Научная статья на тему 'Иммунологические и морфологические факторы ремоделирования кожи у пациентов с атопическим дерматитом'

Иммунологические и морфологические факторы ремоделирования кожи у пациентов с атопическим дерматитом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
307
111
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
атопический дерматит / ремоделирование кожи / ЦИТОКИНЫ / ультраструктура кожи / Atopic dermatitis / skin remodeling / Cytokines / skin ultrastructure

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Денисов А. А., Климов В. В., Логвинов С. В.

Обследовано 20 пациентов с атопическим дерматитом и 10 здоровых добровольцев для оценки концентраций IL-4, IFN-ƒ, IL-10 и IL-17 в кожных экссудатах и изучения ультраструктуры кожи методом трансмиссионной электроноскопии. Были выявлены следующие особенности ремоделирования кожи: повышение содержания IL-10 в кожном экссудате, акантоз, изменения коллагеновых волокон, увеличение стареющих форм фибробластов, лимфоцитарная инфильтрация, фиброз и гиалиноз. Эти черты могут служить основанием для подходов к локальной реабилитации болезни.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Денисов А. А., Климов В. В., Логвинов С. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

20 patients with atopic dermatitis and 10 healthy volunteers were examined to evaluate concentrations of IL-4, IFN-ƒ, IL-10 and IL-17 in skin exudates and skin ultrastructure. Values of cytokines were defined using ELISA whereas skin ultrastrucrure were examined by transmission electronoscopy. Following features of skin remodeling were revealed: high level of IL-10 in skin exudate, akantosis, change of collagen fibres, and increase in aging fibroblasts, lymphatic infiltration, fibrosis and hyalinosis. All these may serve a base for approaches to the local rehabilitation of atopic dermatitis.

Текст научной работы на тему «Иммунологические и морфологические факторы ремоделирования кожи у пациентов с атопическим дерматитом»

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ КОЖИ У ПАЦИЕНТОВ С АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ

А.А. Денисов, В.В. Климов, С.В. Логвинов

ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Томск

E-mail: klimov@mail.tomsknet.ru

IMMUNOLOGICAL AND MORPHOLOGICAL FACTORS OF SKIN REMODELING IN PATIENTS WITH ATOPIC DERMATITIS

A.A. Denisov, V.V. Klimov, S.V. Logvinov

Siberian State Medical University, Tomsk

Обследовано 20 пациентов с атопическим дерматитом и 10 здоровых добровольцев для оценки концентраций 1-4, №N-7, ПЛ0 и ПЛ7 в кожных экссудатах и изучения ультраструктуры кожи методом трансмиссионной элек-троноскопии. Были выявлены следующие особенности ремоделирования кожи: повышение содержания ПЛ0 в кожном экссудате, акантоз, изменения коллагеновых волокон, увеличение стареющих форм фибробластов, лимфоцитарная инфильтрация, фиброз и гиалиноз. Эти черты могут служить основанием для подходов к локальной реабилитации болезни.

Ключевые слова: атопический дерматит, ремоделирование кожи, цитокины, ультраструктура кожи.

20 patients with atopic dermatitis and 10 healthy volunteers were examined to evaluate concentrations of IL-4, IFN-y , IL-10 and IL-17 in skin exudates and skin ultrastructure. Values of cytokines were defined using ELISA whereas skin ultrastrucrure were examined by transmission electronoscopy. Following features of skin remodeling were revealed: high level of IL-10 in skin exudate, akantosis, change of collagen fibres, and increase in aging fibroblasts, lymphatic infiltration, fibrosis and hyalinosis. All these may serve a base for approaches to the local rehabilitation of atopic dermatitis.

Key words: atopic dermatitis, skin remodeling, cytokines, skin ultrastructure.

Атопический дерматит (АтД) является широко распространенным рецидивирующим заболеванием кожи, которое сопровождается зудом и другими клиническими проявлениями и трудно поддается лечению [1, 4]. В последние годы вскрыты новые звенья патогенеза болезни, которые касаются эпикутанной сенсибилизации и тканевого ремоделирования кожи при АтД [10], при этом длительная персистенция воспаления даже в периоде ремиссии поддерживается различными иммунорегуляторными субпопуляциями Т-клеток и секретируемыми ими и другими клетками цитокинами [3, 7, 11, 14]. Ремоделирование кожи - это стойкая, но обратимая морфофункциональная перестройка кожной ткани с вовлечением иммунной системы, клинически проявляющаяся характерными элементами (лихенификация) и сухостью [4, 10].

Цель работы: оценка иммунологических (цитокины) и морфологических аспектов ремоделирования кожи при атопическом дерматите.

Материал и методы

Обследованы 20 больных АтД обоих полов в возрасте 18-45 лет и 10 здоровых добровольцев 17-24 лет. Диагноз АтД устанавливался на основании национальных и международных согласительных документов по данной патологии, данных анамнеза, клинической картины, кожного аллерготестирования, содержания ^Е, также принимались во внимание критерии национальных и международных согласительных документов по данной патологии [1, 4]. При исследовании соблюдались принципы информированного согласия пациентов в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации “Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека” с поправками 2000 г и “Правилами клинической практики в РФ”, утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г № 266.

Концентрация цитокинов определялась в бесклеточ-ных кожных экссудатах, получаемых согласно медицинской технологии “Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии” ФС № 2010/217 от 10.06.2010 [5]. Переднюю сторону предплечья дезинфицировали спиртом, затем в средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляли верхний слой эпидермиса, не затрагивая более глубокие слои кожи. При удалении рогового слоя на участке кожи площадью

0,5 х 0,5 см образовывалась поверхность с характерным блеском. Слой шиповатых клеток, базальных клеток и базальная мембрана эпидермиса оставались интактными. Исследования проводили в периоде ремиссии, при этом выбирали два типа кожных зон: условно здоровые и ли-

хенифицированные. На скарифицированный участок помещали камеру объемом 1,0 мл, предварительно заполненную с помощью шприца стерильной средой 199. Камеру фиксировали на коже с помощью лейкопластыря. Круговая обвязка предплечья бинтом обеспечивала наиболее надежную фиксацию камеры.

Через 6 ч камера снималась, ее содержимое пипеткой собиралось и переносилось в пробирку. После центрифугирования экссудата получался супернатант, который в дальнейшем использовался для определения цитокинов.

С этой целью использовался твердофазный иммуно-ферментный анализ с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Для определения продукции П-4, П-10, П-17 и Ж-у были использованы наборы реагентов ЗАО “Вектор-Бест” (Новосибирск). Постановку иммуноферментного анализа проводили в соответствии с методическими рекомендациями производителя. Количество выражали в пикограммах на миллилитр (пг/мл).

Изучение ультраструктуры проводили методом трансмиссионной электронной микроскопии [6], ультратонкие срезы готовили по методике Б. Уикли [8].

Для этого взятую ткань кожи фиксировали в забуфе-ренном 0,1 М какодилатным буфером (pH 7,4) 2,5% растворе глютарового альдегида в течение 2 ч при температуре 4 °С. Далее дважды промывали какодилатным буфером (pH 7,4) по 10-15 мин, после чего постфиксиро-вали в 1% растворе четырехокиси осмия (на 0,1 М како-дилатном буфере) в течение 2 ч с последующим двукратным отмыванием какодилатным буфером (по 10-15 мин). Затем материал дегидратировали в этиловых спиртах восходящей концентрации: в 50% спирте - 15-20 мин, в 70% - оставляли на ночь, затем в 80%, 90%, 96% - по 1520 мин в каждом, в абсолютном спирте или ацетоне — по 20-30 мин дважды.

Дегидратированные препараты заключали в смесь смол эпон-аралдит. Для этого готовилась смесь смол в следующих пропорциях: эпон 812 - 4 г, аралдит 502 - 2 г, эпон ББ8А - 9 г, катализатор БМР-30 - 8 капель.

Пропитка препаратов проводилась по следующей схеме: смесь смол : абсолютный ацетон 1:3 — 4-8 ч (можно на ночь); смесь смол : абсолютный ацетон 1:1 — 4-8 ч; смесь смол : абсолютный ацетон 3:1 — 4-8 ч; смесь смол

— от 12 до 24 ч; новая смесь смол в другой посуде — от 12 до 24 ч.

Затем препараты переносились в свежую смесь смол для полимеризации. Полимеризацию проводили в течение 1,5-2 суток при 60 °С.

Ультратонкие срезы толщиной 60-100 нм готовили на ультротоме ‘ШЮоте III” (“ЬКБ”, Швеция). Полученные срезы наносили на сетки-подложки с формваровой пленкой-подложкой и контрастировали 2%-м раствором

уранилацетата на 50% этаноле (10-20 мин при 37 °С) и цитратом свинца (от 3 до 10 мин при комнатной температуре) по E. Reynolds [13]. Полученные препараты просматривали в электронном микроскопе “JEM-100 CXII” (“JEOL”, Япония) с апертурной диафрагмой 25-30 мкм при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась с помощью пакета статистических программ “SPSS”. Поскольку колебания исследованных ци-токинов не подчинялись нормальному закону распределения, для представления количественных данных использовались описательные статистики: Ме (медиана), Q1 (1-й квартиль (25%)) и Q3 (3-й квартиль (75%)). Для всех имеющихся выборок данных применялись непараметрические критерии Краскал-Уолиса и Манна-Уитни. Различие двух сравниваемых величин считалось статистически значимым с надежностью Р>0,95, если вероятность их тождества оказывалась меньше 5%.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования концентраций IL-4, IFN-y, IL-10 и IL-17 в кожных экссудатах, взятых на разных участках кожи (условно здоровых и лихенифицированных), отражены в таблице. Напомним, что лихенификация -это клинический эквивалент ремоделирования кожи [4, 10].

Как видно из таблицы, место установки камеры влияло только на IL-10, содержание которого существенно возрастало в очагах лихенификации по сравнению со здоровыми участками кожи. Это согласовывается с особенной ролью IL-10 в аллергических процессах [15]. IL-10 вырабатывается многими видами клеток (Th2, Tr1, дендритные клетки и др.); по-видимому, многие из них вовлечены в процессы ремоделирования кожи.

Таким образом, в очагах лихенификации (ремоделирования) по сравнению со здоровыми участками кожи отмечается повышение содержания IL-10, что может свидетельствовать о важной роли данного цитокина в процессах ремоделирования кожи при АтД и быть диагностическим критерием этого процесса.

При электронной микроскопии эпидермиса пациентов с АтД в стадии ремиссии наблюдалось уменьшение количества клеточных слоев рогового слоя и пластов межклеточных липидов. Отмечались выраженные проявления акантоза. Эпидермис был утолщен и формировал тяжи в сосочковый слой. В базальном и шиповатом слоях отмечалось некоторое расширение межклеточных пространств (рис. 1).

Ядра кератиноцитов шиповатого слоя были округлой формы, богаты эухроматином, в части из них визуализировались довольно крупные ядрышки. В большинстве клеток были видны многочисленные тонофибриллы. Межклеточные контакты в шиповатом и базальном слоях были представлены преимущественно десмосомами, ультраструктурная организация которых, как правило, сохранена (рис. 2). В тонких клеточных отростках вблизи десмосом нередко обнаруживался мелкогранулярный материал, возможно, являющийся следствием деструктивных процессов.

В значительной части эпителиоцитов росткового слоя

Рис. 1. Ультраструктурная организация шиповатого слоя эпидермиса при АтД в стадии ремиссии. Ув. 1900

Рис. 2. Ультраструктура десмосом в шиповатом слое эпидермиса при АтД в стадии ремиссии. Ув. 19000

Таблица

Содержание ^-4, ^-у, ^-10 и ^-17 в экссудате “кожного окна” у здоровых лиц и пациентов с АтД в периоде ремиссии в зависимости от места установки камеры, Ме (а1-а3)

Группа IL-4 (пг/мл) IFN-y (пг/мл) IL-10 (пг/мл) IL-17 (пг/мл)

Контроль Здоровый участок кожи в периоде ремиссии Участок лихенификации в периоде ремиссии 0,4B(0,4-0,7)n=10 0,B (0,14-0,97)n=7 0,9B (0,4-1,2)п=6р1 46(3B,B-B1,7B)n=10 27,6 (22-44)n=6 31 (10,3-65,7)n=7р1 7(3,B-13,B)n=10 11,6 (10-22)n=B 37,B (30-65,5)n=5р1, р2 23(7,7B-34,BB)n=8 22 (11,5-36,7)n=7 15(7-29)n=10

Примечание: Ме - медиана, Q1 - первый квартиль, Q3 - третий квартиль; р1 - статистическая значимость различий в сравнении с контрольной группой (р<0,05), р2 - статистическая значимость различий в сравнении со здоровым участком кожи в периоде ремиссии (р<0,05).

Рис. 3. Ультраструктурная организация кератиноцита базального слоя эпидермиса при АтД в стадии ремиссии: локальное скопление гранул меланина, низкое содержание микрофибрилл, отек митохондрий с деструкцией крист, расширение цистерн эн-доплазматического ретикулума и перинуклеарного пространства. Ув. А - 10000, Б (фрагмент А) - 290000

наблюдалась вакуолизация цитоплазмы, которая чаще всего возникает в результате деструкции митохондрий. Указанные органеллы в большинстве своем были отечны, с разрушенными кристами и деструкцией внутренней мембраны, иногда содержали мембранные пластинчатые тельца. Содержание тонофиламентов было не велико. Комплекс Гольджи был выражен слабо. Отмечалось расширение цистерн гранулярной эндоплазматической сети. В большей части кератиноцитов регистрировалось низкое содержание гранул меланина. Их скопление обнаруживалось в околоядерной области, обычно в апикальной части (рис. 3).

В некоторых кератиноцитах выявлялось умеренное или высокое количество меланиновых гранул, полирибосом и тонофиламентов в цитоплазме (рис. 4).

Меланоциты, локализующиеся преимущественно в базальном слое эпидермиса, содержали в цитоплазме небольшое количество меланосом различной степени зрелости. Данные клетки характеризовались реактивными изменениями, проявляющимися расширением цистерн эндоплазматического ретикулума, реже - их фрагментацией, набуханием митохондрий, вакуолизацией цитоплазмы.

В базальном и шиповатом слоях удалось наблюдать клетки Лангерганса. На полутонких и ультратонких срезах они отличались относительно светлой цитоплазмой и низкой ее электронной плотностью. В ней находились единичные цистерны эндоплазматического ретикулума и полирибосомы. Цистерны, как правило, были расширены и формировали крупные вакуоли. Визуализировались первичные и реже вторичные лизосомы, мультиве-зикулярные тельца. Большинство митохондрий были набухшими с деструкцией крипт. Выявлялись специфические гранулы вытянутой формы, ультраструктура которых характеризовалась периодичностью в виде поперечной исчерченности. Тельца нередко контактировали с плаз-молеммой. Клеточная мембрана не образовывала десмо-сомовидных контактов с соседними клетками. Отростки описываемых клеток могли контактировать с базальной мембраной эпидермиса (рис. 5).

В соединительной ткани дермы на полутонких сре-

Рис. 4. Умеренное содержание гранул меланина и пучков микрофибрилл, расширение цистерн гранулярного эндоплазма-тического ретикулума, многочисленные полирибосомы в цитоплазме базального кератиноцита при АтД в стадии ремиссии. Ув. 19000

зах обнаруживались отечные изменения. Коллагеновые волокна были утолщены, гомогенизированы в сосочковом слое. Коллагеновые фибриллы были изменены, большая часть из них утратила характерную поперечную ис-черченность (рис. 6). На некоторых участках сосочкового слоя и базальной мембраны имели место явления фиброза и гиалиноза.

В клеточном составе дермы наблюдались изменения, проявляющиеся умеренной лимфоцитарной инфильтрацией, особенно на границе сосочкового и сетчатого слоев. Отмечалось увеличение стареющих форм фибробла-стов, которые отличались пикноморфными изменениями в виде повышенной базофилии и электронной плотности цитоплазмы и ядра, деформацией, сморщиванием клеточного тела и отростков. Небольшая часть фиброб-ластов, напротив, характеризовалась выраженными признаками гипертрофии.

Описанные электронномикроскопические признаки являются оригинальными и лишь в некоторых деталях совпадают с данными литературы [2, 9].

А Б

Рис. 5. Клетка Лангерганса, контактирующая с базальной мембраной (БМ) эпителия и соседними кератиноцитами. В цитоплазме специфические гранулы с характерной периодичностью ультраструктур. АтД в стадии ремиссии. Ув. А - 10000, Б - 29000

А Б

Рис. 6. Ультраструктурные изменения коллагеновых фибрилл сосочкового слоя кожи при АтД в стадии ремиссии. Размытость ультраструктуры, утрата характерной периодичности, локальная деструкция части фибрилл. Ув. А - 48000, Б - 58000

Таким образом, ультраструктурные особенности кожи при АтД в периоде ремиссии характризуют ремоделирование кожи как выраженный акантоз, изменение коллагеновых фибрилл с утратой ими поперечной исчерчен-ности, умеренную лимфоцитарную инфильтрацию, увеличение стареющих форм фибробластов с пикноморф-ными изменениями в виде повышенной базофилии и электронной плотности цитоплазмы и ядра, фиброз и гиалиноз сосочкового слоя и базальной мембраны.

Описанные нами впервые иммунологические и морфологические характеристики ремоделирования кожи при АтД имеют научно-практическое значение, поскольку могут быть использованы в разработке локальных подходов в реабилитации данной патологии.

Литература

1. Атопический дерматит: Рекомендации для практикующих врачей. Российский национальный согласительный документ по атопическому дерматиту / под ред. Р.М. Хаитова, А.А. Кубановой. - М. : Фармарус-Принт, 2002. - 192 с.

2. Белоусова ТА., Горячкина М.В., Филиппова В.А. Современная стратегия наружной терапии воспалительных дерматозов // Дерматология: приложение к журналу Consilium Medicum. - 2009. - № 3. - С.15-20.

3. Загрешенко Д.С., Климов В.В., Денисов А.А. и др. Цитокины “кожного окна” и параметры SCORAD при атопическом дерматите // Сибирский медицинский журнал (Томск). -

2008. - Т. 23. - № 3, вып. 1. - С. 95-96.

4. Кочергин Н.Г. Диагностика и лечение атопического дерматита у детей и взрослых / Европейская академия аллергологии и клинической иммунологии; Американская академия аллергии, астмы и иммунологии; Группа PRACTALL // Клиническая дерматология и венерология. - 2007. - № 1. -С. 46-53.

5. Климов В.В., Денисов А.А., Фирсова Е.К. и др. Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии: Медицинская технология ФС № 2010/217 от 10.06.2010.

6. Курупу В.Я. Электронная микроскопия. - Киев : Вища школа, 1984. - 208 с.

7. Система цитокинов: теоретические и практические аспекты / под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова. - Новосибирск : Наука, 2004. - 324 с.

8. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих / под. ред. Ю.В. Полякова. - М : Мир, 1975. — 326 с.

9. Chamlin S.L., Kao J., Frieden I.J. et al. Ceramide-dominant barrier repair lipids alleviate childhood atopic dermatitis: Changes in barrier function provide a sensitive indicator of disease activity // J. Am. Acad. Dermatol. - 2002. - Vol. 47. - P. 198-208.

10. Katayama I. Atopic dermatitis and remodeling of the skin // Japanese Journal of Clinical Dermatology. - 2002. - Vol. 56. -P. 39-42.

11. Leung D.Y. Atopic dermatitis: new insight and opportunities for therapeutic intervention // J. Allergy Clin. Immunol. - 2000. -Vol. 105. - P. 860-876.

12. Norgales K.E. et al. IL-22-producing “T22” T cells account for upregulated IL-22 in atopic dermatitis despite reduced

IL-17-producing T(H)17 T cells // J. Allergy Clin. Immunol. -

2009. - Vol. 123. - P. 1244-1252.

13. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy // J. Cell Biology.

- 1963. - No. 17. - P. 208-212

14. Sonkoly E., Muller A., Lauerma A.I. IL-31: a new link between T cells and pruritus in atopic skin // J. Allergy Clin. Immunol. -2006. - Vol. 117. - P. 411-417.

15. Wu K., Bi Y., Sun K. et al. IL-10-producing type 1 regulatory T cells and allergy // Сellular & Molecular Immunology. - 2007.

- Vol. 4. - P. 269-275.

Поступила 23.03.2011

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.