CC BY
113
Оригинальные исследования
263
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОТОНЕЙРОНОВ ПОЯСНИЧНОГО ОТДЕЛА СПИННОГО МОЗГА МЫШЕЙ
после 30-суточного космического полета на биоспутнике
БИОН-М1
О.В. Тяпкина 123, П.Н. Резвяков 2, Л.Ф. Нуруллин 13, К.А. Петров 13,
Е.Е. Никольский 1 23, Р.Р. Исламов 1
1 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
2 Казанский институт биохимии и биофизики РАН, Казань, Россия
3 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Immunohistochemical study of motoneurons of the lumbar spinal cord of mice after the 30-days space flight on biosatellite BION-M1
O.V. Tyapkina 13, P.N. Rezvyakov 2, L.F. Nurullin 13, KA. Petrov13, E.E. Nikolskiy13, R.R. Islamov1
1 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
2 Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics of RAS, Kazan, Russia
3 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
В настоящей работе проведено иммуногистохимическое исследование поясничного отдела спинного мозга мышей линии c57black/6 после 30-суточного космического полета. Исследование проводилось с помощью антител к белкам, участвующим в обеспечении синаптической передачи: синаптофизину и PSD95. Установлено, что у мышей после космического полета в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга снижается уровень иммуноэкспрессии синаптофизина (на 21%), PSD95 (на 55%), белков теплового шока Hsp25 (на 15%), Hsp70 (10%). При этом достоверные изменения иммуноэкспрессии VEGF и его рецептора Flt-1 отсутствовали. Полученные данные свидетельствуют об изменении функционального состояния (синаптической активности и устойчивости к стрессу) мотонейронов поясничного отдела спинного мозга у мышей после космического полёта. Таким образом, нами получены новые данные о роли мотонейронов спинного мозга в развитии гипогравитационного двигательного синдрома.
Ключевые слова: космический полёт, гипогравитационный двигательный синдром, мотонейроны, спинной мозг.
Исследование влияния невесомости на организм человека и животных является актуальной проблемой космической биологии и медицины в связи с интенсивным освоением космического пространства. У космонавтов в условиях невесомости развивается гипогравитационный двигательный синдром (ГДС), характеризующийся атрофией, атонией и повышенной утомляемостью скелетных мышц [1]. Предполагается, что механизмы, запускающие ГДС, могут возникать в мотонейронах, иннервирующих эти мышцы [2]. У человека и животных, находящихся в условиях реальной и моделируемой невесомости регистрируется снижение активности малых постуральных двигательных единиц [1]. На модели антиортостатического вывешивания задних конечностей крыс показано уменьшение уровня иммуноэкспрессии хо-линацетилтрансферазы (ХАТ), фермента, отражающего уровень функциональной активности холинергических нейронов [2]. О состоянии функционирования нервных клеток можно судить также по степени экспрессии белков, участвующих в нейротрансмиссии: синаптофизина (участвует в образовании синаптических везикул, необходимых для упаковки и транспортировки нейротрансмиттера, маркер пресинап-
е-mail: anti-toxin@mail.ru
We made immunohistochemical study of the lumbar spinal cord of c57black/6 mice after a 30-days space flight using antibodies against proteins which involved in providing of synaptic transmission (synaptophysin and PSD95). Also we use antibodies against proteins of intracellular protection (Hsp25 and Hsp70), and neuroprotective protein (VEGF) and its receptor (Flt-1). We found, that the levels of synaptophysin immune expression decreased by 21%, PSD — by 55%, Hsp25 — by 15% and Hsp70 — by 9% in mice lumbar spinal cord motoneurons after space flight. Thus, there were no significant changes in the immune expression of VEGF and its receptor Flt-1. Obtained data reveal the changes in the functional state (synaptic activity and resistance to stress) of mice lumbar spinal cord motoneurons after space flight. So, we have shown a new data about spinal cord motoneurons role in the development of hypogravity motor syndrome.
Key words: space flight, hypogravitational motor
syndrome, motoneurons, spinal cord.
тической мембраны) [3, 4] и PSD95 (postsynaptic density protein 95 — белок постсинаптической плотности 95, может взаимодействовать с рецепторами, ионными каналами и сигнальными белками, маркер постсинаптической мембраны) [5, 6].
С точки зрения расширения представлений об особенностях адаптации нервных клеток в условиях in vivo к снижению функциональных нагрузок у мышей, находящихся в условиях космического полета, особый интерес представляет изучение механизмов, обеспечивающих устойчивость мотонеройнов в невесомости. Показано, что у крыс, после моделирования гипогравитации путем антиортостатического вывешивания задних конечностей в мотонейронах поясничного утолщения спинного мозга повышается уровень иммуноэкспресии белков теплового шока Hsp 25 и Hsp70, что можно рассматривать как фактор, обеспечивающий надлежащий уровень адаптационных возможностей нервных клеток [2]. В то же время, для нормальной жизнедеятельности и функционирования нервной системы необходимы нейротрофические факторы. В последние годы сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) рассматривается как один из потенциальных агентов,
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
264
Оригинальные исследования
выполняющих нейротрофическую и нейропротекторную функции в нервной системе, независимые от сосудистого компонента. Показано, что VEGF воздействует на нейрональные и глиальные клетки посредством активации рецептора Flt-1 [7]. При этом роль ростовых факторов в центральной нервной системе (ЦНС) при формировании ГДС до сегодняшнего дня не исследовалась.
Целью данной работы явилось иммуногистохимическое исследование иммуноэкспрессии синаптофи-зина, PSD95, Hsp25, Hsp70, VEGF и его рецепторa Flt-1 в мотонейронах передних рогов поясничного отдела спинного мозга мышей после 30-суточного космического полета на биоспутнике БИОН-М1.
Материал и методы
Эксперименты выполнены на мышах самцах линии c57black/6 (масса 27,1±0,3 г). Все процедуры с животными проведены в соответствии с международными биоэтическими нормами [8]. Мыши были разделены на 2 группы: контрольную (n = 2) и подвергнутую космическому полету (n = 2). В рамках проведения программы БИОН-М1 для исследования был взят поясничный отдел спинного мозга контрольной и экспериментальной групп животных.
Для оценки уровня иммуноэкспресии белков-мишеней были применены стандартные иммуногистохимические методы. Поясничный отдел спинного мозга фиксировали в растворе забуференного параформальдегида (рН = 7,2). Для криопротекции фиксированный материал помещали в 30% раствор сахарозы (Хеликон, Россия), приготовленный на фосфатно-солевом буфере (Биолот, Россия) с добавлением азида натрия (Sigma, США). На криостате HM560 Cryo-Star (Carl Zeiss, Германия) готовили свободно плавающие поперечные срезы поясничного отдела спинного мозга толщиной 20 мкм. Полученные срезы окрашивали непрямым иммуно-пероксидазным методом по общепринятому протоколу. Инкубацию с поликлональными первичными антителами (табл.) проводили в течение 12 ч при температуре +4°С. Для иммунной реакции с первичными антителами был применён стрептавидин-биотиновый комплекс Elite ABC Kit (Invitrogen, США).
Иммунопреципитат визуализировали при помощи диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase; Vector Laboratories, США). После окрашивания срезы монтировали на предметных стёклах, высушивали, заключали в водорастворимую среду ImmuMount (Thermo Scientific, США). Изображения микропрепаратов получали на микроскопе Olympus BX51WI (Olympus, Япония) с помощью камеры AxioCam MRm (Carl Zeiss, Германия) и программы AxioVision Rel. 4.6.3. (Carl Zeiss, Германия). Оцифрованные изображения поперечных срезов спинного мозга анализировали в программе ImageJ 1.43 (NIH, США). При одинаковых условиях окрашивания срезов специфическими антителами количество иммуногистохимического осадка в мотонейронах оценивали по оптической плотности иммунопреципитата. В контрольной и подопытной группах средние значения представлены как М±ошибка в относительных единицах (о.е.), при этом n соответствует количеству проанализированных мотонейронов.
Для статистической обработки данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента (t-тест). Различие между двумя совокупностями считали достоверным при p<0,05.
Результаты
Анализ иммунногистохимической реакции с антителами против синаптофизина (белка — маркера пресинаптической области) у контрольных и подопытных животных выявил уменьшение плотности иммуногистохимического осадка в телах мотонейронов передних рогов спинного мозга у мышей после 30-суточного космического полета (рис. 1А и Б). Так если интенсивность реакции у контрольных животных составила 1,53±0,02 о.е. (n = 91), то у животных после космического полета — 1,21 ±0,01 о.е. (n = 96).
Анализ окрашенных антителами к PSD95 (маркеру постсинаптической области) срезов показал уменьшение количества иммуногистохимического осадка в телах мотонейронов у животных полетной группы, при этом интенсивность реакции составила в контроле 1,91±0,02 о.е. (n = 60), а после полета 0,86±0,03 о.е (n = 90) (рис. 1В и Г).
Первичные антитела и их характеристики
Антиген Характеристика Разведение Производитель
Синаптофизин Маркер пресинаптической области 1:300 Abcam Plc, Великобритания
PSD95 Маркер постсинаптической области 1:800 Abcam Plc, Великобритания
Hsp25/27 Белок теплового шока с молекулярной массой 25 кДа 1:200 SantaCruz Biotechnology Inc, США
Hsp70/72 Белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа 1:200 SantaCruz Biotechnology Inc, США
VEGF Сосудистый эндотелиальный фактор роста 1:300 SantaCruz Biotechnology Inc, США
Flt-1 Рецептор к сосудистого эндотелиального фактора роста 1:300 SantaCruz Biotechnology Inc, США
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
265
Рис. 1. Мотонейроны поясничного отдела спинного мозга мышей:
А, В, Д, Ж, И, Л - интактных; Б, Г, Е, З, К, М - перенесших космический полет. Иммуногистохимическая реакция с антителами к: А, Б - синаптовизину, В, Г - PSD95; Д, Е - Hsp25; Ж, З - Hsp70; И, К - VEGF; Л, М - Flt-1
Оценка уровня иммуноэкспрессии белка теплового шока Hsp25 выявила уменьшение количества иммунопреципитата у мышей после 30-суточного космического полета (рис. 1Д и Е). Средние значения оптической плотности в мотонейронах контрольных мышей составили 1,01 ±0,01 о.е. (n = 60), а после полета — 0,86±0,02 о.е. (n = 90). После окрашивания срезов антителами к Hsp70 выявлено уменьшение иммуногистохимического осадка в телах мотонейронов у животных полетной группы (рис. 1Ж и З). При этом средние значения оптической плотности окрашивания составили в контроле 0,90±0,03 о.е. (n = 50), а после полета — 0,81 ±0,01 о.е. (n = 90).
Исследование осадка иммунногистохимической реакции против белка VEGFA его рецептора Flt-1 не выявило отличий в окрашивании мотонейронов поясничного отдела мышей контрольной и подопытной групп (рис. 1И и К, 1Л и М). Средние значения оптической плотности реакции для VEGFA в контроле составили 0,96±0,03 о.е. (n = 60), для послеполетной группы — 0,95±0,02 о.е. (n = 85), (рис. 1И и К). При этом для его рецептора Flt-1 были зарегистрированы средние значения оптической плотности у контрольных мышей 0,97±0,02 о.е. (n = 72), у подопытных — 0,94±0,94 о.е. (n = 50), (рис. 1Л и М).
Сравнительный анализ плотности иммуногистохимического осадка при окрашивании специфическими антителами продемонстрировал, что у животных после 30-суточного космического полёта интенсивность свечения увеличивается для таких белков, как синаптофизин (21%, p<0,01), PSD95 (55%, p<0,01), для HSP25 (15%, p<0,01), HSP70 (10%, p<0,01). Полученные данные свидетельствуют об уменьшение уровня иммуноэкспрессии этих белков у мышей после 30-суточного полёта. В то время как уровень иммуноэкспрессии VEGF и его рецептора Flt-1 оставался неизменным.
Обсуждение
Неоднократно показано, что космический полет и моделирование его эффектов на Земле неблагоприятным образом отражаются на скелетно-мышечной системе подопытных животных и человека [1]. При этом состояние мотонейронов, контролирующих свойства и функционирование мышц в условиях орбитального полета и моделирования его эффектов на Земле, изучено недостаточно [1, 2].
Поскольку синаптофизин является важным белком, обеспечивающим процессы, как экзоцитоза, так и эндоцитоза, то становится очевидным, что изменение уровня его экспрессии может отражаться на активности синапсов в центральной нервной системе [3, 9]. Снижение экспрессии синаптофизина показано при некоторых видах неврологических патологий, например, при заболевании двигательных нейронов передних рогов спинного мозга, характеризующимся атрофией скелетных мышц и нарушением локомоторной функции [4]. Полученные нами данные о снижении иммуноэскпрессии синаптофизина у мышей полётной группы дают основания предполагать, что в условиях невесомости процессы синаптической передачи нарушаются. Выявленные изменения на пресинаптической мембране мотонейронов сопровождаются уменьшением иммунноэкспрессии и PSD95, локализованного исключительно на постсинаптической мембране. Показано, что в ЦНС PSD95 при разных режимах активности нервных клеток, изменяя структуру и свойства цитоскелетных белков (актин, спектрин, тубулин, белки связанные с микротрубочками и Са + 2/кальмодулин зависимая протеинкиназа II), обеспечивает процессы синаптической пластичности [5, 6]. Кроме того, данные об участии PSD95 в развитии деменции и болезни Альцгеймера [10] также свидетельствуют в пользу предположения, о том, что выявленное уменьшение иммуноэкспрессии
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
266
Оригинальные исследования
PSD95 в мотонейронах мышей после космического полета может неблагоприятным образом отразиться на функционировании нейронов ЦНС.
Таким образом, уменьшение белков синаптофи-зина и PSD95 может явиться одной из причин рассогласования взаимодействия нервных клеток и клеток других типов в спинном мозге мышей после космического полета.
Усиление экспрессии белков теплового шока является одним из универсальных защитных механизмов клетки в ответ на стрессирующий фактор. При моделировании эффектов невесомости было выявлено уменьшение экспрессии Hsp70, сопровождающееся атрофией мышц и апоптозом мышечных клеток [11], а превентивное усиление экспрессии этого белка ослабляло повреждение мышц и степень их атрофированности [12]. Напротив, в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга крыс после антиортостатического вывешивания задних конечностей было выявлено усиление экспрессии Hsp25 и Hsp70 [2]. При этом известно, что снижение экспрессии белков теплового шока повышает вероятность вступления клеток в апоптоз [13]. В связи с этим, выявленное понижение уровня экспрессии белков теплового шока Hsp25 и Hsp70 в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга у животных, находящихся космическом полете, можно рассматривать как свидетельство снижения адаптационно-компенсаторных возможностей этих клеток в условиях невесомости.
Факторы роста, нейротрофические факторы и их рецепторы играют важную роль в регуляции процессов развития и поддержания функционирования нейронов. Изменения уровня экспрессии факторов роста приводит к неврологическим расстройствам, таким как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и др. Сосудистый
ЛИТЕРАТУРА:
1. Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С. Роль опорной афферентации в организации тонической мышечной системы. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова 2004; 5: 508-21.
2. Islamov R.R., Tiapkina O.V., Nikolskii E.E. et al. The role of spinal motoneurons in the mechanisms of hypogravitational motor syndrome development. Ross. Fiziol. Zh. Im. I. M. Sechenova. 2013; 99t3): 281-93.
3. Pyeon H.J., Lee Y.I. Differential expression levels of synaptophysin through developmental stages in hippocampal region of mouse brain. Neuron 2011; 70(5): 847-54.
4. Sasaki S., Maruyama S. Decreased synaptophysin immunoreactivity of the anterior horns in motor neuron disease. Acta Neuropathol. 1994; 87(2): 125-8.
5. Wheal H.V., Chen Y., Mitchell J. et al. Molecular mechanisms that underlie structural and functional changes at the postsynaptic membrane during synaptic plasticity. Prog. Neurobiol. 1998; 55(6): 611-40.
6. Bei'que J.C., Andrade R. PSD-95 regulates synaptic transmission and plasticity in rat cerebral cortex. J. Physiol. 2003; 546: 859-67.
7. Islamov R.R., Chintalgattu V., Pak E.S. et al. Induction of VEGF and its Flt-1 receptor after sciatic nerve crush injury. Neuroreport 2004; 15(13): 2117-21.
эндотелиальный фактор роста (VEGF), выполняющий нейротрофическую и нейропротекторную функции в нервной системе, способен напрямую стимулировать пролиферацию и выживание нейральных стволовых клеток [14]. К тому же показано, что VEGF может ускорить восстановление поврежденных периферических нервов [7].
Отсутствие реакции на космический полет экспрессии нейротрофического фактора VEGFА и его рецептора Flt-1 в мотонейронах также можно рассматривать как еще одно из неблагоприятных последствий пребывания животных в условиях орбитального полета.
Принимая во внимание полученные данные можно предположить, что в условиях космического полета в мотонейронах могут возникать нарушения, влияющие на процессы нейротрансмиссии и механизмы, поддерживающие их жизнеспособность. Таким образом, выявленные изменения в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга мышей после космического полёта можно рассматривать как конкретные элементы патогенеза ГДС.
Благодарности
Исследование поддержано грантами: РФФИ
№ 13-04-00310-а, Президента РФ НШ-2669.2012.7, Программой № 7 Президиума РАН, Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий», субсидией, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров. Работа частично выполнена на оборудовании Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.
8. Андреев-Андриевский А.А., Шенкман Б.С., Попова А.С. и др. Экспериментальные исследования на мышах по программе полета биоспутника «БИОН-М1».Авиакосмическая и экологическая медицина. 2014; 48(1): 14-27.
9. Kwon S.E., Chapman E.R. Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons. Brain Res. Rev. 2009; 60(2): 341-8.
10. Whitfield D.R., Vallortigara J., Alghamdi A. et al. Assessment of ZnT3 and PSD95 protein levels in Lewy body dementias and Alzheimer's disease: association with cognitive impairment. Neurobiol. Aging. 2014; 35(12): 2836-44.
11. Oishi Y., Ishihara A., Talmadge R.J. et al. Expression of heat shock protein 72 in atrophied rat skeletal muscles. Acta Physiol. Scand. 2001; 172: 123-30.
12. Naito H., Powers S.K., Demirel H.A. et al. Heat stress attenuates skeletal muscle atrophy in hindlimb-unweighted rats. J. Appl. Physiol. 1985; 88(1): 359-63.
13. Maatkamp A., Vlug A., Haasdijk E. et al. Decrease of Hsp25 protein expression precedes degeneration of motoneurons in ALS-SOD1 mice. Eur. J. Neurosci. 2004; 20(1): 14-28.
14. Raab S., Plate K.H. Different networks, common growth factors: shared growth factors and receptors of the vascular and the nervous system. Acta Neuropathol. 2007; 113(6): 607-26.
Поступила: 13.08.2014
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
