CC BY
27
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТОКСИЧЕСКОЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ, ВЫЗВАННОЙ БУТОКСИЭТАНОЛОМ
Федык О.В., Самоделкин Е.И., Мельниченко В.Я., УДК: 616.155.194.18:612.017
Косарева П.В., Сивакова Л.В., Прохорова Е.С.
Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера, Пермь
Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова
Резюме
Токсическую гемолитическую анемию моделировали путем внутрибрюшинного введения нелинейным белым крысам 2-бутоксиэтанола (ВЕ); после 30-дневного наблюдения анализировали мазки костного мозга, проводили гистологическое исследование ткани тимуса, селезенки, пейеровых бляшек, оценивали результаты реакции агглютинации эритроцитов животных, взятых до начала эксперимента, сывороткой, взятой по окончании эксперимента. У животных с токсической гемолитической анемией, вызванной введением бутоксиэтанола, к 30 суткам эксперимента выявлена тенденция к гиперплазии красного ростка костного мозга, развитие аутоиммунной реакции, направленной в отношении собственных эритроцитов; в центральных и периферических органах иммуногенеза отмечается редукция лимфоидной ткани, соответствующая реакции организма на стресс.
Ключевые слова: токсическая гемолитическая анемия, миелограм-
ма.
CYTOLOGY OF THE BONE MARROW OF RATS IN EXPERIMENTAL MODEL OF TOXIC HEMOLYTIC ANEMIA
Fedyk O.V., Samodelkin E.I., Melnichenko V.Ja., Kosareva P.V., Sivakova L.V., Prohorova E.S.
To characterize of changes in organs of immunogenesis, myelogram of rats and to study of possibility of formation of autoantibodies to their own red blood cells in experimental model of toxic hemolytic anemia. Materials and methods. Toxic hemolytic anemia was simulated by intraperitoneal administration 2-butoxyethanol (BE) to nonlinear white rats; after 30-days observations bone marrow smears were analyzed. Also we studied histology of thymus, spleen, Peyer's patches and the agglutination of red blood cells obtained in the beginning of the experiment, by serum obtained at the end of the experiment. Results. On the 30th day of the experiment in animals with toxic hemolytic anemia caused by the introduction of butoxyethanol, a tendency towards a red growth hyperplasia of bone marrow, development of an autoimmune response directed against its own red blood cells and the reduction of lymphoid tissue in ctntral and peripheral organs of immunogenesis were founded.
Keywords: toxic hemolytic anemia, myelogram.
Гемолитические анемии составляют примерно 5% всех анемий [7]. Приобретенные токсические гемолитические анемии в последнее время становятся чрезвычайно актуальны в связи с постоянно возрастающими антигенными нагрузками [2, 7, 8]. В настоящее время все еще остается немало спорных вопросов, касающихся патогенеза и патоморфологии приобретенных гемолитических анемий, ответы на которые могут дать только экспериментальные исследования, в связи с чем разработка новых экспериментальных моделей приобретенных гемолитических анемий является актуальной задачей.
Цель исследования: создание модели приобретенной токсической гемолитической анемии путем введения экспериментальным животным 2-бутоксиэтанола и изучение ее миелограммы и иммунологии.
Материалы и методы
В эксперименте задействовано 40 животных - нелинейных белых крыс (самцов и самок) четырехмесячного возраста, с массой тела 150-200 г, содержащихся в стандартных условиях экспериментально-биологической клиники - вивария (свободный доступ к пище и воде и 12-14 часовой световой день). Все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией
о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.III.1986 (Текст изменен в соответствии с положениями Протокола (ETS № 170), после его вступления в силу 2 декабря 2005 года; Лиссабонский договор о внесении изменений в Договор о Европейском союзе и Договор об учреждении Европейского сообщества вступили в силу 1 декабря 2009 года).
Моделирование приобретенной токсической гемолитической анемии осуществляли по оригинальной методике (Способ моделирования приобретенной токсической гемолитичсеской анемии в эксперименте. Приоритетная справка от 11 июля 2013 г.) путем однократного интраперитонеального введения лабораторному животному 2-бутоксиэтанола (ВЕ) в эмпирически выбранной дозировке 20 мг/кг массы тела (4 мг на животное). 2-Бутоксиэтанол (C6H14O2) - широко используемый во многих отраслях промышленности реагент; к настоящему времени в условиях in vitro установлено, что метаболиты 2-бутоксиэтанола являются сильными гемолитическими ядами; Ghanayem B.I., Sullivan Ch.A., 1993, проведено исследование in vitro, в котором определяли влияние BE на эритроциты из 10 видов млекопитающих, включая человека; в исследованиях была установлена видовая специфичность в отношении развития гемолитической анемии под действием бутоксиэтанола [4]. Однако способа экспериментального моделирования приобретенной
токсической гемолитической анемии с использованием 2-бутоксиэтанола в литературе не найдено. Сформировано 2 экспериментальных группы по 20 животных в каждой: I группа - интактные животные, находящиеся в стандартных условиях вивария, II группа - введение ВЕ.
Ежедневное наблюдение за животными включало в себя регистрацию поведения, внешнего вида, физиологических функций. До начала эксперимента и по его окончании у животных исследовали показатели периферической крови: количество эритроцитов, ретику-лоцитов, концентрацию гемоглобина. Перед началом эксперимента забирали венозную кровь у животных в количестве 60-100 мкл для получения индивидуальной эритромассы с целью использования ее в последующих иммунологических исследованиях и проб сыворотки. На 10 сутки проведения эксперимента животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии и осуществляли забор аутопсийного материала для последующего гистологического исследования (селезенка, тимус, пейеровы бляшки), а также забор венозной крови для получения сыворотки и постановки реакции агглютинации. Из костного мозга бедренной кости готовили мазок, фиксировали и окрашивали по Майн-Грюнвальду, Романовскому-Гимзе и микроско-пировали под иммерсией, подсчитывая по 500 клеток в мазке. Статистический анализ выполнен при помощи программного пакета Biostat.
Гистологическое исследование выполнено в соответствии со стандартными методиками с использованием окраски гематоксилином и эозином [Ромейс Б., 1954; Лилли Р., 1969]. Визуализацию и фотосъемку микропрепаратов проводили на микроскопе Micros (Австрия) в программе Scope Photo. Количественный анализ изображений осуществляли в программе ImageJ. Проводя гистометрический анализ ткани селезенки, определяли относительный объем белой пульпы, используя функцию «Сетка».
По окончании эксперимента проводили реакцию агглютинации сывороткой животных аутологичных эритроцитов, полученных в начале эксперимента в соответствии с Инструкцией по применению диагностикума клещевого энцефалита сухого для РТГА, РСК, РРГ и РТНГА Минмедпрома СССР; 1990. Пробы инкубировали в течение 2 час. при температуре +4° С и затем - в течение 30 минут при температуре +37° С (для выявления действия тепловых и холодовых антител). Результаты реакции оценивали общепринятым способом и выражали с учетом log-нормального распределения данных в виде к^2-обратных титров антител. Статистический анализ полученных данных выполнен при помощи программного обеспечения Biostat.
Результаты
Во время проведения эксперимента не отмечено случаев гибели животных. У животных, подвергнутых внутрибрюшинному введению 2-бутоксиэтанола, к 30
суткам эксперимента отмечалась тенденция к гиперплазии эритроидного ростка, что проявлялось в увеличении индекса созревания эритрокариоцитов - 2,7 ± 0,03 в сравнении с контрольной группой - 1,2 ± 0,08 (р < 0,05). При этом лейкоэритробластическое соотношение у животных опытной группы составило 1,29 ± 0,012, контрольной
- 1,48 ± 0,042 (р > 0,05), то есть не отличалось от средних нормальных показателей [3, 5]. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что при токсической гемолитической анемии, как и при любой другой гемолитической анемии, костный мозг стремится компенсировать потерю эритроцитов стимуляцией эритропоэза, но в условиях токсического воздействия эта стимуляция оказывается неэффективной.
При проведении анализа показателей периферической крови в опытной группе к концу эксперимента выявлено статистически значимое снижение концентрации гемоглобина и уменьшение количества эритроцитов по сравнению с исходными данными. Результаты исследования количества ретикулоцитов в мазках: интактные животные: 1,429 ± 0,192% до начала эксперимента, 1,787 ± 0,235% по окончании эксперимента; (р > 0,05); введение ВЕ: 1,488 ± 0,115% до начала эксперимента, 4,322 ± 0,127% по окончании эксперимента (р < 0,05).
Результаты реакции агглютинации: I группа - отсутствие агглютинации во всех лунках планшета; II группа
- средние значения 6,2 ± 0,15. Таким образом, присутствие антител к собственным эритроцитам выявлено в группе с введением ВЕ, то есть введение бутоксиэтанола провоцирует развитие аутоиммунной реакции, направленной в отношении собственных эритроцитов.
Гистологическое строение ткани тимуса животных I группы соответствовало видовой норме. Гистологическое исследование ткани тимуса животных II группы выявило участки гибели лимфоцитов как в корковом, так и в мозговом слоях. При этом у 40% животных в корковом слое гибель лимфоидных клеток была более выражена, чем в мозговом, что обеспечило наличие феномена инверсии слоев, также у 40% животных группы гибель лимфоцитов отмечалась как в корковом, так и в мозговом слое тимуса, что морфологически выражалось в исчезновении инверсии. У 20% животных этой экспериментальной группы строение долек не было нарушено, но на этом фоне отмечались участки гибели лимфоцитов, в основном, в корковом веществе. У четырех животных группы (20%) в дольках отмечалось замещение лимфоидной ткани жировой тканью. Также в кортикальном и медуллярном слоях у всех животных группы выявлялись участки кол-лагенизации стромы.
У 4-х животных группы (20%) в мозговом слое тимуса выявлялись кистозно-расширенные тимусные тельца. У 70% животных в корковом слое долек также выявлялись эпителиальные канальцы, выстланные кубическими эпителиальными клетками. У всех животных, подвергнутых внутрибрюшинному введению ВЕ, в ткани
тимуса выявлялись в большом количестве тучные клетки - крупные клетки с базофильными гранулами, нередко имеющие неправильную форму. Тучные клетки обнаруживали, в основном, в междольковой соединительной ткани, в соединительной ткани перегородок внутри долек вблизи кровеносных сосудов, но также и в паренхиме тимуса - в корковом веществе долек, в участках гибели лимфоидных клеток.
Таким образом, у животных, которым интрапе-ритонеально был введен ВЕ с целью моделирования приобретенной токсической гемолитической анемии, гистологически мы выявляли признаки акциденталь-ной инволюции тимуса, сопровождающей, по Г. Селье, острый стресс.
Строение ткани селезенки интактных животных соответствовало видовой норме; относительный объем белой пульпы в селезенке здоровых крыс составляет в среднем 30,18 ± 2,69%. В селезенке животных опытной группы выявлено значительное уменьшение относительного объема белой пульпы (16,33 ± 0,55%; р < 0,05 по сравнению с контрольной группой). У всех животных обнаружен выраженный гемосидероз красной пульпы, а также ее обеднение клеточными элементами (100%) на фоне полнокровия синусоидных капилляров (80%). Как в красной, так и в белой пульпе выявлялись очаги гибели лимфоидных клеток. Таким образом, при исследовании селезенки животных, подвергнутых введению ВЕ, мы наблюдали те же закономерности, что и при исследовании ткани тимуса - редукцию лимфоидной ткани, соответствующую реакции организма на стресс.
При исследовании стенки тонкой кишки животных контрольной группы отмечается типичное строение всех оболочек; в собственной пластинке слизистой оболочки подвздошной кишки определяются агрегированные лимфоидные узелки (пейеровы бляшки). У всех животных опытной группы в лимфоидной ткани собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки выявлена коллагенизация соединительной ткани, ее избыточное образование, и участки гибели лимфоцитов. То есть, при введении ВЕ мы наблюдали редукцию лимфоидной ткани в пейеровых бляшках, что не противоречит существующим данным в учении о стрессе, поскольку при остром стрессе наблюдается уменьшение лимфоидной ткани не только в тимусе и селезенке, но и лимфатических узлах, а пейеровы бляшки по сути являются аналогами лимфатических узлов.
Обсуждение полученных данных
Известно, что при токсических, в частности, лекарственно-индуцированных гемолитических анемиях наблюдается эритроидная гиперплазия костного мозга [6]. Тем не менее, современные исследования свидетельствуют и о том, что при гемолитических анемиях, вызванных сильнодействующими токсическими веществами, стимуляция эритропоэза на ранних сроках формирования гемолитической анемии со временем сменяется его
подавлением, что сопровождается уменьшением числа пролиферирующих эритроидных клеток-предшественников, несмотря на повышение секреторной активности адгезирующих миелокариоцитов, увеличение эритро-поэтической активности сыворотки крови, усиление формирования эритроидных гемопоэтических островков и ускорение созревания кроветворных клеток [9]. По-видимому, эта тенденция, установленная в отношении фенилгидразиновой токсической гемолитической анемии [9], справедлива и для модели токсической гемолитической анемии, вызванной введением 2-бутоксиэтанола.
Выводы
1. Внутрибрюшинное введение экспериментальным животным гемолитического яда - 2-бутоксиэтанола к 30 суткам эксперимента не сопровождается выраженной стимуляцией эритропоэза. Полученные результаты можно объяснить токсическим действием 2-бутоксиэтанола.
2. При введении 2-бутоксиэтанола в центральных и периферических органах иммуногенеза отмечается редукция лимфоидной ткани, соответствующая реакции организма на стресс.
3. Интраперитонеальное введение бутоксиэтанола провоцирует развитие аутоиммунной реакции, направленной в отношении собственных эритроцитов.
Литература
1. Бедулева Л.В. Идиотип-антиидиотипические взаимодействия как механизм индукции и развития аутоиммунных реакций: Автореф. дисс... д.б.н. - Екатеринбург, 2008. - 48 с.
2. Жернов Ю.В. Изучение антиоксидантного эффекта гуминовых кислот пелои-дов при приобретенной гемолитической анемии // Кислород и антиоксиданты. - 2009. - №1. - С. 73-74.
3. Bolliger A.P. Cytologic evaluation of bone marrow in rats: indications, methods, and normal morphology. Vet. Clin. Path. 2004; 33 (2): 58-67.
4. Ghanayem B.I., Sullivan C.A. Assessment of the haemolytic activity of 2-butoxy-ethanol and its major metabolite, butoxyacetic acid, in various mammals including humans. Hum Exp Toxicol. 1993 Jul;12(4): 305-11.
5. Kravchenko IN Khokhlova ON, NN Kravchenko, AN Puzhalin Dyachenko, IA, AN Murashev Haematological parameters free from pathogenic flora rats CD (Sprague-Dawley) and CD-1 mice were normal. Biomedicine 2008; 2: 20-30.
6. Raval G., Straughen J.E., McMillin G.A., Bornhorst J.A. Unexplained Hemolytic Anemia with Multiorgan Failure. Clinical ChemistryNovember 2011 vol. 57 no. 11 1485-1488.
7. Schick P., Besa E.C. Hemolytic Anemia Treatment & Management // Drug, Diseases & Procedures. - 2011. - Aug., 8. - P. 1234-1237.
8. Schwartz R.S. Autoimmune and intravascular hemolytic anemias. In: Goldman L, Ausiello D. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 164.
9. Zyuz'kov, G.N. Abramova E.V., Dygai A.M., Gol'dberg E.D. Mechanisms of regulation of erythropoiesis during hemolytic anemia. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 10-2004, Volume 138, Issue 4, pp 334-337.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
614990, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26 е-mail: [email protected]
