CC BY
19
БЕЛКИ-МАРКЕРЫ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ
УДК:616.831.4-091.812:616.153.96 © Ю.В. Азизова, Д.Л. Теплый, О.Н. Позднякова, 2011
Ю.В. Азизова, Д.Л. Теплый, О.Н. Позднякова
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ-МАРКЕРОВ АПОПТОЗА НЕЙРОСЕКРЕТОРНЫХ КЛЕТОК ГИПОТАЛАМУСА МЫШЕЙ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
ГОУ ВПО «Астраханский государственный университет» Министерства образования и науки России
В исследуемых тканях иммуногистохимические исследования (ИГХ) синтеза про- и антиапоптотических белков позволили установить следующие закономерности: дегидратация повышает синтез проапоптозного белка Вах в нейросекре-торных клетках гипоталамуса молодых мышей и независимо от возраста снижает антиапоптотическую роль белков семейства Bcl-2, что способствует гибели нейронов этих ядер. Обнаружили, что при старении антиапоптотический эффект альфа-токоферола осуществляется по Вс1-2-зависимому пути.
Ключевые слова: гипоталамус, апоптоз, а-токоферол, старение, водная депривация.
U.V. Azizova, D.L. Tjepli, O.N. Ро7(1пуакоуа
IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS OF MOUSE HYPOTHALAMUS NEUROSECRETORY CELL
APOPTOSIS MARKER POTEINS
In our subsequent work (immunocytochemical reactions), we obtained further regular occurrences: dehydration leads to the increase of proapoptotic protein Bax synthesis in hypothalamic neurosecretory cells in young mice and in age-independent manner, this stress leads to the decrease of antiapoptotic Bcl-2 proteins synthesis. It was found that antiapoptotic effect of alpha tocoferol acetate proceeds by Bcl-2-mediated pathway in aging.
Key words: hypothalamus, apoptosis, alpha-tocoferol, aging, water deprivation, immunocytochemical reactions.
Известно, что основными участниками в регуляции программированной клеточной гибели является семейство белков Bcl-2 (от англ. B-cell lymphoma/leukemia 2), они располагаются на цитоплазматической поверхности внешней мембраны митохондрий, эндоплазматическом ретикулуме и ядерной оболочке [4]. Это семейство структурно сходных белков включает более двух десятков членов, в том числе продукты протоонкогенов Bcl-2 и Bcl-x. Среди них идентифицированы белки, подавляющие апоптоз (Bcl-xl, Mcl-1 и др.) и стимулирующие данный процесс (Bax и др.), которые могут взаимодействовать друг с другом, образуя комплексы гомо- и гетеродимеров [6]. К примеру, Bax может существовать, как гомодимер, формируя гетеродимер с Bcl-2 [3]. В зависимости от того, какие образуются димеры, клетка вступает либо в пролиферацию, либо в апоптоз [5].
Цель: изучить молекулярные механизмы апоптоза нейросекреторных клеток (НСК) гипоталамуса в условиях старения при разных уровнях свободнорадикального окисления.
Материалы и методы. Проведен ряд экспериментов на молодых (2 мес.) и старых (15 мес.) мышах по 10 животных в группе, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Часть животных в течение 3-х дней содержали в клетках со свободным доступом к сухому корму, но без воды. Другая часть животных в качестве ок-сидативного протектора получали 10% раствор а-токоферолацетата per os в течение 14 дней в дозе 0,5 мг на 100 г. массы тела. С целью детального изучения механизма развития апоптоза проведена ИГХ реакция на срезах гипоталамуса для определения экспрессии белков-маркеров апоптоза (Bcl-2, Mcl-1, Bax, p53,) мышей разных возрастных групп.
Результаты. Ранее в наших исследованиях было показано, что интенсификация образования пероксидов в гипоталамусе старых животных и активация гибели нейронов более выражена, чем у молодых, что соответствует многочисленным литературным данным [1].
В эксперименте мы использовали такую специфическую модель стресса, как дегидратация, которая приводит к активации нонапептидергических нейронов супраоптического (СОЯ) и паравентрикулярного (ПВЯ) ядер гипоталамуса. Литературные данные о влиянии гипогидратации на апоптоз нонапептидэргических клеток СОЯ и ПВЯ указывают на инициацию данного процесса в них [2]. В нашем эксперименте обнаружены различия в экспрессии белков-маркеров апоптоза в НСК при дегидратации у молодых и старых животных. Так, у молодых мышей стресс инициирует апоптоз, вызывая при этом увеличение синтеза проапоптотического белка Bax (табл.) и снижение экспрессии антиапоптотических белков семейства Bcl-2 в нейронах гипоталамуса. У старых мышей уровень апоптоза НСК не изменялся при стрессе, так как изначально уровень апоптоза был за-
вышен по сравнению с молодыми, при этом экспрессия проапоптотического белка р53 увеличена, синтез Вах и антиапоптотических белков Вс1-2 и Мс1-1 уменьшен.
Альфа-токоферол при дегидратации снижает синтез Вах, инициируя при этом экспрессию Вс1-2. Однако введение а-токоферола в отсутствие стресса вызывает увеличение продукции белка-индуктора апоптоза Вах при недостаточном увеличении синтеза белка-ингибитора апоптоза Вс1-2. Это объясняет прооксидантный эффект и вызванную альфа-токоферолом инициацию апоптоза у молодых животных.
Таблица
Уровень экспрессии белков маркеров апоптоза в НСК гипоталамуса мышей (М±т)
молодые животные старые животные
р53 Вах Bcl-2 Mcl-1 р53 Вах Bcl-2 Mcl-1
контроль 0,13±0,021 0,09±0,01 0,11±0,04 0,11±0,03 0,10±0,02# 0,09±0,03 0,12±0,04 0,12±0,03
стресс 0,11±0,019 0,11±0,06* 0,07±0,006 * 0,08±0,02* 0,12±0,018* 0,05±0,03* 0,09±0,02** 0,08±0,0003 **
а токоферол 0,11±0,049* 0,11±0,01* 0,09±0,03 0,10±0,029* 0,10±0,01 0,11±0,03 0,14±0,03* 0,09±0,007* *
а токоферол/стресс 0,10±0,044* 0,06±0,006 * оо 0,09±0,04 0,07±0,005** 0,08±0,013* oo 0,09±0,01 0,09±0,03 0,08±0,0004 ***
Примечание: *р<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 - различие между экспериментальными воздействиями внутри группы, # р<0,05 - достоверность различий по отношению к молодым животным, ор<0,05, оор<0,01 - достоверность различий по отношению к стрессу.
Таким образом, на фоне нормального уровня ПОЛ и достаточного количества антиоксидантов в организме молодых животных добавочное количество антиоксиданта а-токоферола оказывает не только проокси-дантное, но и проапоптозное действие. Сопоставимые с терапевтическими дозы а-токоферола у старых животных вызывали снижение апоптоза как в контроле (в результате повышения уровня антиапоптотической защиты Bcl-2, табл.), так и при дегидратации вследствие супрессии белка p53.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Азизова Ю.В., Теплый Д.Л. [и др.] Уровень апоптоза нейросекреторных клеток гипоталамуса при гипогидратационном стрессе на разных этапах онтогенеза. Стресспротекторные эффекты альфа-токоферола // Естественные науки. АГУ. - 2008. - № 8. - С. 36-42.
2. Черниговская Е.В., Никитина Л.С., Дорофеева Н.А., [и др.]. Участие сигнальных белков апоптоза в регуляции функциональной активности нейронов мозга крыс // Науч. труды 1 Съезда физиологов СНГ. - 2005. - Т. 2. - С. 53.
3. Dietrich J. Apoptosis and anti-apoptosis genes in the Bcl-2 family // Arch Physiol Biochem. - 1997. -Vol. 105, № 2. - P. 125-135.
4. Jacobson M.D., Burne J.F., M.P. King [et al.]. Bcl-2 blocks apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA // Nature. - 1993. - Vol. 361, № 6410. - P. 365-366.
5. Kumar S. The Bcl-2 family of proteins and activation on the ICE/ CED-3 family of proteases: A balancing act in apoptosis? // Cell Death Differ. - 1997. - Vol. 4. - P. 2-3.
6. Tao W., Kurschner C., Morgan J.I. Modulation of cell death in yeast by the Bcl-2 family of proteins // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272, № 24. - P. 15547-15552.
Азизова Юлия Владимировна, кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры физиологии и морфологии человека и животных ГОУ ВПО «Астраханский государственный университет» Министерства образования и науки России, Россия, 414056, г. Астрахань, ул. Татищева 20 а, тел. 22-82-64, e-mail: [email protected]
Теплый Давид Львович , доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой физиологии и морфологии человека и животных ГОУ ВПО «Астраханский государственный университет» Министерства образования и науки России, Россия, 414056, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1, тел: 8(8512) 30-80-06, e-mail: [email protected]
Позднякова Ольга Николаевна, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной физиологии ГОУ ВПО «Астраханский государственный университет» Министерства образования и науки России, Россия, 414056, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1, тел: 8(8512) 25-45-90. e-mail: [email protected]
