CC BY
5©Коллектив авторов, 2014 Вопросы онкологии, 2014. Том 60, № 6
УДК 616.345-006.6:612.017.1-57.71.86
Г.А. Раскин1,2, K.M. Пожарисский1, Р.В. Орлова1,2, С.В. Петров3, А.Э. Протасова2
иммуногистохимическое исследование ферментов метаболизма химиопрепаратов при аденокарциноме толстой кишки
Российский научный центр радиологии и хирургических технологий, 2Санкт-Петербургский государственный
университет, медицинский факультет, 3Казанский государственный медицинский университет
исследован материал первичных опухолей от 140 больных аденокарциномой толстой кишки с целью определения экспрессии тимидилат синтетазы (TS), ти-мидин фоефорилазы, дигидропиримидин дегидрогеназы (DYPD), ERCC-1, Ш-класс-бета-тубулина, топоизомеразы-Н-альфа, Кь 67. Сопоставлению клинической картины и результатов иммуногистохимии подверглись 104 пациента с аденокарциномой толстой кишки, получавших химиотерапию по схемам FOLFOX, de Gramont, FOLFIRI.
Частота объективного ответа при наличии экспрессии ТР и отсутствии TS составила 39%, при обратном сочетании (экспрессия TS и отсутствие ТР) была 13% (р=0,04). Остальные маркеры не показали корреляции с возникновением прогрессирования заболевания и частотой объективного ответа.
Ключевые слова: аденокарцинома толстой кишки, иммуногистохимическое исследование.
Последнее десятилетие ознаменовалось прогрессом в лечении рака толстой кишки. Наряду с совершенствованием хирургического лечения, большой вклад в увеличение показателей выживаемости этой категории больных внесли цитостатики с принципиально новыми механизмами действия (элоксатин, иринотекан). Их комбинация с 5-фторпиримидинами (FOLFOX, FOLFIRI) увеличила показатели выживаемости в несколько раз. Однако назначение химиотерапии производят эмпирически, без учета каких-либо маркеров чувствительности.
Многие маркеры, которые возможно исследовать иммуногистохимическим способом, рассматривают не только с точки зрения прогностического значения, но и предиктивного (как факторы, предсказывающие эффективность противоопухолевого лечения). К таким маркерам относят: тимидилат синтетазу (К), тимидин фосфорилазу, дигидропиримидин дегидрогеназу (DYPD), ЕЯСС-1, Ш-класс-бета-тубулина, ЕЯСС-1, топоизомеразу-11-альфа, К>67. Какие из этих маркеров или их сочетание могут определять эффективность предстоящей стандартной химиотерапии (FOLFOX,
FOLFIRI, де Грамонт) остается неясным и является целью настоящего исследования.
Материал и методы
Был исследован материал первичных опухолей от 140 больных аденокарциномой толстой кишки. Материал поступал как в виде парафиновых блоков, так и в виде кусочков опухолей, залитых в 10% забуференный формалин. В последнем случае производилась вырезка материала, доведение фиксации в формалине до 24 ч. Затем проводили материал в десяти порциях изопропилового спирта и 3 порциях парафина. Приготавливались блоки, с которых нарезались срезы толщиной 4 микрона, которые помещали на стёкла с поли-Ь-лизиновым покрытием. Срезы подсушивались, депарафинизировались и подвергались демаскировке антигенов при помощи цитратного буфера в условиях водяной бани, t = 950С, 40 минут. После этого они остывали при комнатной температуре и промывались трис-буфером с твином. Каждый срез обводился парафиновым карандашом, после чего осуществлялось ингибиро-вание эндогенной пероксидазы 3% перекисью водорода в течение 5 минут. Затем на каждый срез наносилось первое антитело (табл. 1), экспозиция длилась 1 час на термостолике в условиях «водяной бани» при температуре 30 0С.
Для визуализации реакции антиген-антитело применялась полимерная система детекции Еп^юп компании БАКО, в качестве хромогена использовался диаминобен-зидин. Контрокрашивание ядер осуществлялось при помощи гематоксилина Майера. После каждого из этапов до окрашивания диаминобензидином стекла со срезами промывались в трис-буфере с твином рН 7,1 фирмы ВюОрИса. Стекла заключались ВюМаиП фирмы ВюОрИса.
Таблица 1 — Спецификация антител
Название антитела Клон Характер антител Разведение Фирма-производитель
b-tubulin, class III EP1569Y Кроличьи, моноклональные 1:250 Epitomics
ERCC-1 PDM 151 Мышиные, моноклональные 1:100 DBS
Ki-67 SP6 Кроличьи, моноклональные 1:200 LabVision
DPYD ab54797 Мышиные, моноклональные 1:100 AbCam
Thymidine Phosphorylase (TP) P-GF44C Мышиные, моноклональные 1:400 LabVision
Thymidylate synthase (TS) Sc-33679 Мышиные, моноклональные 1:100 Santa Cruz
Topoisomera-se-II-a Ki-S1 Мышиные, моноклональные 1:300 LabVision
PTEN 17.A Мышиные, моноклональные 1:100 LabVision
При оценке экспрессии всех маркеров проводился подсчет процента позитивных раковых клеток.
При оценке иммуногистохимического окрашивания использовался внутренний контроль в виде нормальных структур, присутствующих в срезах.
Сопоставлению клинической картины и результатов иммуногистохимии подверглись 104 пациента с адено-карциномой толстой кишки, получавших химиотерапию по схемам FOLFOX, de Gramont, FOLFIRI. Химиотерапия признавалась эффективной в случаях стабилизации процесса, полного или частичного регресса опухоли. Лечение признавалась безуспешным в случае прогрессирования основного заболевания. Проводилось не менее 3-х курсов химиотерапии, результаты оценивались спустя 2 года после начала химиотерапии.
Результаты
При иммуногистохимическом исследовании тимидилат синтазы реакция носила ядерный характер различной степени интенсивности (рис. 1). Позитивная реакция всегда выявлялась в клетках нормальной слизистой оболочки толстой кишки, а также в клетках стромы, что служило внутренним контролем для оценки им-муногистохимического окрашивания.
При оценке экспрессии TS оказалось, что муцинозные аденокарциномы имеют более высокий уровень экспрессии, что является плохим прогностическим фактором, по данным одних авторов [5], хотя другие исследования не выявили корреляции экспрессии TS с выживаемостью больных распространенной аденокарциномой толстой кишки [10].
Тимидин фосфорилаза (ТР) — показатель чувствительности опухолевых клеток к 5-фтор-пиримидинам. Превращает капецитабин (ксе-лода) из неактивной в активную форму, а также стимулирует превращение 5-фторурацила в Б^МР, который ингибирует TS [11].
Иммуногистохимическое исследование показало смешанный характер реакции (ядерно-ци-топлазматическая). На микрофотографии видно (рис. 2), что даже в пределах одного ракового комплекса интенсивность реакции значительно варьировала. Кроме того, важным наблюдением следует считать, что во всех исследованных случаях строма как внутри опухоли, так и вне ее показывала интенсивную реакцию, превышающую ее в раковых клетках. Часть случаев имели ярко позитивную реакцию в строме, но негативную реакцию в опухоли.
При оценке экспрессии маркеров в зависимости от прогрессирования заболевания во время химиотерапии (полное отсутствие эффекта) были получены следующие результаты:
И в том, и в другом случае статистически достоверное влияние оказывали экспрессии TS (р=0,003657 и р=0,000842) и ТР (р=0,005803 и р=0,004032, табл. 2). Частота объективного отве-
Рис. 1 - Тимидилат синтаза С^) в аденокарциноме толстой кишки. Позитивная ядерная реакция в большинстве раковых клеток, также выявляется экспрессия в клетках стромы, Х400.
Рис. 2 - Тимидин фосфорилаза (ТР) в аденокарциноме толстой кишки. Ядерно-цитоплазматическая реакция различной степени интенсивности наблюдается в части опухолевых клеток, Х400.
Таблица 2. Регрессионная модель Кокса для больных c диссеминированной формой аденокарциномы толстой кишки, влияние на прогрессирование заболевания в течение химиотерапии
п=104 Beta Станд. ошибка В Станд. ошибка t р-^е!
Модель в целом -18,3044 5,880999 -3,11247 0,004245
ERCC-1 0,138669 0,139825 0,0716 0,072225 0,99173 0,329823
ТР 0,458049 0,146202 0,2221 0,070876 3,13300 0,004032
TS 0,599183 0,160242 0,3684 0,098531 3,73925 0,000842
DPYD 0,125443 0,167654 0,1156 0,15457 0,67468 0,240320
Ш-класс-бета-тубулина 0,073701 0,135189 0,0335 0,061485 0,54518 0,589950
Ю-67 0,290806 0,173469 0,1966 0,117258 1,67642 0,104789
Топоизомераза-11а -0,225681 0,194806 -0,1391 0,120053 -1,15849 0,256450
та при наличии экспрессии ТР и отсутствии TS составила 39%, при обратном сочетании (экспрессия TS и отсутствие ТР) была 13% (р=0,04).
Остальные маркеры не показали корреляции с развитием прогрессирования заболевания, частотой объективного ответа (табл. 2).
таким образом, иммуногистохимическое исследование TS, ТР может быть использовано в прогнозировании эффективности химиотерапии пациентов с аденокарциномой толстой кишки, получающих 5-фторпиримидин содержащие препараты.
Обсуждение
Проанализирована экспрессия наиболее изучаемых в настоящее время ферментов, имеющих отношение к метаболизму химио-препаратов, используемых при лечении адено-карциномы толстой кишки. необходимо отметить, что все исследованные маркеры (TS, ТР, DPYD, топоизомераза-11-альфа, Ш-класс-бета-тубулина, белок гена РТЕ^ — это ферменты, которые кроме опухолевой ткани также встречаются и в нормальных клетках. они выполняют различные функции, необходимые для жизнедеятельности широкого спектра тканей человека. В нашей работе мы выявляли позитивную реакцию данных маркеров в слизистой оболочке толстой кишки, прилежащей к аденокарциноме, во всех исследованных случаях. Кроме того, большинство исследованных маркеров показали интенсивную реакцию в строме опухоли. В частности, экспрессия тимидин фосфорилазы (ТР) всегда была более выраженной в строме опухоли, чем в раковых клетках. Это ставит под сомнение результаты многочисленных работ, которые использовали в своих исследованиях ПЦР и другие неморфологические методики [1, 4, 6, 7, 9]. В данных работах для оценки экспрессии генов используется лизат тканей, иными словами, исследуется одномоментно опухоль, ее строма, а иногда и нормальная слизистая оболочка толстой кишки. В отличие от морфолога,
молекулярный биолог не способен дифференциально подойти к оценке экспрессии в данных трех частях одного образца. Таким образом, в подобных исследованиях зачастую при помощи экспрессии данных маркеров исследуется соотношение стромы и опухолевой ткани, а не истинное значение экспрессии генов.
Выходом из данной ситуации может быть совместное использование морфологических методов и молекулярных с применением лазерного микродиссектора. В этом случае мы выделяем интересующие нас клетки морфологически и исследуем их в дальнейшем с использованием молекулярных методов. Однако даже в этом случае результаты могут быть сомнительными, так как эффективность таких ферментов, как TS и ТР, определяется не только степень выраженности экспрессии, но и активностью фермента. В этом плане антительный метод исследования также является более предпочтительным, так как комплементарность антитела при иммуно-гистохимическом исследовании зависит прежде всего от конформации белка. Конформация же в свою очередь определяет активность фермента. Таким образом, использование различных антител к одному и тому же белку может показать различное предиктивное значение в зависимости от комплементарности антитела к активному ферменту или неактивному.
Остается парадоксальным тот факт, что аде-нокарцинома толстой кишки, обладающая одним из самых высоких уровней пролиферации, имеет самые низкие параметры эффективности химиотерапии.
Адъювантная химиотерапия аденокарциномы толстой кишки, основанная на 5-фтор-пиримидинах и препаратах платины, уже длительное время считается стандартной схемой лечения [3, 8, 12].
Однако при сопоставлении 3-летней выживаемости пациентов, получавших химиотерапию и неполучавших ее, оказывается, что отличие в данных группах статистически недостоверно (71% и 62% соответственно) [3], пятилетняя вы-
живаемость еще меньше отличается в данных двух группах: 53% и 45% соответственно [2]. Вероятно, именно с этим связано, что экспрессия большинства из исследованных маркеров не имеет предиктивного значения эффективности химиотерапии аденокарциномы толстой кишки. Интересно, что даже пролиферативная активность раковых клеток (индекс Ki-67) показала лишь статистически недостоверную связь со временем до прогрессирования заболевания (p>0,05) и не оказала влияния на частоту объективного ответа. Лишь экспрессия двух маркеров, имеющих отношение к метаболизму 5-фтор-пиримидинов, тимидилат синтазы (TS) и тими-дин фосфорилазы (TP), оказала статистически значимое влияние на время до прогрессирова-ния и частоту объективного ответа у больных диссеминированной формой аденокарциномы ободочной кишки (p<0,05).
ЛИТЕРАТУРА
1. Arienti C., Tesei A., Verdecchia G.M. et al. Role of conventional chemosensitivity test and tissue biomarker expression in predicting response to treatment of peritoneal carcinomatosis from colon cancer // Clin. Colorectal Cancer. - 2013. - Vol. 12. - P. 122-127.
2. Belac-Lovasic I., Petkovi M., Ferrari A.M. Evaluation of adjuvant chemotherapy in patients with colorectal cancer in Primorsko-Goranska and Istarska County--a twenty years retrospective study // Coll. Antropol. — 2011. — Vol. 35. — P. 111-114.
3. Efficacy of adjuvant fluorouracil and folinic acid in colon cancer: International Multicentre Pooled Analysis of Colon Cancer Trials (IMPACT) investigators // Lancet. — 1995. — Vol. 345. — P. 939-943.
4. Gray R.G., Quirke P., Handley K. et al. Validation study of a quantitative multigene reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay for assessment of recurrence risk in patients with stage II colon cancer // J. Clin. Oncol. — 2011. — Vol. 29. — P. 4611-4619.
5. Karlberg M., Ohrling K., Edler D. et al. Prognostic and predictive value of thymidylate synthase expression in primary colorectal cancer // Anticancer Res. — 2010. — Vol. 30, №2. — P. 645-651.
6. Lassmann S., Hennig M., Rosenberg R. et al. Thymidine phosphorylase, dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidylate synthase mRNA expression in primary colorectal tumors-correlation to tumor histopathology and clinical follow-up // Int. J. Colorectal Dis. — 2006. — Vol. 21. — P. 238-247.
7. Lindskog E.B., Wettergren Y, Odin E. et al. Thymidine phosphorylase gene expression in stage III colorectal
cancer // Clin. Med. Insights. Oncol. — 2012. — Vol. 6. — P. 347-353.
8. O'Connel M.J., Mailliard J.A., Kahn M.J. et al. Controlled trial of fluorouracil and low-dose leucovorin given for 6 months as postoperative adjuvant therapy for colon cancer // J. Clin. Oncol. — 1997. — Vol. 15. — P. 246-250.
9. Ojima E., Inoue Y, Watanabe H. et al. The optimal schedule for 5-fluorouracil radiosensitization in colon cancer cell lines // Oncol Rep. — 2006. — Vol. 16. — P. 1085-1091.
10. Uchida P.V., Danenberg K.D., Danenberg J.L. Thymidylate synthase, dihydropyrimidine dehydrogenase, ERCC1, and thymidine phosphorylase gene expression in primary and metastatic gastrointestinal adenocarcinoma tissue in patients treated on a phase I trial of Oxaliplatin and capecitabine // BMC Cancer. — 2008. — Vol. 23. — P. 1121-1130.
11. Yu X.Q., Deng C.S., Zhu YQ., Cheng F.Z. Effects of expression of thymidine phosphorylase induced by gam-ma-interferon on regulation of antineoplastic activity of fluorouracil on colonic cancer // Zhonghua Yi. Xue. Za. Zhi. — 2005. — Vol. 85. — P. 568-570.
12. Weiss J.M., Schumacher A.J., Allen G.O. et al. Chemotherapy for Stage II Right-Sided and Left-Sided Colon Cancer: Analysis of SEER-Medicare Data [Электронный ресурс] // Ann. Surg. Oncol. — 2014. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24643898.
G.A.Raskin12 , R.U.Pozharissky1 , R.V.Orlova12 , S.V.Petrov3, A.E.Protasova2
Immunohistochemical study of enzymes of metabolism of chemotherapeutic medicines in colon adenocarcinoma
1 Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies 2 State University, St. Petersburg 3 State Medical University, Kazan
There was studied material of primary tumors from 140 patients with adenocarcinoma of the colon to determine the expression of thymidylate synthetase (TS), thymidine phosphorylase (TP), dihydropyrimidine dehydrogenase, ERCC-1, beta-tubulin III, topoisomerase-II-alpha, Ki-67. Comparison of the clinical picture and the results of immunohistochem-istry were performed to 104 patients with adenocarcinoma of the colon who had undergone chemotherapy by FOLFOX, de Gramont, FOLFIRI schemes. The objective response in the presence of TP expression and absence of TS was 39%, the reverse combination (TS expression and no TP) was 13%. Other markers showed no correlation with the occurrence of disease progression and response rate.
Key words: colon adenocarcinoma, immunohistochemical study
