разработан тест, основанный на методе иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена синтетического пептида - фрагмента природного АМРА рецептора.

Цель и задачи исследования. Состояли в сопоставлении иммунологических показателей и данных о накоплении аутоантител к специфическим фрагментам глутаматных рецепторов у больных эпилепсией. Для выяснения специфичности, чувствительности и воспроизводимости теста проводилось исследование состояния иммунитета у групп больных другими заболеваниями ЦНС.

Материалы и .методы. Обследовано 183 человека в возрасте от 16 до 70 лет. В том числе больные эпилепсией (п=72), олигофренией (п=20), дисциркуляторной энцефалопатией (п=21), острым нарушением мозгового кровообращения (п=20). Контрольная группа была представлена здоровыми донорами (п=64). Иммуноглобулины сыворотки крови определяли методом твердофазного ИФА (“Протеиновый контур”, СПб.). Определение субпопуляций лимфоцитов осуществляли при помощи лимфоцитотоксического теста (ЛЦТТ). В качестве антигена для выявления аАт в сыворотке использовали синтетические пептиды, соответствующие последовательностям аминокислот субъединиц GluR 1 АМРА и NR2A NMDA глутаматных рецепторов. Анализ сывороток проводили стандартным методом ELISA.

Основные результаты. Иммунологический статус больных эпилепсией характеризовался снижением количества CD4 Т-хелперов, иммунорегуляторного индекса CD4 /CD8 , повышением количества цитотоксических CD8 Т-лимфоци-тов, уровней IgG и IgM и количества В-лимфоцитов. Прослеживалась корреляция между повышением уровня IgM и тяжестью заболевания по частоте приступов. Почти в половине случаев с положительной динамикой - значительное снижение частоты приступов, улучшение ЭЭГ показателей, у больных эпилепсией наблюдалась тенденция к нормализации числа

ИКК, существенное снижение количества С1иК1 аАт. Установлено достоверное отличие в уровне GluRl аАт в группах больных эпилепсией, контроле и у пациентов с олигофренией с уменьшением по порядку перечисления. В группе больных эпилепсией уровни аАт к в^1 субъединице АМРА глута-матного рецептора достоверно отличались от результатов, полученных у больных с сосудистыми заболеваниями головного мозга. Причем, наиболее показательными оказались не абсолютные уровни аАт в крови того или иного больного, а пропорция между уровнем аАт к СЬ^1 и 1'№2А субъединицам. Так, у больных эпилепсией уровни аАт к 0^1 субъединице оказались значительно повышенными (150%), в то время как, уровень аАт у больных с хроническим нарушением мозгового кровообращения и ишемическими инсультами был повышен уровень к Ж2А субъединице ИМОА глутаматного рецептора (135%),что свидетельствует о специфическом характере повреждения звеньев глутаматергической системы при соответствующих заболеваниях.

Заключение. Таким образом, удалось установить, что 01|Ж1 субъединиица АМРА глутаматного рецептора оказалась тем антигеном мозга, повышение уровня антител к которому специфично для эпилепсии. Полученные данные подтверждают информативность описанного выше лабораторного теста для диагностики и оценки эффективности лечения эпилепсии.

К ВОПРОСУ О РОЛИ ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 В ПОСТТРАНСФУЗИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЯХ НЕГЕМОЛИТИЧЕСКОГО ТИПА

Ильина Е.Ф., Котов А.Ю., Конусова В.Г., Калеко С.П., Симбирцев А.С.

ВМА, ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург

Среди причин, вызывающих посттрансфузионные реакций негемолитического типа (ПРНТ), в последние годы большинство исследователей наибольшее значение отводит про-воспалительным цитокинам: интерлейкину-1 (1Ь-1), интерлейкину-8 (1Ь-8), фактору некроза опухолей (Т№). Эти цитоки-ны являются в организме медиаторами воспалительного процесса, сопровождающегося подъемом температуры, ознобом, изменениями в периферической крови и белковом составе плазмы. Вовлечение ировоспалительных цитокинов в посттрансфузионные реакции возможно двояким путем: с одной стороны, цитокины могут накапливаться в течение хранения донорской крови и поступать в организм реципиента экзогенно, с другой, - несовместимость по лейкоцитарным антигенам может привести к активации собственных лейкоцитов реципиента и соответственно эндогенному выбросу цитокинов. Задачами данного исследования являлось изучение участия 1Ь-8 в развитии посттрансфузионных реакций негемолитического типа.

Исследовали содержание 11.-8 в сыворотке донорской крови непосредственно после взятия крови, а также в процессе се хранения. Определяли уровень цитокина на 5-й и 10-й день хранения крови. Нами также было проанализировано содержание 1Ь-8 в сыворотках крови доноров и реципиентов после развития посттрансфузионных реакций негемолитического типа. Определение уровня 1Ь-8 проводили иммунофермент-ным методом, использовали тест-системы производства ООО “Цитокин”.

Нами было исследовано 96 сывороток крови доноров, сразу после получения крови, а затем на 5 и 10 день хранения.

Было установлено, что у 17 из 96 доноров, что составило 17,1%, в сыворотке крови содержится 1Ь-8. Уровень его колебался от 46 пг/мл до 260 иг/мл. Чем обусловлено появление 1Ь-8 в кровотоке практически здоровых людей, сказать трудно, возможно, это является следствием каких-либо скрытых хронических, вялотекущих воспалительных процессов. При исследовании содержания Л_,-8 в 15 образцах хранящейся крови нами не было выявлено увеличения содержания цитокина в течение всего срока наблюдения. По нашему мнению, накопление данного интерлейкина при хранении крови вряд ли возможно, так как известно, что целый ряд клеток, в том числе и эритроциты, имеют рецепторы к 1Ь-8.

При анализе 11 случаев ПРНТ, наблюдаемых в течение 1998-2000 г.г. в различных клиниках ВМА, было установлено, что клиническая картина этих реакций на переливание была разнообразна. У 7 больных реакция на трансфузию проявлялась в виде сыпи, тошноты, одышки и отека Квинке. У 2-х больных наблюдался озноб, не сопровождавшийся температурной реакцией. У 2-х реципиентов картина посттрансфу-зионной реакции выражалась подъемом температуры до 38°-39°С, ознобом, тахикардией. Исследование периферической крови этих 2-х больных до и через несколько часов после переливания показало увеличение количества лейкоцитов с появлением в периферической крови молодых форм клеток ней-трофильного ряда. Все эти данные позволили нам предположить, что в развитии ПРНТ у этих больных принимают участие провоспалительные цитокины. Однако исследование сывороток крови доноров и реципиентов, полученных после гемотрансфузий, показало отсутствие в ней 1Ь-8. Возможно, что причиной этих реакций являются 1Ь-1 или Т№.

ВЛИЯНИЕ Н1А-ОРВ1 ГЕНОТИПА НА РИСК РАЗВИТИЯ И ПРОГНОЗ ТЯЖЕЛОЙ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ

Капустин С.И. Попова Т.И.1, Лыщев А.А.2, Блинов М.Н. Абдулкадыров К.М. 1

'Российский НИИ гематологии и трансфузиологии,

(Гапкт-Петербург, Россия

Клинический Центр передовых медицинских технологий, Санкт-Петербург, Россия

Введение. Тяжелая апластическая анемия (ТАА) - редко встречающееся гематологическое заболевание, характеризующееся значительной степенью панцитопении наряду с ярко выраженной гипоплазией костного мозга. Установление факторов риска ТАА, а также надежных прогностических маркеров является актуальной задачей в связи с высоким уровнем смертности при этой патологии. Большинство случаев заболевания до сих пор относят к числу идиопатических. Тем не менее, установлено, что иммунные механизмы оказываются вовлечёнными в эти-опатогенез ТАА у большинства больных. Изучение особенностей полиморфизма антигенов (АГ) главного комплекса гистосовместимости человека (НЬА) при ТАА позволило установить наличие корреляции между риском развития данного заболевания и наличием у индивида специфичности ВК2 антигена НЬА-ОК. Рядом авторов высказывается предположение о том, что применение специфической иммуносупрессивной терапии является более эффективным у ОК2-позитавных больных. Новые перспективы при изучении НЬА-ассоциированных заболеваний открылись в связи с внедрением в клиническую практику современных методов ДНК-типировапия АГ НЬА, основанных на технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Цель и задачи. Целью работы явилось установление возможных маркеров генетической предрасположенности или/и

прогноза ТАА, локализованных в локусе НЬА-В11 системы НГА, на основе высокоразрешающего метода ДНК-типиро-вания. Были поставлены следующие задачи: 1) Изучить особенности распределения аллелей гена ОЯВ1 у больных ТАА, по сравнению с контрольной группой; 2) Сопоставить данные НЬА-01Ш1 генотипирования у больных ТАА с некоторыми клиническими особенностями течения заболевания.

Материалы и методы. В качестве материала исследования использовали периферическую кровь 44 больных ТАА, находившихся на лечении в 1992 - 1998 гг. в гематологических клиниках Российского НИИ гематологии и трансфузиологии и Клинического Центра передовых медицинских технологий г. Санкт-Петербурга и проживающих в Северо-Западном регионе России. Контрольную группу составили 100 доноров крови, проживающих в Санкт-Петербурге. Типирова-ние гена НГА-ОЯВ1 осуществляли на основе метода ПЦР-ССО (ПЦР с последующей гибридизацией продукта реакции с сайт-специфическими олигонуклеотидными зондами).

Основные результаты. В группе больных ТАА наблюдалось достоверное увеличение числа носителей аллеля ОЯВ1*1501 (52,3% против 22,0% в группе доноров, 015=3,9; Р<0,001). Кроме того, у пациентов с ТАА обнаружены существенные отличия в распределении аллелей, соответствующих специфичности НЬА-ВЯ4. В частности, все В114-позитивные больные (их число составило 29,5% по сравнению с 24,0% в здоровой популяции, 011=1,3; Р=0,54), являлись носителями аллелей (ОЯВ 1*0401, *0402, *0404, *0408, *0416), кодирующих аланин в позиции 74 (3-цепи антигена ОИ4 (вариант НЬА-БК4-А1а74(3). В результате частота встречаемости этого варианта была достоверно выше в группе ТАА (29,5% против 15,0% у доноров, 011=2,4; Р<0,05). Напротив, аллели, кодирующие глутаминовую кислоту в позиции 74 (3-цепи антигена БК4, не обнаруживались среди больных. Статистический анализ по методу “множественных сравнений” (Svejgaard А., Яуёег Ь.Р., 1994) продемонстрировал, что аллель ЭКВ1 * 1501 и антигенный вариант НЬА-ВЯ4-А1а74|3 являются независимыми факторами, обусловливающими наследственную предрасположенность к ТАА. Сопоставление результатов НЬА-Б1^В 1 генотипирования с клиническими особенностями течения ТАА показало, что носительство антигена НЬА-ВК4-А1а74(3 является прогностически неблагоприятным маркером заболевания. Шестимесячная выживаемость в группе БЯ4 - позитивных и негативных больных составила, соответственно, 50% и 87% (Р<0,05). Данная тенденция была подтверждена при анализе общей выживаемости по методу Каплана-Мейера (Р=0,016).

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о влиянии ОЯВ1-генотипа индивида на риск развития ТАА, а также о возможности использования данных ОЯВ1 -генотипирования у больных данным заболеванием в прогностических целях.

ПРИМЕНЕНИЕ СТРЕПТАВИДИН-БИОТИНОВОГО МЕТОДА ФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ В ИММУНОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ.

Козаченко Н. В., Гальстер И. К., Мингазова И. Ф., Ракишева А. С.

Государственная медицинская академия,

Караганда, Казахстан

Государственный медицинский университет, Алматы, Казахстан.

Карагандинская область лидирует по числу ВИЧ-инфи-цированных в Казахстане. Так, на 01.11.2000 в области выяв-

лено 954 ВИЧ-инфицированных, причем, наибольшее число составляют лица мужского пола в возрасте от 15 до 30 лет, а по пути передачи инфекции преобладает парентеральный.

Целыо работы явилось проведение иммунологического мониторинга ВИЧ-инфицированных, находящихся в локальных участках пенитенциарной системы Карагандинской области. Всего за 1999-2001 гг. было обследовано 180 ВИЧ-инфицированных, из них в динамике ООТЭ-терапии - 38 больных туберкулезом.

Для исследования брали кровь из пальца (0,5 мл), применяли комплекс микрометодов реакции розеткообразования и фагоцитоза (Лебедев К. А., Понякина И. Д., 1999) и в последнее время метод определения фенотипа лимфоцитов с использованием тест-системы на основе стрептавидин-биоти-пового метода с пероксидазной меткой, предложенный фирмой ОАКО (Дания) в модификации К. А. Лебедева и соавт. (2001).

Результаты, полученные при обследовании ВИЧ-инфици-рованных, свидетельствовали о снижении числа теофиллин-резистентных Т-лимфоцитов, увеличении числа “нулевых” лимфоцитов, снижении фагоцитарной и адгезивной активности нейтрофилов.

Применяемый в последнее время метод иммунофеноти-пирования лимфоцитов дал возможность установить аналогичные изменения в популяции лимфоцитов.

В процессе выполнения работы нам удалось установить, что применяемые методы сопоставимы, а диагностическая значимость полученных результатов идентична при применении обоих методов. Предпочтение того или иного метода зависит от возможности финансового обеспечения лаборатории.

ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

Котов А.Ю., Симбирцев А.С.

ГНЦ Гос НИИ особо чистых биопрепаратов

Провоспалительные цитокины играют важную роль в патогенезе различных заболеваний человека. Поэтому количественное определение данных факторов в различных биологических жидкостях имеет важное значение. Среди методов количественного определения цитокинов наиболее оптимальными являются иммуноферментные методы, благодаря высокой специфичности, простоте и скорости получения результата. Нами были созданы диагностические тест-системы для количественного определения 1Ь-1а, 1Ь-1|3, 1Ь-8 и ТИРсс. С помощью данных тест-систем были определены прежде всего уровни спонтанной и индуцированной продигиозаном продукции 11_-1|3, И.-8 и ТЫРа клетками крови здоровых доноров, а также их содержание в сыворотке крови. Так как провоспалительные цитокины в первую очередь являются медиаторами локального действия, нами были исследованы уровни данных факторов местно в очаге воспаления при различных типах воспаления. Содержание определения 1ИР, 1Ь-8 и Т№а было исследовано в очаге воспаления при гнойнодеструктивных заболеваниях легких, таких как эмпиема и абсцесс легкого. При абсцессе легкого урони 1Ь-1(3,1Ь-8 были достоверно более высокими у пациентов, находящихся в фазе острого воспалительного процесса, по сравнению со стадией реконвалесцснции. Повышенные уровни продукции 1Ь-1а, 1Ь-ф и 1Ь-8 были отмечены в очаге деструкции при флегмонах челюстно-лицевой области, по сравнению с контролем, где данные факторы определялись в раневой жидкости при-

хирургических неинфецированных ранах. Кроме бактериальных местных воспалительных процессов нами были исследованы и аутоиммунные. Исследование уровней 1L-1P в слезной жидкости при ревматоидных увеитах и увеитах неясной этиологии у детей выявило примерно 100-кратное повышение данного цитокина, по сравнению его содержанием в слезе здоровых детей. Таким образом, определение уровней продукции провоспалительных цитокинов может быть важно при диагностике, лечении и прогнозе данных патологических состояний.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ ОПЕРАТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ ПОСЛЕДСТВИЙ ПОВРЕЖДЕНИЙ КОЛЕННОГО СУСТАВА

Кролевец И.В., Андреева И.И.

Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону, Россия

Факт заинтересованности клеток иммунной системы в развитии воспаления и последующих дегенеративно-дистро-фических процессов в коленном суставе после травмы в настоящее время не вызывает сомнений (Краснов А.Ф., 1998, Eingartner С., 1999). Этим определяется интерес к изучению динамики основных параметров иммунного статуса в зависимости от техники оперативного лечения для индивидуализации способов вмешательства, пред- и послеоперационной иммунокорригирующей терапии.

Обследовано 38 больных в возрасте 18-36 лет, оперативно леченых по поводу закрытых повреждений коленного сустава эндоартрохирургическим (22) и традиционным (16) методами.

Исследование периферической крови (ПК) и синовиальной жидкости (СЖ) накануне оперативного вмешательства свидетельствует об исходном функциональном напряжении иммунной системы. В первую очередь это касается клеток с цитотоксической активностью. Так, увеличилось число лимфоцитов фенотипа CD8+ (34±3%, в норме - 21 ±4%) и CD 16 (20±3%, в норме - 11 ±4%). Об активации лимфоцитов ПК свидетельствуют также и повышенная экспрессия на Т-клет-ках таких маркеров “поздней” активации, как CD95 (7±2%, в норме - 2±2%) и HLA-DR (11±3%, в норме - 5±2%). В синовиальной жидкости основная часть Т-клеток представлена цитотоксическими лимфоцитами: при общем числе CD3 лимфоцитов, равном 32±6%, процент CD8 клеток равен 24±5%, а количество HLA-DR Т-клеток достигает 24±3%.

Анализ иммунного статуса после “открытых” вмешательств показал, что к 14 суткам количество цитотоксичес-ких Т-лимфоцитов и натуральных киллеров ПК достигает уровня предоперационного периода: 30±5% и 19±4%, соответственно. Аналогичные изменения регистрировались и при иммунофенотипической характеристике лимфоцитов СЖ: уже к 7-м суткам количество CD8 и CD 16 клеток практически не отличалось от дооперационных данных.

После эндоартрохирургических вмешательств через сутки в ПК отмечено уменьшение экспрессии активационных маркеров: CD95 (2,4± 1,2%), HLA-DR (3,1 ± 1,0%). На 14-е сутки после операции все показатели иммунного статуса, включая число цитотоксических клеток и маркеров активации, не отличались от параметров, характерных для здоровых доноров

соответствующей возрастной группы. В СЖ также зарегистрировано снижение числа цитотоксических Т-лимфоцитов до 10± 1,9% (1 -е сутки) и 4± 1,2% (7-е сутки). При этом существенно снижена экспрессия активационных маркеров: CD95 -4±1,3% (1-е сутки) и не определяются к 7-м суткам. HLA-DR

- Т-клетки стабилизируются на уровне 4±1,1%. Отмечается также уменьшение общего числа иммунокомпетентных клеток СЖ к 7-м суткам до 2 х 103/мл.

Таким образом, полученные данные показывают, что после интенсивного локального воздействия (операции) исходное функциональное напряжение иммунной системы уменьшается, причем быстрее и полнее при эндохирургической технике вмешательства. Динамика показателей местного иммунитета согласуется с представлением о возможности профилактики артроза с помощью подбора адекватного оперативного воздействия.

ВЫЯВЛЕНИЕ Г0М03ИГ0ТН0СТИ ПО АЛЛОТИПУ lgG2m(n-) С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ (МКАТ)

Крутецкая И.Ю., Самойлович М.П., Климович В.Б.

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт М3 РФ, Санкт-Петербург, Россия.

Исследованиями последних лет установлено преобладание лиц, гомозиготных по аллелю IgG2m(n-), среди пациентов с общим вариабельным иммунодефицитом. Гомозиготные носители аллели IgG2m(n-) имеют также семикратно повышенный риск неудачной вакцинации капсулярными полисахаридами пневмококков, менингококков и Haemophilus influenzae b. Единственный известный метод определения го-мозиготности по аллели IgG2m(n-) основан на сочетанном применении выпускаемых за рубежом МКАТ НР-6014 и SH-

21 в тесте встречной иммунодиффузии (Rautonen N., 1989).

Целью настоящей работы было изучение возможности применения полученного в лаборатории МКАТ G2-3C7 для выявления индивидов, гомозиготных по IgG2m(n-).

Материалом исследования служили образцы сывороток крови штатных доноров. Концентрацию IgG2 в сыворотках определяли с помощью двухдетерминантного ИФА на основе иммобилизованных на твердой фазе МКАТ G2-3C7 или НР-6014. Выявляющим реагентом служил конъюгат пероксида-зы с полученым в лаборатории МКАТ против IgG человека. Для сравнение эпитопной специфичности МКАТ использовали конкурентный метод ИФА. Определение аллотипов lgG2m(n+) и IgG2m(n-) осуществляли с помощью метода встречной иммунодиффузии на основе коммерческих МКАТ SH-21 и НР-6014.

Определение концентраций IgG2 с помощью МКАТ G2-ЗС7 проводили в сыворотках крови 32-х доноров. В 30% образцов сывороток были выявлены значения концентраций, близкие к нулевым. Эти сыворотки были условно названы “негативными”. С помощью референс-МКАТ НР-6014 в тех же образцах были выявлены значения концентраций IgG2, отличные от нулевых. Факторов, блокирующих связывание МКАТ G2-3C7 с IgG2, в негативных сыворотках обнаружено не было. Кислотная обработка сывороток при pH 2 в течение 30 минут способствовала полному выявлению lgG2 в негативных сыворотках. Значения концентраций IgG2, полученные с помощью МКАТ G2-3C7, в обработанных подкислени-ем сыворотках совпали со значениями, полученными в натив-

ных образцах в системе, основанной на применении МКАТ НР-6014. В позитивных сыворотках выявляемые концентрации IgG2 до и после подкисления были одинаковыми.

Определение аллотипов IgG2 по методу N.Rautonen показало, что все сыворотки, негативные при определении содержания IgG2 в двухдетерминантном ИФА, принадлежат индивидам, гомозиготным по аллотипу IgG2m(n-). При сравнении МКАТ SH-21 и МКАТ G2-3C7 в тесте встречной иммунодиффузии картины преципитации совпадали. В конкурентном ИФА МКАТ SH-21 полностью подавляло связывание с антигеном МКАТ G2-3C7, что указывает на идентичность распознаваемых ими эпитопов.

Из полученных данных следует, что эпитоп, распознаваемый МКАТ G2-3C7, является изотипическим маркером, который по-разному экспрессирован на аллельных вариантах IgG2 человека. На молекулах IgG2m(n+) эпитоп G2-3C7 экспрессирован постоянно и устойчив к изменению конформации. На молекулах IgG2m(n-) этот эпитоп скрыт и выявляется только после изменения конформации. Это позволяет при исследовании в двухдетерминантном ИФА нативных сывороток выявлять индивидов, гомозиготных по аллели IgG2m(n-).

Изучение в двухдетерминантном ИФА нативных образцов сывороток 200 доноров показало, что в данной выборке доля индивидов, гомозиготных по аллели IgG2m(n-), составляет 26,5%.

УРОВЕНЬ СЫВОРОТОЧНЫХ ЦИТОКИНОВ У БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ ПОЛИОРГАННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Лазанович В. А., Смирнов Г.А.

Краевая клиническая больница, г. Владивосток, Россия

Синдром полиорганной недостаточности (СИОН) является сложной проблемой в интенсивной терапии. Согласно современным представлениям большое значение в формировании синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) и СИОН придается цитокинам.

Целью нашей работы было изучение динамики уровня сывороточных цитокинов у больных СИОН, взаимосвязь данных показателей со степенью органной дисфункции (оценка по шкале SOFA- Sepsis- related Organ Failure Assessments).

Под нашим наблюдением находилось 112 больных реанимационного профиля с признаками системной воспалительной реакции, наличием очага инфекции (выявленного клинически и подтвержденным микробиологически) и синдромом полиорганной недостаточности. Всем пациентам проводился мониторинг клинико-биохимических показателей ежедневно. Иммунологические параметры оценивались в 1-2 сутки, на 8-10 и 21 дни болезни. Определен уровень в сыворотке TNF-а, IL-la, 1L-6, IL-10, ИНФ-у методом ИФА с помощью диагностических наборов R&D Diagnostics Inc., USA. Полученные результаты приведены в таблице.

Оценивая показатели иммунитета у больных СПОН, необходимо отметить их существенные динамические отличия. В наибольшей степени это относиться к цитокиновому профилю: высокий уровень того или иного цитокина по-разному коррелировал со степенью органных нарушений, клиническим состоянием больных СПОН на разных этапах. Так, например, высокий уровень сывороточного IL-la мы наблюдали у пациентов с тяжелым течением полиорганной дисфункции в 1-2 сутки болезни. Высокие показатели уровня сывороточного

TNF-a на всех стадиях течения синдрома полиорганной недостаточности соответствовал наиболее выраженной сте-

ТАБЛИЦА. УРОВЕНЬ СЫВОРОТОЧНЫХ ЦИТОКИНОВ У БОЛЬНЫХ СПОН

Показатели, пг/мл Этапы исследования

1-2 сутки М±т 8-10 сутки М+т 21 сутки М±т

IL-1oc 1,70±0,36 3,01+0,28** 3,50+0,04**

IL-6 147,15+29,1 76,9± 10,5** 27,1+14,4**

TNF-a 173,2+5,5 207,5±7,83** 169,7±12,2

IL-10 53,0+4,7 40,5±2,4* 50,25+2,6

ИНФ-у 41,6±6,6 67,5+4,6* 50,6±4,1

Примечание: * - статистическая значимость различий между начальным этапом и исследованиями в динамике (р<0,05); **(р<0,01).

пени органной дисфункции (оценка по шкале SOFA) и высокой летальности. Высокие показатели IL-10 в 1-2 сутки и ИНФ-у на 21 день, напротив, были связаны с менее тяжелым течением СПОН.

Таким образом, при развитии синдрома полиорганной недостаточности необходим мониторинг цнтокинового профиля для выявления степени выраженности системного воспалительного ответа, прогноза исхода заболевания. Полученные данные могут быть использованы в выборе иммунокорреги-рующей терапии препаратами цитокинового ряда в зависимости от стадии течения СПОН.

АУТОАНТИТЕЛА К ТИРЕОИДНЫМ ГОРМОНАМ: ИММУНОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Матвеенцев В.Д., Ермоленко М.Н., Вашкевич И.И., Свиридов О.В.

Институт биооргстичсской химии НАН Беларуси, Минск

Аутоантитела к L-тирокспну (Т4) и L-трпйодтиронину (ТЗ) являются наименее изученными с иммунологической и диагностической точек зрения компонентами широкого спектра аутоантител к антигенам щитовидной железы. Во многом это связано с тем, что для их обнаружения до сих пор используется разработанный два десятилетия назад жидкофазный радио-изотопный метод, обладающий низкой чувствительностью и малой надежностью. Мы разработали твердофазную систему для связывания аутоантител к тиреоидным гормонам (ауто-АТ-ТГ), пригодную для использования в современных радио-иммунометрическом или иммуноферментном анализах. В ходе разработки изучено взаимодействие ТГ-связывающих белков плазмы человека и АТ-ТГ животных с Т4 или ТЗ, биоспецифически иммобилизованными на полистирольных пробирках или микропланшетах. Твердофазная система была приготовлена путем последовательных обработок поверхности пластика конъюгатом альбумин-биотин, стрептавидином и бифункциональным конъюгатом, состоящим из ТГ и биотина, ковалентно присоединенных к инертному белку (альбумин его агрегаты или ферритин). Перед связыванием конъюгата ТГ-белок-биотин с твердой фазой его минорная фракция, проявляющая сродство к нормальным белкам плазмы человека, удалялась аффинной хроматографией. Мы нашли, что очищенные белки нормальной плазмы человека, включая альбумин, транстиретин, Т4-связывающий глобулин, аполипопротеин А-

I и иммуноглобулины не взаимодействуют с биоспецифически иммобилизованными ТГ. Различные поликлональные или моноклональные АТ-ТГ, даже проявляющие лишь умеренное сродство к неконъюгированным Т4 или ТЗ, прочно связывались с твердой фазой. После удаления жидкой фазы, детекция связанных АТ-ТГ осуществлялась с помощью меченого йодом-125 или пероксидазой АТ-специфичного реагента. В предварительных экспериментах с использованием разработанной системы было исследовано 200 проб сыворотки, 50 из которых содержали тиреоидные аутоантитсла. Результаты этих экспериментов выявили очевидные технические и аналитические преимущества разработанного иммунометрического метода над существующим радиоконкурентным анализом.

ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА КОМПОНЕНТОВ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ГЛ И АД И НАМ

Михайлопуло К.И., Свиридов О.В., Прядко А.Г., Мараховский Ю.Х.

Институт биоорганической химии НАН Беларуси Белорусская медицинская академия последипломного образования, кафедра гастроэнтерологии

Разработана упрощенная конструкция и получены компоненты иммуноферментной системы для количественного определения антител к белкам злаков глиадинам с целью диагностики целиакии. С использованием экстракции, осаждения органическими растворителями и хроматографических методов из растительного сырья получены различные фракции глиадинов. Их сродство к эндогенным антителам в пробах сыворотки оценивали после пассивной иммобилизации антигенов в лунках микропланшетов, используя для детекции связанных антител конъюгаты пероксидазы с антителами к иммуноглобулинам 1§А и человека и водорастворимый тет-раметилбензидин в качестве хромогена. В качестве компонентов системы выбирались фракции, которые связывали не менее 90% антител в пробе. При калибровке системы использовали модели биоспецифического связывания, в которых чистые иммуноглобулины ^А или человека, количественно связывали в лунках по стрептавидин-биотиновой технологии или через иммобилизованные вторые антитела. Стандартизацию иммуноаналитической системы осуществляли с помощью контрольных сывороток. Эти препараты получали на основе нормальной сыворотки здоровых доноров, в которую вноси-

ли известные количества чистых антител, выделенных из сыворотки крови больных целиакией с помощью аффинной хроматографии на синтезированной глиадин-агарозе. Система, оптимизированная по составу и свойствам компонентов, позволяет выполнять все измерения в течение одного рабочего дня и получать аналитические данные, которые соответствуют клинической картине в рабочем диапазоне 2 - 100 Ед/л. Предварительная оценка разработанной системы выявила у пациентов с классической формой целиакии по критериям Европейского общества по гастроэнтерологии и питанию, наличие положительных антиглиадиновых IgA и IgG в 90% случаев, что совпадает с показателями коммерческих тест-систем.

НОВАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА НА ОСНОВЕ МИКРОДОТ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА К АНТИГЕНАМ ХЛАМИДИЙ РАЗНЫХ ВИДОВ. ВОЗМОЖНОСТЬ ВИЗУАЛЬНОГО УЧЕТА И ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНОГО АНАЛИЗА ОЦИФРОВАННОГО ИЗОБРАЖЕНИЯ

Навольнев С.О., Мартынова В.Р.

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

В последнее время уделяется большое внимание миниатюризации лабораторных методов анализа, поскольку она сулит ряд серьезных преимуществ перед традиционными методами: резкое сокращение объемов реактивов, возможность определения в одной пробе нескольких показателей, снижение стоимости анализа и др.

Разработана и испытана тест-система на основе микродот иммуноферментного метода для определения антител человека к антигенам хламидий разных видов. В качестве твердой фазы используются стекла с 18 лунками диаметром 3,5 мм. В лунки нанесены и фиксированы антигены хламидий и контрольный антиген в виде пятнышек диаметром около 1 мм, всего 4 пятна в лунке. В лунки вносят разведения исследуемых и контрольных сывороток (положительную, отрицательную и слабоположительную, служащую для определения cut off, сыворотки) в объеме 3 мкл на 30 минут при 37°С, промывают, вносят конъюгат против антител человека на 30 минут при 37°С, промывают. Затем вносят раствор субстратов для пероксидазы, дающих цветные нерастворимые продукты реакции. При наличии антител в сыворотке, пятно с хламидий-ным антигеном окрашивается.

Можно проводить визуальный учет цветной реакции. Положительные сыворотки четко окрашивают пятна с хламидий-ными антигенами к 10-20 минуте реакции, практически не окрашивая контрольные пятна. Отрицательные сыворотки практически не окрашивают пятен за это же время.

При инструментальном учете после проведения цветной реакции стекла сканируют и анализируют на компьютере полученное оцифрованное изображение с помощью специальной программы. Использование анализа оцифрованного изображения при постановке соответствующих контролей позволяет: избежать субъективностей визуальной оценки, статистически рассчитать cut off и определить конечную точку титрования, определить наклон кривых титрования.

Микрометод позволяет определять одновременно антитела к трем видам хламидий. Результаты метода хорошо коррелируют (коэффициент корреляции 0,8-0,9) с результатами традиционного метода для определения антител к антигенам хламидий - реакции непрямой иммунофлуоресценции. На осно-

ве разработанного метода выпускается экспериментальная партия наборов ХламиСкрин (для IgG и IgA), при сравнении с двумя зарубежными коммерческими тест-системами получен высокий процент (90% и 95%) совпадения результатов.

СОЗДАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ, ВЫЯВЛЯЮЩЕЙ ПРОСТАТИЧЕСКИЙ СПЕЦИФИЧЕСКИЙ АНТИГЕН, НА ОСНОВЕ НОВЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Осипова Т.В., Ленева Н.В., Боровкова Н.Б., Барышников А.Ю.

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им.Н.Н.Блохина РАМН,

Москва, Россия

Простатический специфический антиген (ПСА) является основным диагностическим маркером, используемым в клинической практике при скрининге рака простаты и мониторинге эффективности проводимого лечения.

Цель исследования. Создание на основе новых моноклональных антител (МКАТ) диагностикума для определения общего ПСА в сыворотке крови человека. Изучение иммунологических и иммунохимических свойств МКАТ для отбора их при создании диагностической тест-системы.

Материалы и методы. Гибридомы, продуцирующие МКАТ к ПСА, были получены путем многократной иммунизации мышей ВALB/c очищенным ПСА в дозе 10 мкг. Отбор гибридом проводили в ИФА на планшетах с сорбированным антигеном. Специфичность МКАТ изучалась на панели антигенов, включавшей бычий и человеческий сывороточные альбумины, бета-2-микроглобулин, СА-19-9, СА-125. Изотип определяли в ИФА с помощью сывороток, специфичных к различным классам Ig мыши. Очистку МКАТ из асцитов проводили, используя метод по каприловой кислоте (Reik L.M. с соавтр. 1987 г.) Выбор пары МКАТ для создания тест-систе-мы был сделан на основе метода подбора пар МКАТ для “сэндвич” варианта иммуноферментного анализа (Corey Е.С. с соавтр. 1997г.). Изучение эпитопной специфичности МКАТ проводилось в иммуноферментной системе по ингибированию связывания мечен ых МКАТ немечеными на платах с сорбированным антигеном.

Результаты и обсуждение. Было получено 8 новых гибридом, продуцирующих МКАТ к ПСА. МКАТ были специфичны к ПСА и связывались с другими антигенами. МКАТ принадлежали к IgG 1 изотипу и имели легкую цепь каппа. По эпитопной специфичности полученные антитела были разделены на две группы. В первую группу входили 6 МКАТ, которые конкурировали между собой за связывание с антигеном и, возможно, определяли один и тот же эпитоп. Во вторую группу входили 2 МКАТ, конкурировавшие между собой и не конкурировавшие ни с одним из МКАТ первой группы. В ИФА, формируя различные парные комбинации имеющихся МКАТ, определили два МКАТ, способные создать оптимальный вариант “сэндвич” иммуноферментного анализа.

Разработанная в дальнейшем диагностическая иммуно-ферментная тест-система по определению общего ПСА в сыворотке крови человека была основана на двух МКАТ, специфичных к ПСА и направленных к разным детерминантам антигена. Были изучены аналитические и диагностические характеристики тест-системы. Чувствительность тест-системы составила 0,3 нг/мл. Воспроизводимость стандартной кривой для разных партий реагентов, оцениваемая с помощью коэф-

фициента вариации, не превышала 11,9%. Тест на восстановление составил 91-105%. Тест на линейность - отклонение от исходной концентрации при разведении пробы, содержащей известное количество ПСА, - показал колебания в 10%.

Изучение диагностических характеристик тест-системы проводили на клиническом материале, состоящим из сывороток 46 больных различных стадий и гистологических форм РПЖ, 23 - с доброкачественными гиперплазиями предстательной железы, 46 - со злокачественными опухолями других локализаций. Контрольную группу составили 85 здоровых мужчин. Полученные нами средние значения содержания ПСА в сыворотках здоровых мужчин (0,63 нг/мл), соответствуют результатам, получаемым с помощью известных коммерческих наборов для мужчин того же возраста (0,55 нг/мл) (Blijenberg B.C. с соавтр. 1995 г.). У мужчин с опухолями других локализаций содержание ПСА в сыворотке хотя и было выше, чем у здоровых доноров (2,3 нг/мл), однако не превышало уровня дискриминационной дозы (4 нг/мл). В группе больных РПЖ уровень общего ПСА был наибольшим (56,4 нг/мл). Изучено распределение уровня сывороточного ПСА в контроле, у больных РПЖ и доброкачественными гиперплазиями.

Диагностические параметры разработанного диагности-кума сравнивались с известным коммерческим набором PSA/ Total EIA 11 Cobas Core (Швейцария). Получены высокие коэффициенты корреляции (г) при сравнении результатов измерений ПСА в различных обследованных группах. В группе больных РПЖ - г=0,928; р<0,001, а в группе с доброкачественными гиперплазиями - г=0,994; р<0,001.

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ СА2+-ИОНОФОРА - ИОНОМИЦИНА НА СУБПОПУЛЯЦИИ Т-КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Поклонский Д.Л., Беляева Т., Хайдуков С.В., Литвинов И.С.

Институт Биоорганической химии им М.М. Шемякина-Ю.А.Овчинникова РАН

Чувствительность клеточных популяций к Са:+-ионофо-рам зависит от их типа и стадии дифференцировки. Ранее нами было показано неодинаковое действие низких доз иоиомици-на на субпопуляции Т-клеток периферической крови человека (ПКЧ). Наиболее чувствительной популяцией к иономи-цину являются наивные CD4+CD7+CD45RA+ Т-клетки. Данная работа является продолжением предыдущего исследования и направлена на изучение механизмов влияния низких доз иономицина на субпопуляции Т-клсток ПКЧ.

Действие иономицина на наивные CD4 CD7 CD45RA Т-клетки зависит от его концентрации в среде инкубации. Дозы иономицина меньше 0,1 |iM практически не влияли на состав популяции Т-клеток. Добавление иономицина в концентрациях 6 |тМ и выше к лимфоцитам ПКЧ приводило к значительной (более 90%) гибели клеток, вследствие выраженного ионофорного эффекта. В интервале концентраций иономицина от 1 цМ до 4 (.iM наблюдалось зависимое от дозы уменьшение доли наивных CD4 CD7 CD45RA Т-клсток в составе общей популяции Т-клеток. При концентрации иономицина 3 цМ его действие на Т-клетки зависело от времени инкубации. Наибольшие изменения происходили в течение первых 10 минут. Дальнейшее увеличение времени инкубации сопровождалось лишь незначительными изменениями в составе субпопуляций Т-клеток ПКЧ.

В безкальциевой среде и/или в присутствии 2 мМ EDTA иономицин в интервале концентраций от 1 цМ до 5 |дМ не

влиял на состав клеточных популяций Т-клеток ПКЧ. Следовательно, необходимым условием влияния иономицина на Т-клетки ПКЧ является присутствие ионов кальция во внешней среде. Как правило, иономицин-зависимый вход ионов Са2+ происходит вследствие опустошения внутриклеточных депо кальция и последующего открытия Са-каналов плазматической мембраны (ПМ) лимфоцитов. В свою очередь, Са-каналы ПМ лимфоцитов имеют выраженную потенциал-зависимость. Деполяризация клеточной мембраны Т-лимфоцитов (50 цМ КС1 в среде) практически полностью предотвращала действие иономицина (1 р.М - 5 |хМ) на субпопуляции Т-клеток ПКЧ. Эффект КС1 на индуцированное иономицином изменение состава Т-клеток ПКЧ зависел от его концентрации в среде инкубации. Повышение концентрации КС1 в среде инкубации от 1 цМ до 30 цМ сопровождалось значительным подавлением действия иономицина на субпопуляции Т-клеток ПКЧ. Дальнейшее увеличение концентрации КС1 в среде инкубации до 50 цМ приводило к практически полной отмене действия иономицина на лимфоциты ПКЧ. Следует отметить, что уже при 30 |1М КС1 в среде инкубации наблюдается практически полная деполяризация ПМ Т-клеток.

Эффект иономицина зависел и от температуры среды инкубации. Наибольший эффект иономицина на состав клеточных популяций и на изменения [Са2+1; проявлялся при 37°С. Понижение температуры среды инкубации до 20°С приводило к небольшому уменьшению эффекта иономицина. Дальнейшее снижение температуры среды инкубации до 0°С приводило к резкому падению эффекта иономицина. Излом температурной зависимости действия иономицина свидетельствует о существенном влиянии состояния липидного бислоя мембран лимфоцитов на чувствительность их к иономицину.

Следовательно, ведущую роль в развитии эффекта иономицина на наивные Т-клетки ПКЧ играет вход внешнего кальция в клетки через потенциал-зависимые Са-каналы ПМ.

Работа поддержана грантом РФФИ № 00-04-48800.

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ АНТИГЕНА С095 (Раэ/АРО-1) У БОЛЬНЫХ С ТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ ПОЧКИ

Полосухина Е.Р., Заботина Т.Н., Перлин Д.В., Барышников А.Ю.

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им.Н.Н.Блохина РАМН, Москва, Россия

Трансплантация почки является общепризнанным высокоэффективным методом замещения утраченной функции почки у больных в терминальной стадии хронической почечной недостаточности. Существенный вклад в развитие трансплантологии внесен разработкой и внедрением в клинику новых иммуносупрессивных препаратов, а супрессия иммунного ответа рассматривается как неотъемлемая часть ведения больных после пересадки органов. Практически новую эру ознаменовало появление циклоспорина А, который оказывает селективное воздействие на Т-лимфоциты, угнетает ранний клеточный ответ на антигены и регуляторные стимулы, селективно подавляет пролиферацию активированных Т-лимфоци-тов, вызываемую интерлейкином-2, также препятствует образованию лимфокинов Т-хелперами. При трансплантации почки циклоспорин А применяют в составе стандартной трехкомпонентной методики иммуносупрессии, включающей аза-тиоприн и преднизолон.

Цель и задачи исследования. Провести сравнительную оценку функционального состояния иммунной системы у реципиентов с трехкомпонентной методикой иммуносупрессии по сравнению со здоровыми донорами. Определить значение экспрессии антигена CD95 (Fas/АРО-1).

Материалы и методы. Для иммунофенотипирования клеток периферической крови здоровых доноров и больных с трансплантацией почки применяли широкую панель моноклональных антител (МКА) (НПЦ “МедБиоСпектр”, Москва). Оценку результатов проводили на проточном цитофлуоримет-ре FACScan "Becton Dickinson”.

Основные результаты: Проведенное сравнение позволило выявить статистически достоверное уменьшение экспрессии антигенов CD 1 б, CD24, CD lib, CD38 у реципиентов с иммуносупрессией по сравнению со здоровыми донорами. Также мы показали, что у больных, получающих стандартную схему иммуносупрессии, состояние которых клинически характеризовалось как стабильное, экспрессия CD95 антигена, а также активационных антигенов CD25 и CD71, не отличается от таковой у здоровых доноров. Полученные результаты коррелируют с данными литературы о ингибировании двух цитоли-тических путей при иммуносупрессии, о чем может свидетельствовать как уменьшение перфорин-экспрессирующих клеток, так и клеток, экспрессирующих Fas-peuenTop/Fas-flnranfl. Однако у больных с инфекционными осложнениями, такими как цитомегаловирусная инфекция, герпетическая инфекция, легочный туберкулез, которые клинически слабо проявляются на фоне иммуносупрессии, в нашем исследовании отмечено статистически достоверное повышение экспрессии CD25, CD71 и HLA-DR антигенов, а также CD95 на лимфоцитах периферической крови по сравнению с группой больных со стабильной функцией трансплантированной почки. При этом экспрессия антигена CD95 коррелировала с экспрессией антигена CD71, что может свидетельствовать в пользу предположения Ito М. с соавт. (1995) о вовлеченности CD95 антигена в регуляцию процесса клеточной смерти активированных клеток памяти и элиминации лимфоцитов, активированных при вирусной инфекции. Для дальнейшего исследования роли антигена, опосредующего апоптоз, мы исследовали группу больных с острым отторжением трансплантата почки, клинические проявления которого сходны с инфекционными осложнениями. У этих больных экспрессия антигена CD95 не отличалась от экспрессии у здоровых доноров и была статистически ниже, чем у реципиентов с инфекционными осложнениями.

Заключение. Таким образом, можно сделать вывод, что повышение экспрессии антигена CD95 на лимфоцитах периферической крови больных с трансплантацией почки, наряду с повышением экспрессии активационных маркеров CD25 и CD71, может служить диагностическим критерием инфекционных осложнений, а МКА против CD95 антигена могут быть использованы для мониторинга состояния иммунной системы у реципиентов с трансплантацией почки.

БИОСПЕЦИФИЧЕСКАЯ И ПАССИВНАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ АНТИГЕНА В ИММУНОАНАЛИЗЕ АУТОАНТИТЕЛ

Прядко А.Г., Вашкевич И.И., Слепцова Н.М., Дубовская JI.B., Матвеенцева И.В., Свиридов О.В.

Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск

Осуществлена разработка и проведено прямое экспериментальное сравнение биохимических параметров и медико-

аналигических характеристик двух типов иммуноферментных систем, различающихся только тем, что в одной из них интак-тный антиген иммобилизован путем физической адсорбции, а в другой биотинилированный антиген биоспецифически присоединен к поверхности лунок, покрытых стрептавиди-ном. В качестве модельных аутоантигенов были выбраны ти-реоглобулин и тиреопероксидаза, а источником аутоантител служила сыворотка крови людей с аутоиммунным тиреоиди-том Хашимото. Пассивно иммобилизованный антиген связывал более 90% поликлональных аутоантител, присутствующих в пробе, и обеспечивал проведение анализа в широком диапазоне измеряемых концентраций с высокой чувствительностью и низкой вариабельностью. Та же эффективность связывания аутоантител достигалась при значительно меньшей плотности покрытия поверхности и соответственно меньшем расходе модифицированного биотином антигена. Однако в случае биоспецифической иммобилизации уровень фона оказался повышенным, что снижало чувствительность определения. Оказалось, что фоновое связывание обусловлено эндогенным биотинсвязывающим иммуноглобулином в. Этот белок проявлял сродство к индивидуальной молекуле биотина и к ее функционально активному остатку в составе биоти-нилированных объектов, не связанных со стрептавидином. Новые данные о свойствах аутоантитела к биотину позволяют внести необходимые ограничения и коррективы в стреп-тавидин-биотиновую технологиию иммуноанализа и в метод определения биотина в сыворотке крови человека.

ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ У ДЕТЕЙ С ЭПИЛЕПСИЕЙ

Саватеев А.В., Шарф М.Я., Назаров П.Г., Любимов Ю.А.

ГУ НИИЭМ РАМН, Санкт-Петербург

Целью настоящего исследования явилось изучение состояния спонтанной и индуцированной пролиферативной активности лимфоцитов у детей с эпилепсией.

Были обследованы дети в возрасте от 3 до 16 лет. Основную группу составили дети больные эпилепсией, контрольную

- дети с вегетососудистой дистонией. Из крови выделяли мо-нонуклеары и наносили в лунки плоскодонного планшета в концентрации 200.000 клеток на лунку. Затем добавляли лимфоцитарные митогены - фитогемагглютинин, конконавалин А и митоген лаконоса в концентрациях 10 мкг/мл. Контролем служил физиологический раствор.

Через 3 суток инкубации в СО -термостате добавили МТТ в концентрации 5 мкг/мл. Реакцию оценивали по оптической плотности при длине волны 570 нм на автоматическом ридере.

Индекс реакции рассчитывали как отношение митоген-индуцированного включения красителя к спонтанному.

В рамках клинико-лабораторных исследований оценивали электроэнцефалограмму, клинический анализ крови и биохимических анализ крови.

Предварительный анализ полученных данных показал, что по средним величинам ответа лимфоцитов на митогенную стимуляцию клетки больных эпилепсией не отличались от клеток детей контрольной группы. Так, в основной группе среднее значение индекса ФГА-стимулированной активности составило 2,45; КонА-стимулированной активности - 1,02 и митоген лаконоса-стимулированной активности - 2,11, тогда как в контрольной группе эти значения составили соответственно 2,20, 1,13 и 2,08.

Вместе с тем, отмечена тенденция к повышению пролиферативного ответа на ФГА у детей, у которых в день исследования наблюдался эпилептический припадок. Средний уровень ответа на ФГА у детей с припадком составил 3,1 (2,6-5-3,9), тогда как у детей без припадка - 2,0 (1,6^2,6).

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ. ИММУНОГЛОБУЛИНОВ (Ю) В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Самойлович М.П., Грязева И.В., Крутецкая И.Ю., Кузенкова А.В., Климович В.Б.

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт, М3 РФ, Санкт-Петербург, Россия

Для определения концентраций I», наряду с радиальной иммунодиффузией, турбидимегрией и нефелометрией, применяется иммуноферментный анализ (ИФА) на основе моноклональных антител (МКА). Эпитопная направленность МКА обеспечивает высокую специфичность иммуноанализа. Концентрации ^М, ^А в сыворотке крови в норме находятся в диапазоне 0,05 - 18 мг/мл, и могут многократно возрастать при ряде заболеваний. Содержание этих ^ в секретах и экстраваскуляриых жидкостях, как правило, на несколько порядков ниже. Соответственно, при использовании единого варианта ИФА для анализа сыворотки крови прибегают к разведениям в 5000-50.000 раз, что сказывается на точности и воспроизводимости результатов, тогда как остальные жидкости исследуют неразведенными или малоразведенными.

Цель работы состояла в разработке вариантов ИФА с использованием МКА для исследования биологических жидкостей с высоким и с низким содержанием ^С, ^М, ^А.

Объектом исследования служили сыворотка крови, слюна, ликвор, моча здоровых людей и пациентов с различными заболеваниями. Работа выполнена методом ИФА с помощью МКА против ^ человека, созданных в лаборатории гибридом-ной технологии ЦНИРРИ.

Для исследования ^ в секретах и экстраваскуляриых жидкостях разработан высоко чувствительный двухцентровый (сэндвич) ИФА. На первой стадии анализа иммобилизованые на твердой фазе МКА против эпитопа, специфичного для исследуемого 1§, обеспечивают извлечение лиганда из анализируемой пробы. Затем связавшиеся ^ выявляют с помощью меченых пероксидазой МКА, направленных против второго эпитопа, топографически удаленного от первого. Динамический диапазон определяемых концентраций для 0,02-10 мкг/мл, для ^М 0,02-2,0 мкг/мл и для 1§А 0,08-4,0 мкг/мл. Пробы биологических жидкостей для проведения анализов разводят не менее, чем в 2-5 раз.

Для определения концентраций 1§ в сыворотке разработан метод конкурентного ингибирования. В этом методе ^ исследуемых проб конкурируют с иммобилизованными на твердой фазе очищенными ^А, или ^М за центры связывания меченых пероксидазой МКА, находящихся в растворе. Анализ проходит в одну стадию. Динамический диапазон определяемых концентраций - для - 0,1 - 5000 мкг/мл, для 1§М -0,1 - 500 мкг/мл и для ^А - 5,0 - 1000 мкг/мл. При исследовании ^А оптимальным является разведение сыворотки крови в 50 раз, а при исследовании и ^М - в 500 раз.

Таким образом, разработаны варианты ИФА с использованием МКА, один из которых предназначен для определения 1®С, ^М, ^А в сыворотке крови, а другой - в биологических жидкостях с низким содержанием

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ С ХИРУРГИЧЕСКИМ СЕПСИСОМ

Тихонова М.А., Овечкин А.В., Агеев Н.Л., Стрельцова Е.И. Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Останин А.А.

Институт клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск, Россия

Цель исследования. Оценка биологической (супрессорной и воспалительной) активности сыворотки у хирургических больных с сепсисом на различных этапах заболевания.

Материалы и методы. Было обследовано 28 хирургических больных (17 мужчин и 11 женщин, средний возраст 43,3±3,5 лет), у которых очаг инфекции был локализован в брюшной (16/28, 57% случаев) и грудной (3/28, 11 % случаев) полости, а также в мягких тканях (9/28, 32% случаев). Диагноз сепсиса выставляли по классификации ACCP/SCCM на основании наличия очага инфекции в сочетании с манифестацией системной воспалительной реакции в виде двух или более признаков SIRS: гипертермии >38°С или гипотермии <36°С; тахикардии >90/мин; тахипноэ >20/мин; лейкоцитов крови >12 х 10ч/л или <4 х 109/л). 46,4% больных (13/28) были обследованы в раннем 3,2±0,4 суток послеоперационном периоде, тогда как 15 человек (53,6%) - на более поздних этапах заболевания в среднем на 16±3 суток. Иммунологические исследования включали оценку количества CD3 Т-лимфоцитов, CD20 В-лимфоцитов, HLA-DR моноцитов, спонтанного и СопА-индуцированного уровня апоптоза, продукции 1L-2 и пролиферации соответственно в 24-, 48- и 72-часовых культурах мононуклеарных клеток (МНК), а также супрессорной, по влиянию на СопА-стимулированный пролиферативный ответ МНК тест-доноров, и воспалительной, по влиянию на функциональную активность нейтрофилов тест-доноров, активности сыворотки крови.

Результаты. При оценке степени тяжести обследованных больных средний балл по шкале APACHE-II в целом по группе составил 6,0±0,9, по модифицированной шкале SAPS

- 8,0±0,6. Эндотоксикоз тяжелой и крайне тяжелой степени был зарегистрирован в 85,7% случаев, ЛИИ в среднем по группе 6,8±1,6. Анализ исходного состояния иммунитета показал, что у больных сепсисом резко снижены количество HLA-DR моноцитов 23,4±1,3% против 44,0±2,0% у доноров, интенсивность СопА-индуцированной пролиферации 29.500±4.500 против 58.330±3.990 имп/мин у доноров и продукции 1L-2 39±4 против 75±3 Ед/мл у доноров). При этом регистрировалось значимое усиление спонтанного 15,1±2,5 против 6,5±0,6% и СопА-индуцированного 16,8±2,0 против 9,4±1,2% апоптоза лимфоцитов. Оценка биологической активности сыворотки показала (см. таблицу), что у больных с клиническими проявлениями SIRS только в 14,3% случаев в сыворотке крови обнаруживалось преобладание факторов с провоспалительной активностью, тогда как, чаще всего, у больных регистрировалась доминирующая супрессорная (противовоспалительная) активность сыворотки либо в изолированном (53,6%) случаев), либо в смешанном (14,3% случаев) виде. У 5 больных выраженность биологической активности сывороточных факторов не выходила за границы установленных доверительных интервалов нормы. Следует отметить, что уже на ранних этапах септического процесса более чем в половине случаев (7/13, 54%) сыворотка крови больных характеризовалась противовоспалительным/супрессорным действием. На более поздних этапах заболевания относительная доля таких больных увеличивалась до 80%, тогда как количество пациентов с доминирующей воспалитель-

Активность сыворотки В целом по группе (п=28) На ранних этапах (п=13) На поздних этапах (п=18)

Доминирующая воспалительная активность 4 (14,3%) 3 (23,0%) 1 (6,7%)

Доминирующая супрессорная активность 15 (53,6%) 5 (38,5%) 10 (66,7%)

Смешанная воспалительная

и супрессорная активности 4 (14,3%) 2 (15,5%) 2 (13,3%)

В пределах нормативных значений 5 (17,8%) 3 (23,0%) 2 (13,3%)

ной активностью сыворотки снижалось более чем в 3 раза (до 6,7%).

Заключение. Таким образом, супрессорная/противоспа-лительная активность сывороточных факторов регистрируется у больных с хирургическим сепсисом даже при наличии клинических проявлений SIRS. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости терапевтических стратегий, направленных на ослабление иммуносупрессорного действия эндогенных медиаторов и смещение баланса в сторону усиления активности провоспалительных цитокинов, например, за счет использования препаратов интерлейкина-2, интерфе-рона-гамма и др.

ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМНОГО ОТВЕТА НА ВОСПАЛЕНИЕ У ДЕТЕЙ ПРИ РАЗНЫХ ТИПАХ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ

Уфимцева Л.А., Тузанкииа И.А.

Областная детская клиническая больница №1, Екатеринбургский филиал института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,

Екатеринбург, Россия

Введение. В основе различных заболеваний у детей лежат нарушения тех или иных механизмов специфической и естественной защиты организма, выражающиеся формированием определенных иммунопатологических состояний - аллергических, аутоиммунных, нарушений противоинфекцион-ной защиты, которые определяют характер и прогноз заболеваний. Вопросы особенностей системного ответа на воспаление при каждом из них остаются невыясненными.

Цель исследования. Разработка оптимизирующих лечебно-диагностических технологий в виде возможной интеграции иммунологических и гемореологических исследований, а также объективизированная оценка эндотоксикоза как проявления синдрома системного ответа на воспаление у детей при разных типах иммунопатологических состояний, поступающих в специализированные отделения областной детской клинической больницы №1 в период обострения заболеваний.

Задачи исследования. 1) Выделить клинико-лаборатор-ные особенности, характеризующие каждый тип иммунопатологических состояний у детей исследуемой группы. 2) Выделить особенности гемореологии и степени выраженности эндотоксикоза у исследуемой группы детей. 3) На основе полученных данных разработать диагностический и лечебный алгоритм при поступлении детей в стационар.

Материалы и методы. Обследовано 80 детей в возрасте от 1,5 месяцев до 15 лет: 49 мальчиков и 31 девочка. I группу детей с нарушениями противоинфекциоиной защиты составили 45 человек (56% обследованных) со следующими диагнозами: бактериальный сепсис, обострение хронических неспецифических заболеваний легких, менингоэнцефалит, обо-

стрение хронического энтероколита и пиелонефрита. Во II группу детей с аллергическими заболеваниями вошли 15 детей (19% обследованных) с бронхиальной астмой, атопическим дерматитом и дерматореспираторным синдромом. III группу детей с аутоиммунными заболеваниями составили 20 человек (25% обследованных) с геморрагическим васкулитом, хроническим гломерулонефритом, системной красной волчанкой, склеродермией, ювенильным ревматоидным артритом, неспецифическим язвенным колитом.

Всем детям были проведены следующие лабораторные исследования: определение популяций и субпопуляций лимфоцитов, сывороточных иммуноглобулинов 4-х классов, оценка спонтанного и стимулированного фагоцитоза нейтрофилов, определение ЦИК, функциональные нагрузочные тесты; определение связывающей способности альбумина плазмы крови, концентрация средне-молекулярных пептидов в биологических жидкостях, показатели плазменного и тромбоцитар-но-сосудистого гемостаза, жидкокристаллические характеристики плазмы крови, концентрация острофазовых белков плазмы, рефрактометрия плазмы, характеристики евободно-ради-кального окисления, расчетные интегральные индексы интоксикации и элиминации.

Полученные результаты обрабатывались параметрическими и непараметрическими математическими методами с применением многофакторного, корреляционного и квартального анализа. Использовались пакеты прикладных программ STATISTIKA for Windows (StatSoft, Inc.) и Квазер (институт механики и математики УрО РАН).

Результаты. Для каждой группы больных были определены особенности развития системного ответа на воспаление. Так, у детей с нарушениями противоинфекциоиной защиты и аутоиммунными процессами обострение заболеваний сопровождалось выраженным эндотоксикозом с клиническими проявлениями интоксикации и полиорганными нарушениями, часть из них требовала проведения экстракорпоральных методов детоксикации.

Самая низкая связывающая способность альбумина сочеталась с самыми высокими показателями фибриногена сыворотки крови, что достоверно отличало группу детей с аутоиммунными процессами от двух других.

Наименьшие показатели степени выраженности эндотоксикоза наблюдались у детей с аллергическими заболеваниями, при этом отсутствовали и клинические проявления интоксикации. В этой группе детей самыми высокими, по сравнению с другими группами, были показатели связывающей способности альбумина.

Для каждой группы детей были выделены характерные особенности фагоцитарных реакций, концентрации сывороточных иммуноглобулинов и популяций лимфоцитов, высоко достоверно коррелирующие со степенью выраженности эндотоксикоза и типами иммунопатологических состояний.

Заключение. Полученные данные позволили разработать лечебно-диагностические алгоритмы, включающие объективизированную оценку степени тяжести больного.

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИОНОМИЦИН РЕЗИСТЕНТНЫХ CD4+ Т-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Хайдуков С.В., Поклонский Д.Л., Литвинов И.С.

Институт Биоорганической Химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия.

Ранее нами была показана различная чувствительность лимфоцитов периферической крови человека (ПКЧ) к низким дозам Са-ионофора - иономицина. Основной задачей представленной работы являлся фенотипический анализ субпопуляций CD4+ Т-клеток ПКЧ, чувствительных и резистентных к низким дозам иономицина.

Лимфоциты периферической крови выделяли на градиенте фиколла. Макрофаги и В-клетки удаляли паннингом. Для окрашивания клеток был использован метод прямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к маркерам клеточной поверхности: CD2, CD3, CD4, CD7, CD 16, CD19, CD28, CD29, CD44, CD45RA, CD45RO, CD56, CD62L и CD243 (MDR-1, Multi-Drug Resistance Protein). Антитела были мечены флуоресцеином, фикоэритрином и комплексом фикоэритрина с цианином-5. Анализ окрашенных клеток проводили методом трехцветной проточной цитометрии. Для обработки полученных результатов использовали программу ЕХР032 (Beckman-Coulter).

Низкие дозы иономицина (2цМ и 10 мин инкубации при 37°С) оказывали неодинаковое действие на субпопуляции CD4 Т-клеток. Резистентными к иономицину являлись клетки, сохраняющие жизнеспособность после обработки ионо-фором. В этом случае о фенотипе иономицин-чувствитель-ных популяций можно было судить при сравнении исходной и резистентной популяций. Как правило, субпопуляции клеток, исчезающие из исходной популяции ПКЧ после обработки иономицином, являются чувствительными к ионофору.

В состав резистентной к иономицину CD4 популяции входят клетки с фенотипом:

-CD45RA CD45R.O ;

- CD45RA CD45RO’CD7!o" и CD45RA~CD45RO"CD7' почти в равной пропорции;

- CD45RA CD45RO+CD29 и CD45RA~CD45RO+CD29+;

- в основном CD45RA CD45RO CD62L и небольшая часть (около 10%) CD45RA CD45RO CD62L*;

- в основном CD45RO CD28 и небольшая часть (около 10%) CD45R04CD28~.

Экспрессия CD44 на резистентной к иономицину CD4 популяции и на исходной популяции CD4 ПКЧ была практически одинаковая. Кроме того, иономицин-резистентная CD4 популяция обогащена клетками, экспрессирующими CD243 - касетную АТРазу, которая определяет множественную ре-зистеность к ксенобиотикам (MDR-1, Multi-Drag Resistance Protein). В целом, иономицин-резистентная CD4 популяция имела характерный фенотип Т-клеток памяти.

Обработка лимфоцитов ПКЧ иономицином привела к исчезновению из исходной CD4 популяции клетки следующих фенотипов:

- CD45RA+CD45RO ;

- CD45RA+CD7hli!h;

- CD45RO CD7h,i:i' почти полностью;

- CD45RA CD45RO CD29+;

- CD45RA CD45RO CD62Lll,sl';

- большую часть CD45RO CD28 клеток.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют

о чувствительности наивных CD4 Т-клеток к низким дозам иономицина. Популяция иономицин-резистентных CD4

1 -клеток в значительном своей части состоит из Т-клеток памяти. Вероятно, резистентность к иономицину может служить одной из характеристик CD4 Т-клеток памяти.

Работа поддержана грантом РФФИ № 00-04-48800.

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

Хайруллина P.M., Хаматдинова З.Р., Рыбаков И.Д., Терегулова Л.М.

Республиканская детская клиническая больница,

Уфа, Россия

Согласно современным представлениям, многие физиологические и метаболические процессы тесно связаны со свободно-радикальным окислением (СРО). В норме скорость свободно-радикального окисления и содержание свободных радикалов поддерживается на определенном уровне. Изменения этого процесса представляют собой раннюю, неспецифическую реакцию организма на различные воздействия. При нарушении регуляции СРО происходят структурно-функциональные повреждения клеточных мембран, меняется активность ряда ферментов и т.д., что становится молекулярной основой развития патологического процесса. Люминол-зави-симая хемилюминесценция (ХЛ) цельной крови - объективный метод исследования свободно-радикального окисления, не требующий специальных лабораторных условий, длительной подготовки материала к анализу. Метод основан на определении характера свечения биологического материала, связанного с реакциями свободно-радикального окисления. Для проведения иммунологического скрининга нами усовершенствован метод регистрации люминол-зависимой ХЛ цельной крови, установлены наиболее типичные хемилюминограммы, отражающие состояния нормы, гипер-и гипоэргические процессы. Установлено, что величина пика ХЛ зависит от фагоцитарной активности клеток, светосумма свечения за время измерения является интегральным показателем генерации активных форм кислорода, а крутизна нарастания свечения (наклон) отражает резервные возможности и скорость активации кислород-зависимого метаболизма клеток. Интенсивность ХЛ коррелирует с потреблением клетками кислорода и степенью завершенности фагоцитоза. В лаборатории иммунологии РДКБ хемилюминесценция регистрируется прибором ХЛМ-003, изготовленным Межвузовской лабораторией технических систем медико-экологических исследований Уфимского Государственного Авиационного Университета. Техника регистрация свечения проста, занимает не более 5-10 минут, отвечает всем требованиям, предъявляемым к экспресс-анализу. Исследования проводятся с 1997 года, обследовано более 2000 пациентов клиники как в процессе иммунологического мониторинга, так и для оценки эффективности базисной и иммунотропной терапии.

Диагностика аллергических состояний in vitro остается актуальной проблемой клинической иммунологии и аллергологии. Нами совместно с отделением биофизики ЦНИЛ БГМУ разработан способ диагностики сенсибилизации, методом регистрации показателей хемилюминесценции до и после экспозиции с аллергенами. Получен патент на изобретение № 2153673 “Способ определения сенсибилизации к аллергенам”. Обследовано более 300 пациентов , в том числе, в ситуациях, исключающих возможность постановки кожных проб. Исследования проводились в отделении иммуноаллергологии комплексно и включали, наряду с постановкой ХЛ и скарифика-ционных кожных тестов, определение IgE total и реакции на

гистамин методом XJI. Методом корреляционного анализа установлена обратная пропорциональная зависимость уровня IgE и наклона XJI-кривой, характеризующей резервные возможности клеток крови. Процент совпадения результатов кожного тестирования и данных XJI с аллергенами составил 78,8. В клинике РДКБ способ определения сенсибилизации к аллергенам методом хемилюминесценции применяется для выявления специфических аллергических реакций и является альтернативой кожному тестированию при наличии противопоказаний для скарификационых проб. Перспективными в настоящее время являются комплексные исследования, направленные на определение интенсивности ХЛ, данных кожных проб до и после СИТ. Предполагаемым результатом проводимых исследований, по-нашему мнению, будет определение ХЛ-критериев для СИТ. Разрабатываются диагностические комплексы для диагностики микотической сенсибилизации и микотической инфекции, включающие ХЛ с грибковыми антигенами, культуральную диагностику, ПЦР и ИФА. Все перечисленные тссты входят в диагностичесий комплекс, применяемый в Центре иммуноаллергологии РДКБ. Разработанные диагностические комплексы, включающие определение спонтанной люминол-зависимой хемилюминесценции цельной крови внедряются в отделениях клинической иммунологии Уфы и в городах республики Башкортостан -Октябрьском, Стерлитамаке, Туймазах.

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КОНКАНАВАЛИНА А И ФИТОГЕМАГЛЮТИНИНА ФАСОЛИ С СУБПОПУЛЯЦИЯМИ Т-КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Холоденко И.В., Сеферян К.Р., Хайдуков С.В., Литвинов И.С.

Институт Биооргинической химии

им М.М. Шемякина-Ю.А.Овчинникова РАН

Митогенные лектины, такие как конканавалин А (КонА) и фитогемаглютинин фасоли (ФГА), широко используются в иммунологических и медицинских исследованиях. Как правило, они применяются в качестве поликлональных активаторов Т-лимфоцитов и принято считать, что в этом случае они способны активировать все клоны Т-клеток. Однако с возрастом доля Т-клеток, обладающих способностью отвечать на КонА, значительно снижается (Miller R.A., et al. J. Cell. Physiol. 138, 175-182). Долгое время данный эффект объясняли снижением так называемого “пролиферативного потенциала” Т-лимфоцитов пожилых людей. Альтернативное объяснение -накопление с возрастом Т-клеток памяти, обладающих, в отличие от наивных Т-клеток, рядом специфических особенностей, - рассматривалось значительно реже. В данной работе проведена попытка проанализировать взаимодействие КонА и ФГА с субпопуляциями Т-клеток периферической крови человека (ПКЧ) и, в первую очередь, наивными Т-клетками и Т-клетками памяти.

Взаимодействие ФИТЦ-меченых КонА и ФГА с субпопуляциями Т-клеток периферической крови человека оценивали методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител к маркерам Т-клеток: CD3, CD4, CD7, CD45RA, CD45RO, меченых фикоэритрином и комплексом фикоэритрина с цианином-5.

Было показано, что не все CD3 клетки связывали КонА. Связывание КонА наблюдалось в основном с наивными CD45RA Т-клетками и с небольшой частью активированных Т-клеток. В свою очередь Т-клетки памяти, имеющие фено-

тип CD45RA CD45RO CD7 и CD45RA CD45RO CD7'“w, незначительно взаимодействовали с ФИТЦ-КонА. Следовательно, мишенью для действия КонА в первую очередь являются наивные Т-клетки. Как известно, доля CD4 CD45RO в периферической крови человека с возрастом увеличивается и достигает 60-70%. Таким образом, снижение т.н. “пролиферативного потенциала” Т-лимфоцитов у пожилых людей может быть объяснено накопление с возрастом Т-клеток памяти, значительно слабее взаимодействующих с КонА.

Напротив, ФГА связывался с большинством CD3 клеток. Согласно проведенному цитофлуориметрическому анализу, ФГА не обладал избирательностью в связывании с различными субпопуляциями Т-лимфоцитов.

Был проведен сравнительный анализ ответа лимфоцитов ПКЧ на КонА и ФГА in vitro. Пролиферативный ответ был зарегистрирован как для КонА, так и для ФГА. Однако удаление с помощью обработки иономицином большей части наивных Т-клеток приводило к резкому падению пролиферативного ответа на КонА, но не влияло на пролиферативный ответ вызванный ФГА.

Следовательно, в отличие от ФГА, КонА не является поликлональным активатором Т-клеток в полном смысле этого слова и, по-видимому, он не способен напрямую активировать Т-клетки памяти периферической крови человека.

Работа поддержана грантом РФФИ № 00-04-48800.

ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРОВ СВЕЧЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В МЕТОДЕ ПРЯМОЙ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

Шутко А.Н., Екимова Л.П.

Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт М3 РФ, Санкт-Петербург, Россия

Корректный количественный учет содержания полноценных CD-положительных клеток в общей фракции лимфоцитов затруднен без знания параметров гистограммы свечения.

Цель и задачи. Получение статистических характеристик вариабельности поклеточного содержания кластеров дифферен-цировки на лимфоцитах периферической крови (ЛПК) человека и сравнение их в двух разновидностях метода с использованием специфических моноклональных антител (МКАТ).

Материалы и методы. На проточном цитофлюориметре (“Beckton Dickinson”) обследованы 5 образцов ЛПК с применением специфических МКАТ, конъюгированных с флюорох-ромами ФТИЦ или ФЭ (производство “Beckton Dickinson Immunocytometry systems, CA”). Общее количество анализированных клеток при использовании CD3 - 5 х 105, при CD4 -5 х 105 и при CD34 - 3 х 105 (данные получены Н.Н. Шатини-ной в Исследовательском институте радиационной биологии и медицинны, Хиросима).

На флюоресцентном микроскопе (ФМ) “Opton” обследовано 10 образцов ЛПК доноров и онкологических пациентов с применением бинарных МКАТ к CD4 (FITS) и CD8+(PE) производства ДАКО. Общее количество анализируемых клеток 4000. Изображения полей зрения в проходящем свете и флюоресценции принимали на цифровой сенсор С 2500L (Япония, 2,342 х Ю6 пикселей) и анализировали на компьютере с помощью программы “Adobe Photoshop-6”, регистрируя удельное свечение поверхности клетки с поправкой на фон в ее окрестности (УСП).

Результаты и обсуждение. В проточном режиме получены распределения свечения log-нормального типа, в режиме микроскопирования - нормального, что объясняется особен-

ностями учета светового потока (СП): со всей поверхности клетки (СПВП) в первом случае и удельным - с единицы ее поверхности - во втором. Границы СПВГ1 от M-За до М+За с шагом а для обоих маркеров CD4 и CD3: 0,34±0,04; 0,49±0,04; 0,7±0,03: 1.32+0,03: 1,74±0,08 и 2,3±0,17 при М=1.0. Количество клеток со светимостью ниже диапазона средних значений, определенное интегрированием участков гистограммы составило 13,7±0,83% независимо от определяемого маркера CD4 или CD3.

В режиме ФМ коэффициент вариации УСП составил 0,34±0,018 независимо от изучаемых маркера CD4 или CD8 . Количество как CD4 , так и CD8 клеток в распределении, имеющих УСП ниже диапазона средних значений, достигло 16,1 ±1,7%. Однако эта величина статистически не отличалась

от аналогичного параметра СПВП, полученного в проточном варианте.

Распределение СБ34 клеток удовлетворяет закону Пуассона, для которого не применимо понятие средних значений и, соответственно, долю клеток с СПВП ниже этого диапазона статистически выделить невозможно.

Следует отметить, что ранее в методе розсткообразования процент дискриминируемых позитивных клеток по установленному лимиту количества ассоциированных эритроцитов оценивался нами в 14,2±3,3%.

Заключение. В общем пуле представительных субпопуляций СЭ-положительных клеток имеется доля (0,13 - 0,16) с плотностью поверхностных кластеров дифференцировки, меньшей нижней границы диапазона ее средних значений.