CC BY
36
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ
В.К. ГОСТИЩЕВ S В.А. КОСИНЕЦ 1, Е.А. МАТУСЕВИЧ 2, Г.П. АДАМЕНКО 2
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РАСПРОСТРАНЕННОГО ГНОЙНОГО ПЕРИТОНИТА
ГОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» ',
Российская Федерация, УО «Витебский государственный медицинский университет» 2, Республика Беларусь
Цель. Провести анализ состояния иммунной системы на разных органных уровнях при экспериментальном распространенном гнойном перитоните.
Материал и методы. Исследование проведено на 25 кроликах-самцах породы шиншилла. Изучено влияние митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток на динамику индекса миграции нейт-рофильных лейкоцитов крови, Пейеровых бляшек, селезенки и паховых лимфатических узлов при экспериментальном распространенном гнойном перитоните.
Результаты. Установлено, что для продукции факторов ингибирования миграции нейтрофильных лейкоцитов в ответ на ФГА необходимо взаимодействие нескольких популяций иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов и моноцитов).
Заключение. Стимуляция митоген-активированными иммунокомпетентными клетками миграции нейтрофильных лейкоцитов при экспериментальном распространенном гнойном перитоните является устойчивым и распространенным процессом, который наблюдается в течение 5-ти суток послеоперационного периода с вовлечением органов разных уровней иммунной системы.
Ключевые слова: распространенный гнойный перитонит, нейтрофилы, мононуклеары, моноциты, лимфоциты, ФГА, ЛПС
Objectives. To analyze the condition of the immune system at different organ levels at the experimental widespread purulent peritonitis.
Methods. The experiment has been carried out on 25 male rabbits of chinchilla breed. Influence of mitogen-induced immunocompetent cells on the dynamics of an index of neutrophil leukocytes migration of blood, Peyer's patches, spleen and inguinal lymph nodes is studied at the experimental widespread purulent peritonitis.
Results. It is established that for production of factors of neutrophil leukocytes migration's inhibition in reply to PHA, interaction of several populations of immunocompetent cells (lymphocytes and monocytes) is necessary.
Conclusions. Stimulation by mitogen-activated immunocompetent cells of neutrophil leukocytes migration at an experimental widespread purulent peritonitis is steady and widespread process which is observed within 5 days of the postoperative period with involving of organs of different levels of the immune system.
Keywords: widespread purulent peritonitis, neutrophils, mononuclear cells, monocytes, lymphocytes, PHA, LPS
Введение
Одной из наиболее сложных проблем современной абдоминальной хирургии и частой причиной неблагоприятных исходов при острых хирургических заболеваниях органов брюшной полости является распространенный гнойный перитонит. Основные трудности лечения данного заболевания связаны с его полиэтиологично-стью и многофакторностью [1, 2, 3]. В условиях развития системной воспалительной реакции, а по сути, абдоминального сепсиса, адекватность
и полнота хирургического вмешательства, к сожалению, не всегда является залогом успеха при лечении перитонита. Во многом определяющая роль отводится состоянию иммунной системы организма [4, 5].
Развитие выраженной реакции в ответ на действие экзо- и эндотоксинов патогенной микрофлоры приводит к активации и устремлению иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления, который, фактически, представляет вся брюшная полость. Мощный антигенный фактор является причиной недифференцированной гиперре-
активности иммунной системой. В результате образования фагоцитами активных форм кислорода, свободных радикалов с формированием реакции «кислородного взрыва» происходит повреждение не только чужеродных агентов, но и собственных тканей [6, 7].
Пул нейтрофильных лейкоцитов является участником любого воспалительного процесса. Наличие большого числа нейтрофилов указывает на наличие выраженного воспаления, а оценка их функциональной активности может служить объективным критерием потенциала реактивности иммунной системы [8].
Изучение динамики состояния функциональной активности иммунокомпетентных клеток органов периферической иммунной системы при распространенном гнойном перитоните является важной задачей, направленной на получение новых данных о патологическом процессе и проведение обоснованной тактики иммунокорриги-рующей терапии. В клинической практике изучение иммунологических реакций в органах периферической иммунной системы сопряжено с рядом организационных и технических трудностей.
В связи с этим нами была поставлена цель: провести анализ состояния иммунной системы на разных органных уровнях при экспериментальном распространенном гнойном перитоните.
Материал и методы
Эксперимент выполнен на 25 кроликах-самцах породы шиншилла, массой 2600-3000 г. Животные были разделены на следующие группы: I - норма (n=5); II - 6-ти часовой распространенный гнойный перитонит (n=5); III - хирургическое лечение перитонита (n=15).
Животные содержались в виварии в соответствии с международными правилами GLP. Для моделирования перитонита использовали микробную взвесь, состоящую из равных количеств аэробов (E.coli, штамм 0111 К58 НИ С 130-53) и анаэробов (B.Fragilis, штамм 323). Микробную взвесь вводили в брюшную полость животных стерильным шприцем из расчета 6 млрд. микробных тел на 1 кг массы кролика. Через 6 часов после введения микроорганизмов в III-ей группе животных с целью лечения перитонита и устранения энтеральной недостаточности выполняли лапаротомию, санацию брюшной полости, декомпрессию тонкой кишки. Жи-
вотных с распространенным гнойным перитонитом выводили из эксперимента (летальная доза нембутала) через 6 часов после заражения и на 1-е, 3-и и 5-е сутки послеоперационного периода.
Для иммунологического исследования выполнялся забор венозной крови, селезенки, Пей-еровых бляшек и подкожных лимфатических узлов.
Из данных органов готовились клеточные суспензии (107/мл) с использованием культу-ральной среды (КС), состоящей из среды RPMI-1640 (Sigma, США), 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глу-тамина и 100 мкг/мл гентамицина. Полученные клеточные суспензии (5 мл) наслаивались в центрифужной пробирке на 1 мл раствора фиккола-верографина с плотностью 1077 г/мл и центрифугировались при 400g в течение 25 минут [9]. Затем мононуклеарные лейкоциты, находящиеся в интерфазном кольце, собирали и дважды отмывали в изотоническом фосфатном буфере с доведением до концентрации 5Х106 клеток/ мл КС.
В части исследований мононуклеарные лейкоциты разделяли на лимфоциты и моноциты по способности последних адгезироваться на пластиковой поверхности чашек Петри. Из полученных лимфоцитов и моноцитов готовили клеточные суспензии в концентрации 5 Х 106 клеток/мл культуральной среды. Морфологическая чистота полученных иммунокомпетентных клеток (мононуклеарных лейкоцитов, лимфоцитов и моноцитов) оценивалась окраской гематоксилин-эозином, реакцией на неспецифическую эс-теразу и была в пределах 95-97%.
Митогениндуцированная цитокинпродуциру-ющая активность иммунокомпетентных клеток изучалась в реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в прямом капиллярном тесте [10]. Для этого в три ячейки круглодонного планшета для иммунологических исследований вносилось по 0,2 мл суспензии соответствующих иммунокомпетентных клеток. В первую ячейку добавляли 10 мкл фитогемагглютинина (ФГА) (40 мкг/мл), во вторую - 10 мкл липополисаха-рида (ЛПС) E. Coli (10 мкг/мл), в третью - 10 мкл среды RPMJ-1640. Планшет инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 1,5 часов с последующей элиминацией митогенов путем 2-х кратного центрифугирования при 1000 об/мин в течение 3 минут. К осадку добавляли 0,1 мл (107/ мл) суспензии нейтрофильных лейкоцитов (НЛ), приготовленных на культуральной среде. НЛ
получали из селезенки кроликов путем центрифугирования в двойном градиенте плотности фиккола-верографина. Затем клетки ресуспен-зировались и выполнялось РТМЛ в прямом капиллярном тесте.
Результаты РТМЛ выражались в индексе миграции (ИМ), который определяли по формуле:
количество НЛ, мигрировавших из капилляров дэд с митотнениндуцированными клетками количество НЛ, мигрировавших из капилляров с интактными клетками
Статистическую обработку данных проводили с использованием электронных пакетов анализа «STATISTICA 6.0» и «Excel». Поскольку распределение признаков носило правильный характер, а дисперсии в сравниваемых группах не отличались, были использованы методы описательной статистики, t-критерий Стьюдента (уровень достоверности отличий средних значений р<0,05).
Результаты исследования
Иммунокомпетентные клетки в норме в
ответ на активацию митогенами вырабатывают ряд факторов, регулирующих миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов. Данное действие характерно для клеток различных органов периферической иммунной системы.
Активация мононуклеарных лейкоцитов ФГА, в отличие от ЛПС Е.соН, вызывала инги-бирование миграции нейтрофильных лейкоцитов, которое было одинаково выражено для имму-нокомпетентных клеток всех исследуемых органов интактных животных. При разделении мононуклеарных лейкоцитов на лимфоциты и моноциты было установлено, что моноциты после стимуляции ЛПС Е.соН, в отличие от ФГА, обеспечивали стимуляцию миграции нейтро-фильных лейкоцитов. В то же время лимфоциты, стимулированные как ФГА, так и ЛПС Е.соН, не оказывали существенного влияния на миграционную активность тест-клеток.
Результаты исследования состояния мито-ген-индуцированных иммунокомпетентных клеток органов периферической иммунной системы при экспериментальном распространенном гнойном перитоните представлены в таблицах 1, 2, 3, 4.
Уже через 6 часов после инициации перитонита мононуклеарные лейкоциты в крови, Пейе-
Таблица 1
Влияние митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток на динамику индекса миграции нейтрофильных лейкоцитов крови в послеоперационном периоде при экспериментальном распространенном гнойном перитоните
Клетки Митоген Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов (М±т)
Норма 6-ти часовой Хирургическое лечение
(п=5) перитонит (послеоперационный период)
(п=5) 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки _(п=5)_(п=5)_(п=5)
Мононуклеары ФГА 0,73±0,04 0,86±0,06 1,01±0,05 1,01±0,02 0,95±0,06
p1=0,006 p1<0,0001 p2=0,002 p1<0,0001 p1=0,0002
ЛПС 0,96±0,03 1,00±0,04 1,03±0,03 1,02±0,03 1,02±0,03
p1=0,048 p1=0,005 p1=0,01 p1=0,02
Моноциты ФГА 0,96±0,03 1,02±0,02 1,03±0,03 1,01±0,01 1,03±0,02
p1=0,005 p1=0,001 p1=0,004 p1=0,009
ЛПС 1,30±0,04 1,42±0,06 1,53±0,12 1,50±0,08 1,53±0,10
p1=0,005 p1=0,005 p1=0,001 p1=0,002
Лимфоциты ФГА 0,93±0,02 0,99±0,04 1,00±0,02 1,03±0,02 1,01±0,01
p1=0,026 p1=0,0008 p1=0,0001 p1=0,0002
ЛПС 0,98±0,03 0,99±0,03 1,03±0,01 p1=0,008 p2=0,049 1,02±0,01 p1=0,02 1,01±0,02
Примечание: р1 - достоверно по сравнению с нормой; р2 - достоверно по сравнению с группой 6-ти часового распространенного гнойного перитонита
Таблица 2
Влияние митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток на динамику индекса миграции нейтрофильных лейкоцитов Пейеровых бляшек в послеоперационном периоде при экспериментальном распространенном гнойном
перитоните
Клетки
Митоген Индекс миграции
Норма 6-ти
(n=5) часовой
перитонит (n=5)
нейтрофильных лейкоцитов (M±m) Хирургическое лечение (послеоперационный период)
1 -е сутки (n=5)
3-и сутки (n=5)
5-е сутки (n=5)
Мононуклеары ФГА 0,74±0,02 0,85±0,05 1,03±0,02 0,98±0,04 0,95±0,03
p1=0,002 p1<0,0001 p2<0,0001 p1<0,0001 p1<0,0001
ЛПС 0,96±0,03 1,00±0,03 1,03±0,02 1,03±0,04 1,01±0,02
p1=0,004 p1=0,0003 p 1 =0,01 p1=0,001
Моноциты ФГА 1,02±0,04 1,04±0,03 1,03±0,04 1,02±0,06 p1=0,004 1,02±0,01
ЛПС 1,33±0,08 1,54±0,11 1,63±0,14 1,56±0,06 1,53±0,09
p1=0,007 p1=0,003 p1=0,0006 p1=0,005
Лимфоциты ФГА 0,91±0,05 1,00±0,07 1,00±0,02 1,02±0,01 1,00±0,01
p1=0,04 p1=0,007 p1=0,0001 p1=0,007
ЛПС 0,96±0,01 0,99±0,05 0,98±0,03 1,04±0,04 p1=0,024 1,02±0,01 p1<0,0001
Примечание: р1 - достоверно по сравнению с нормой; р2 - достоверно по сравнению с группой 6-ти часового распространенного гнойного перитонита
Таблица 3
Влияние митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток на динамику индекса миграции нейтрофильных лейкоцитов селезенки в послеоперационном периоде при экспериментальном распространенном гнойном перитоните
Клетки Митоген Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов (M±m)
Норма 6-ти Хирургическое лечение
(n=5) часовой (послеоперационный период)
перитонит 1-е сутки 3-и сутки 5-е Сутки _(n=5)_(n=5)_(n=5)_(n=5)
Мононуклеары ФГА 0,73±0,04 0,87±0,03 1,03±0,02 1,01±0,05 1,01±0,03
p1=0,0002 p1<0,0001 p2<0,0001 p1<0,0001 p1<0,0001
ЛПС 0,98±0,02 1,01±0,01 1,04±0,01 1,03±0,05 1,01±0,02
p1=0,006 p1<0,0001 p2=0,0005 p1=0,035 p1=0,034
Моноциты ФГА 0,98±0,04 0,99±0,02 1,04±0,03 p1=0,026 p2=0,027 1,00±0,04 1,03±0,02 p1=0,03
ЛПС 1,34±0,03 1,40±0,02 1,56±0,03 1,50±0,03 1,43±0,04
p1=0,014 p1<0,0001 p2<0,0001 p1<0,0001 p1=0,01
Лимфоциты ФГА 0,95±0,02 1,01±0,03 1,00±0,03 1,02±0,03 1,04±0,04
p1=0,005 p1=0,022 p1=0,004 p1=0,002
ЛПС 0,99±0,06 1,01±0,04 1,03±0,03 0,99±0,01 1,02±0,05
Примечание: р1 - достоверно по сравнению с нормой; р2 - достоверно по сравнению с группой 6-ти часового распространенного гнойного перитонита
Таблица 4
Влияние митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток на динамику индекса миграции нейтрофильных лейкоцитов паховых лимфатических
узлов в послеоперационном периоде при экспериментальном распространенном _гнойном перитоните_
Клетки Митоген Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов (М±т)
Норма 6-ти Хирургическое лечение
(п=5) часовой (послеоперационный период)
перитонит 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки (п=5) (п=5)_(п=5)_(п=5)
Мононуклеары ФГА 0,79±0,06 0,89±0,05 0,99±0,02 0,97±0,07 0,95±0,02
р1=0,023 р1<0,0001 р2=0,002 р1=0,002 р1=0,0003
ЛПС 0,97±0,03 1,01±0,02 1,03±0,03 1,03±0,05 1,02±0,02
р 1 =0,01 р1=0,009 р1=0,03 р1=0,006
Моноциты ФГА 1,00±0,02 1,01±0,02 1,01±0,06 1,00±0,03 1,01±0,01
ЛПС 1,30±0,06 1,40±0,04 1,60±0,06 1,57±0,15 1,45±0,06
р1=0,016 р1<0,0001 р2=0,0003 р1=0,007 р1=0,004
Лимфоциты ФГА 0,98±0,03 1,00±0,03 0,99±0,05 1,01±0,01 1,01±0,03
ЛПС 0,99±0,05 0,99±0,05 1,03±0,03 1,02±0,06 1,01±0,04
Примечание: р1 - достоверно по сравнению с нормой; р2 - достоверно по сравнению с группой 6-ти часового распространенного гнойного перитонита
ровых бляшках, селезенке и периферических лимфатических узлах, активированные как ФГА, так и ЛПС Е.соН, не подавляли миграцию нейтрофильных лейкоцитов, по сравнению с нормой. Это свойство мононуклеарных лейкоцитов сохранялось в течение 5-ти суток послеоперационного периода.
Стимуляция моноцитов ЛПС Е.соН, в отличие от ФГА, вызывала существенную, статистически значимую (р<0,05) стимуляцию миграции нейтрофильных лейкоцитов во все сроки наблюдения.
Лимфоциты иммунных органов после активации митогенами по-разному изменяли миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов. В отличие от ФГА, их стимуляция ЛПС Е.соН оказывала меньшее влияние на миграцию тест-клеток. Такое действие ФГА-стимулированных лимфоцитов на нейтрофильные лейкоциты было наиболее выражено для клеток венозной крови и Пейеровых бляшек, в то время как данный эффект был менее интенсивным в селезенке и подкожных лимфатических узлах.
Таким образом, проведенные исследования показали, что для продукции фактора ингибиро-вания миграции нейтрофильных лейкоцитов в ответ на ФГА необходимо взаимодействие нескольких популяций иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов и моноцитов). Моноциты, ак-
тивированные ЛПС Е.соН, способны продуцировать фактор стимуляции миграции нейтрофиль-ных лейкоцитов самостоятельно, без присутствия лимфоцитов. Возможно, различные популяции иммунокомпетентных клеток периферических органов иммунной системы обладают дифференцированным потенциалом функциональной активности в ответ на действие мито-генов, в частности, - способность продуцировать цитокины, регулирующие миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов.
При экспериментальном распространенном гнойном перитоните уже в ранние сроки (через 6 часов) наступают изменения цитокинпродуци-рующей активности митоген-активированных иммунокомпетентных клеток различных иммунных органов. Эти изменения характеризуются снижением продукции фактора ингибирования миграции нейтрофильных лейкоцитов ФГА-акти-вированными мононуклеарными лейкоцитами, ростом стимуляции миграции нейтрофильных лейкоцитов моноцитами, активированными ЛПС Е.соН, а также лимфоцитами, активированными ФГА.
Заключение
Результаты исследования указывают на наличие существенного потенциала иммуноком-петентных клеток исследованных органов, в
большей степени венозной крови и Пейеровых бляшек, к быстрому ответу на бактериальную инфекцию в брюшной полости. Модуляция продукции цитокинов митоген-активированными иммунокомпетентными клетками при экспериментальном распространенном гнойном перитоните является устойчивым и распространенным процессом, который наблюдается в течение 5-ти суток послеоперационного периода с вовлечением органов разных уровней иммунной системы. Возможно, выявленная стимуляция функциональной активности иммунокомпетентных клеток может способствовать формированию гиперэргической реакции в брюшной полости с участием нейтрофильных лейкоцитов.
Работа выполнена при поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (грант Б011-022).
ЛИТЕРАТУРА
1. Гостищев, В. К. Перитонит / В. К. Гостищев, В. П. Сажин, А. Л. Авдовенко. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2002. -238 с.
2. Савельев, В. С. Перитонит: практ. рук. / под общ. ред. В. С. Савельева, Б. Р. Гельфанда, М. И. Филимонова. - М.: Литтерра, 2006. - 208 с.
3. Шуркалин, Б. К. Гнойный перитонит / Б. К. Шурка-лин. - М.: Два Мира Принт, 2000. - 224 с.
4. Брискин, Б. С. Иммунные нарушения и иммунокор-рекция при интраабдоминальной инфекции / Б. С. Брискин, Н. Н. Хачатрян, З. И. Савченко // Хирургия. - 2004. -№ 2. - С. 24-27.
5. Иммунный статус при перитоните и пути его патогенетической коррекции: рук. для врачей / Ю. М. Гаин [и др.]. - Минск: ООО «Юнипресс», 2001. - 256 с.
6. Луговская, С. А. Структура и функции моноцитов и макрофагов (обзор литературы) / С. А. Луговская / / Клин. лаб. диагностика. - 1997. - № 9. - С. 10-16.
7. Маянский, А. Н. Клинические аспекты фагоцитоза / А. Н. Маянский, О. И. Пикуза. - Казань, 1993. - 192 с.
8. Караулов, А. В. Клиническая иммунология / А. В. Караулов. - М.: Медицина, 2008. - 602 с.
9. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // Scand. J. din. a Labor. Investig. - 1968. - Vol. 21. - Suppl. 97. - P. 109.
10. Фримель, Г. Иммунологические методы / Г. Фри-мель. - М., 1987. - 417 с.
Адрес для корреспонденции
119991, Российская Федерация,
г. Москва, ул. Яузская, д. 11,
Первый Московский государственный
медицинский университет им. И.М. Сеченова,
кафедра общей хирургии,
e-mail: vkosinets@yandex.ru,
Косинец В. А.
Поступила 11.07.2011 г.
