CC BY
205
THE NATURAL EMBRYOTROPIC AUTOANTIBODIES IN PATIENTS WITH INTERNAL ENDOMETRIOSIS
O.T. LOBANOVA, V.E. RADZINSKY, I.M. ORDIYANTS,
N.Yu. GRIGORIEVA, L.D. ORAZMURADOVA
Department of Obstetrics and Gynaecology with course of Perinatology Russian University of Peoples’ Friendship Miklukho-Maklaya str., 8, Medical Faculty, 117198 Moscow, Russia
Aim: to investigate the parameters of immune system in women with internal endometriosis.
Methods: the level of the natural embryotropic autoantibodies in serum was detected by ELI-P-Test (ELISA-detected Probably of pathology).
Material. 35 women of reproductive age: 16 patients with internal endometriosis and 19 — with internal endometriosis and uterine myoma.
Results. Changes in immune system in all patients with internal endometriosis were established: 4 of them had hyporeactivity of immune system, 31 had hyperreactivity and normoreactivity was not observed at all.
Conclusion: the data obtained testified the immune mechanism of developing of endometriosis and supposed the appropriate immunocorrecting therapy.
УДК 618.145-008.9-091.8
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ В ЭНДОМЕТРИИ ЖЕНЩИН В ХОДЕ НОРМАЛЬНОГО МЕНСТРУАЛЬНОГО ЦИКЛА
М.Х. АШХАБ, А.Л. ВЛАДИМИРЦЕВА, Н.Н. ШЕЛЯСТИНА, И.И. БАБИЧЕНКО
Кафедра патологической анатомии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет, 117198 Москва, Россия
Материалом для исследования служили соскобы из полости матки с неизмененным эндометрием у 39 женщин после диагностической биопсии при полипах эндометрия (21 случай), полипах цервикального канала (6 случаев), миомах матки (7 случаев), эрозиях шейки матки (3 случая), дисплазии шейки матки (1 случай) и аденомиозе (1 случай). Женщины не получали предварительного гормонального лечения. Средний возраст пациенток составлял 38,6±7,2 лет.
Выявление тканевых антигенов проводили авидин-биотиновым методом. Для иммуногас-тохимического исследования эндометрия в качестве первичных иммунных сывороток использовали мышиные моноклональные антитела к эстрогеновому рецептору и мышиные моноклональные антитела к прогестероновому рецептору. Иммуногастохимические исследования эндометрия выявили корреляционные взаимосвязи между стадиями фаз менструального цикла и экспрессией рецепторов к стероидным гормонам в ядрах эпителия желез и стромаль-ных клеток. Максимальная чувствительность эпителия желез эндометрия к эстрогенам и выраженная экспрессия эстрогеновых рецепторов отмечена в среднюю и позднюю стадии фазы пролиферации. Высокая чувствительность железистого эпителия к прогестерону выявлена в среднюю и позднюю фазы пролиферации и раннюю стадию фазы секреции.
Клетки стромы проявляют чувствительность к действию стероидных гормонов более длительный период (по сравнению с эпителием желез) к эстрогенам, начиная с ранней стадии пролиферации до ранней стадии фазы секреции, и к прогестерону — со средней стадии фазы пролиферации и до поздней стадии фазы секреции.
Функциональная активность эндометрия находится под контролем циклической секреции стероидных гормонов яичника. Эстрадиол (Э2) и прогестерон (П) изменяют структуру и функцию эндометриальных клеток посредством воздействия на синтез РНК и белка. Эти эффекты осуществляются через высокоаффинные рецепторы к стероидам [17]. Внутриклеточные рецепторы стероидных гормонов представляют собой ядерные белки, которые специфически связывают лиганд и опосредуют
его модулирующее действие на транскрипцию генов органов-мишеней, вызывая в них функциональные и морфологические изменения [2, 3].
Поскольку эндометрий является высокоспециализированной тканью с особой, биологически обусловленной чувствительностью к стероидным гормонам, на протяжении менструального цикла в его эпителиальных клетках можно предположить различную степень экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону. В настоящее время иммуногистохимическим методом с использованием специфических моноклональных антител можно выявить подобные изменения чувствительности эндометрия к стероидам за счет непосредственной визуализации ядерных рецепторов к эстрогенам и прогестерону как в отдельных клетках желез эндометрия, так и в его стромальных элементах [5, 7, 8, 13, 14].
Целью исследования являлась оценка динамики экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону в ходе фазовых изменений менструального цикла в железах и строме эндометрия человека.
Материал и методика исследования. Исследования проводились на клинической базе кафедры патологической анатомии медицинского факультета Российского университета дружбы народов — Госпитале для ветеранов войн № 2 г. Москвы (главный врач — заслуженный врач Российской Федерации, к. м. н. Г.М. Местергази). Все хирургические манипуляции по забору гистологического материала проводились в отделении гинекологии госпиталя. Материалом для исследования служили соскобы из полости матки с неизмененным эндометрием у 39 женщин после диагностической биопсии при полипах эндометрия (21 случай), полипах цервикального канала (6 случаев), миомах матки (7 случаев), эрозиях шейки матки (3 случая), дисплазии шейки матки (1 случай) и аденомиозе (1 случай). Женщины не получали предварительного гормонального лечения. Средний возраст пациенток составлял 38,6±7,2 лет.
Фазу пролиферации исследовали у 15 пациенток. Из них 4 — с ранней стадией фазы пролиферации, 6 — со средней стадией и 5 — с поздней стадией фазы пролиферации. В фазу секреции было обследовано 19 женщин (5 — с ранней стадией, 6 — со средней и 8 — с поздней стадией). В фазу десквамации было исследовано 5 случаев.
Соскобы эндометрия классифицировали следующим образом: ранняя стадия пролиферации (4—7-й день); средняя стадия пролиферации (8—10-й день); поздняя стадия пролиферации (11—14-й день); ранняя стадия секреции (15—18-й день); средняя стадия секреции (19—23-й день); поздняя стадия секреции (24—27-й день); фаза десквамации (менструация) — (28—4-й день) при 28-дневном цикле.
Гистологический материал исследовали иммуногистохимическим методом [1,
12, 16]. Из фиксированных в нейтральном формалине и залитых в парафин кусочков ткани эндометрия делали тонкие срезы толщиной 4—5 мкм и помещали по 3—4 на стекла, покрытые поли-L-лизином.
Выявление тканевых антигенов проводили авидин-биопшовым методом, в котором биотинированные вторичные антитела реагируют с соответствующими молекулами пероксидазно-конъюгированного стрептовидина. Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет визуально обнаружить места расположения определяемых антигенов. При постановке иммуногистохимической реакции использовали универсальный пероксидазный DAKO LSAB + Kit (Dako corporation USA).
В качестве «демаскирующего» приема использовали нагревание стекол со срезами в микроволновой печи SAMSUNG М 745R/M735R [1, 10].
Для иммуногистохимического исследования эндометрия в качестве первичных иммунных сывороток использовали:
1) мышиные моноклональные антитела к эстрогеновому рецептору (Dako cojporaition, USA);
2) мышиные моноклональные антитела к прогестероновому рецептору (Dako corporation, USA).
На каждом стекле один срез (контрольный) обрабатывали неиммунной мышиной сывороткой (Dako coiporaition, USA). Все буферные растворы, используемые в работе, готовили на деионизированной воде.
Анализ окрашенных пероксидазным методом ядер осуществляли при увеличении окуляра 40х. Для каждого случая подсчитывали по 500 ядер в эпителиальных
клетках и в клетках стромы эндометрия. Интенсивность иммуногистохимической реакции оценивали по 3-бальной шкале:
— отсутствие реакции;
± — умеренная реакция,
+ — сильная реакция.
Для каждого случая подсчитывали % окрашенных с различной степенью интенсивности ядер.
Результаты. Проведенные иммуногистохимические исследования эндометрия выявили определенные корреляционные взаимосвязи между стадиями фаз менструального цикла и экспрессией рецепторов к стероидным гормонам, как в ядрах эпителия желез, так и стромальных клетках (табл. 1 и 2).
Таблица 1
Доля ядер эпителиальных клеток эндометрия (в %), экспрессирующих рецепторы к эстрогенам и прогестерону в зависимости от фазы менструального цикла
Рецепторы К ЭСТ] рогенам Рецепта] }Ы к прогестерону
№ п/п Фаза менструального цикла выраженная экспрессия, % умеренная экспрессия, % отсутствие экспрессии, % выраженная экспрессия, % умеренная экспрессия, % отсутствие экспрессии, %
1 Ранняя стадия пролиферации 59,6 20 20,3 54,5 22,5 22,9
2 Средняя стадия пролиферации 98,9 0,5 0,52 90,4 4,25 5,31
3 Поздняя стадия пролиферации 96,4 2 1,5 87,2 9,2 3,45
4 Ранняя стадия секреции 10,9 11,5 77,4 70 6,1 23,8
5 Средняя стадия секреции 8,83 3,98 86,6 4,1 5,9 83,8
6 Поздняя стадия секреции 0,98 0,6 98,3 0 8,7 85,3
7 Фаза десквамации (менструация) 1,4 2,9 95,5 0 7,1 92,9
Таблица 2
Доля ядер стромальных клеток эндометрия (в %), экспрессирующих рецепторы к эстрогенам и прогестерону в зависимости от фазы менструального цикла
Рецепторы к эсп рогенам Рецептої )ы к прогестерону
№ п/п Фаза менструального цикла выраженная экспрессия, % умеренная экспрессия, % отсутствие экспрессии, % выраженная экспрессия, % умеренная экспрессия, % отсутствие экспрессии, %
1 Ранняя стадия пролиферации 49,7 15,2 34,9 17,8 7,9 7,4
2 Средняя стадия пролиферации 85,5 5 9,8 36,4 8,9 54,5
3 Поздняя стадия пролиферации 42,2 37,7 20 64,9 24,3 10,8
4 Ранняя стадия секреции 53,9 1,1 44,9 41 1,5 57,4
5 Средняя стадия секреции 28,2 3,4 68,3 78,3 2,8 18,8
6 Поздняя стадия секреции 6 12 81,8 61,5 5,7 30,7
7 Фаза десквамации (менструация) 0 1,14 98,8 3,6 0,73 95,5
Ранняя фаза пролиферации характеризовалась умеренной экспрессией рецепторов к Эг и П в эпителии желез. 59,6% и 54,5% клеточных ядер интенсивно
окрашивались на Эг и П рецепторы. Количество клеток с выраженной экспрессией этих рецепторов достигало максимальных значений (98,9%; 96,4% и 90,4%; 87,2%) в среднюю и позднюю стадии пролиферации. Фаза секреции характеризовалась резким снижением экспрессии к Эг (ранняя стадия фазы секреции 10,9%) и более длительной экспрессией рецепторов к П (ранняя стадия секреции — 70%, средняя стадия секреции — 4,1%). В позднюю стадию секреции и стадию десквамации экспрессия рецепторов к Э2 и П прекращалась (0,98%; 1,4 и 0%; 0%).
Динамика экспрессии рецепторов к стероидным гормонам в ядрах клеток стромы отличалась от эпителия желез. При этом наблюдались постепенное увеличение количества клеток с выраженной экспрессией рецепторов к Эг с 49,7% в раннюю стадию фазы пролиферации до 85,5% в среднюю стадию фазы пролиферации и постепенное снижение до поздней стадии секреции. Доля клеток стромы с выраженной экспрессией рецепторов к П также постепенно увеличивалась и достигала максимума (64,9%) к поздней стадии пролиферации и средней стадии секреции (78,3%) и постепенно снижалась к стадии десквамации (3,6%).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в ядрах эпителиальных и стромальных клеток эндометрия в ходе менструального цикла у женщин осуществляются фазовые изменения экспрессии рецепторов К Э2 и П.
Обсуждение. Эффективность гормональных методов лечения в гинекологии во многом зависит от уровня экспрессии в клетках эндометрия рецепторов к стероидным гормонам. С целью количественного анализа рецепторов к Эг и П в настоящее время используются различные методы: гормоно-лигандосвязываю-щий [4, 15], флюоресцентный [6], ауторадиографический [9] и иммуногистохи-мический [5, 7, 8, 11, 13, 14].
Используя метод ауторадиографии S.F. Gould и соавт. [9] выявили наличие рецепторов к Эг в ткани эндометрия и показали циклический характер их экспрессии. Иммуногистохимический метод с использованием моноклональных антител к Эг- и П-рецепторам имеет определенные преимущества по сравнению с другими вышеперечисленными методиками, поскольку позволяет определить не только количество рецепторов к стероидным гормонам в тканях, но и визуализировать экспрессирующие их клеточные элементы. Так, Т. Ташауа и соавт. [15] иммуногистохимическим методом удалось проследить циклический характер экспрессии рецепторов к стероидным гормонам в эпителиальных и стромальных клетках эндометрия. В дальнейшем иммуногистохимический метод стал широко применяться для исследования экспрессии Эг- и П-рецепторов в ходе менструального цикла в эндометрии [5, 8, 11, 14]. При этом было показано увеличение концентрации рецепторов к Эг и П в железах и строме в фазу пролиферации менструального цикла и снижение этих показателей в фазу секреции.
В нашем исследовании удалось провести дифференцированный анализ экспрессии стероидных гормонов в клетках желез и стромы в различные стадии фаз пролиферации и секреции в ходе нормального менструального цикла у женщин. При этом полученные результаты подтвердили циклический характер экспрессии рецепторов к Эг и П как в ядрах желез, так и стромальных клеток. Наиболее значительные циклические изменения выявлены нами в ядрах эпителиальных клеток по сравнению со стромальными.
Максимальная чувствительность эпителия желез эндометрия к эстрогенам в результате выраженной экспрессии Эг-рецепторов отмечена в среднюю и позднюю стадии фазы пролиферации. Высокая чувствительность железистого эпителия к прогестерону выявлена в среднюю и позднюю фазы пролиферации и раннюю стадию фазы секреции. Клетки стромы проявляют чувствительность к действию стероидных гормонов более длительный период по сравнению с эпителием желез, к эстрогенам — начиная с ранней стадии пролиферации до ранней стадии фазы секреции, и со средней стадии фазы пролиферации и до поздней стадии фазы секреции к прогестерону. При этом отмечена определенная цикличность в экспрессии рецепторов к Эг и П. Динамика экспрессии рецепторов к Эг
опережает экспрессию к П как в эпителии желез, так и в стромалъных клетках на одну стадию в каждой фазе менструального цикла.
Таким образом, экспрессия биологически активных рецепторов к Эг является предпосылкой для синтеза рецепторов к прогестерону, а сама система регуляции синтеза стероидных рецепторов находится под влиянием уровня эстрогенов и прогестерона в крови. В фазу пролиферации высокий уровень эстрогенов в крови приводит к увеличению экспрессии стероидных рецепторов к Эг и П в эндометрии. В лютеиновую фазу персистенция прогестерона вызывает снижение концентрации рецепторов к Эг и П в железах и наблюдается секреторная трансформация эндометрия. В фазу секреции исчезновение рецепторов к П в эпителии желез и высокий уровень их экспрессии в клетках стромы, может свидетельствовать о снижении функциональной значимости популяции эпителиальных клеток желез в ранние сроки беременности [12], при этом в строме, которая становится децвдуализированной, для дальнейшего роста и развития необходимы рецепторы к стероидным гормонам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гуревич Л.Е., Исаков В. А Использование иммуногистохимического исследования метода
восстановления антигенной специфичности воздействием микроволн на ткани, фиксированные формалином и заключенные в парафин // Архив патологии, 1999; 61: 48-50.
2. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. — Волгоград, Изд-во: Семь ветров, 1999. — 538 с.
3. Bayard F, Damilano S., Robel P., Banlin E.E. Cytoplasmic and nuclear estradiol and proges-
terone receptors in human endometrium I I J clin Endocrinol Metab, 1978; 46: 635.
4. Bergqvist A, Femo M. Estrogen and progesterone receptors in endometriotic tissue and endometrium: comparison according to localization and recurrence // Fertil Steril, 1993; 60: 63-68.
5. Bergqvist A, Femo M. Oestrogen and progesterone receptors in endometriotic tissue and endometrium: comparison of different cycle phases and ages // Reprod., 1993; 8: 2211—2217.
6. Bergqvist A., Jeppsson S., Ljungberg O. Histochemical demonstration of estrogen and proges-
terone binding in endometriotic tissue and in uterine endometrium // J Histochem Cytochem, 1985; 33: 155-161.
7. Bergqvist A., Ljunberg O., Skoog L. Immunohistochemical analysis of oestrogen and progesterone
receptors in endometriotic tissue and endometrium I I Hum Reprod, 1993; 8: 1915—1922.
8. Bouchard Ph., Marraoui J., Masai M.R., Medalie D.A et al. Immunocytochemical localization
of oestradiol and progesterone receptors in human endometrium: a tool to assess endometrial maturation. Baillieres // Clin Obstet Gynaecol., 1991; 5: 107—115.
9. Gould S.F., Shannon J.M., Cunha G.R. Nuclear estrogen binding sites in human endometriosis // Fertil Steril, 1983; 39: 520—524.
10. Jsola J.J. Immunohistochemical demonstration of androgen receptor in breast cancer and its relation-ship to other prognostic factors // J. Pathology, 1993; 170: 31—35.
11. Lessey B.A, Metzger D.A., Haney A.F., McCarty K.S.Jr. Immunohistochemical analysis of estrogen and progesterone receptors in endometriosis: comparison with normal endometrium during the menstrual cycle and the effect of medical therapy // Fertil Steril, 1989; 51: 409-415.
12. Madhabananda S. Application of avidin-biotin complex technique for the localization of estradiol receptor in tarssues using monoclonal antibodies. Jn: Techniques in immunocyto-chemistry / Ed. by G. R. Bullock and P. Petrussz. — London, New-York, Tokyo: Aacad. Press, 1985, p. 43—45.
13. Metzger D.A. Cyclic changes in endometriosis implants I I The current status of endometriosis research and management / Ed. I. Brosens, J. Donnez. — Camforth: Parthenon Publishing Group Ltd, 1993, p. 89—108.
14. Snijders M.P.M.L., De Goeij A.F.M.P., Debets Те Baerts M.J.C., Rousch M.J.M. et al. Immunocytochemical analysis of oestrogen receptors and progesterone receptors in the human
uterus throughout the menstrual cycle and after the menopause // J Reprod, Fertil, 1992; 94: 363-371.
15. Tamaya T., Murakami T., Okada H. Concentrations of steroid receptors in normal human endometrium in relation to the day of the menstrual cycle // Acta Obstet, Gynecol. Scand, 1986; 65: 195-198.
16. Wamke R., Levy R. Detection of T- and B-cell antigens with hybridoma monoclonal antibodies. A biotin-avidin-horse-radish peroxidase method // J. Histochem. Cytochem, 1980; 28: 771.
17. Yen S., Jaffe R. Physiology, pathophysiology and clinical management // Reproductive endocrinolocy. Second edition, 1998, p. 288—292.
IMMUNOHISTOCHEMICAL RESEARCH OF STEROID RECEPTORS EXPRESSION IN HUMAN ENDOMETRIUM DURING A NORMAL MENSTRUAL CYCLE
M.K. ASHHAB, A.L. VLADIMIRTSEVA, N.N. SHELYASTINA, 1.1. BABICHENKO
Department of Pathology. Medical faculty Russian University of Peoples’ Friendship Miklukho-Maklaya str., 8, Medical Faculty, 117198 Moscow, Russia
The material for research was served currettages from uteri with normal endometrium of 39 women after a diagnostic biopsy at endometrial polyps (21 cases), cervical polyps (6 cases), uterine myomas (7 cases), cervical erosions (3 cases), cervical uteri dysplasia (1 case) and adenomyosis (1 case). The women did not receive preliminary hormonal treatment. The average age of patients was 38,6±7,2 years.
Revealing of tissue antigens was carried out by an avidin-biotin method. For the immunohistochemical study of endometrium as primary antibody we used mice monoclonal antibodies for oestrogen receptor and mice monoclonal antibodies for progesterone receptor. The research revealed the correlation interrelations between stages of menstrual cycle phases and expression of steroid receptors in glandular epithelium and cells of endometrial stroma. The maximal sensitivity of epithelium glandular cells to oestrogens and its receptors expression were observed at middle and late stages of proliferation phase. The highest sensitivity of a glandular epithelium to progesterone is revealed in average and late stages of a proliferation phase and early stage of a secretion phase.
The stromal cells showed sensitivity to steroids for more prolonged period, in comparison with a glandular epithelium, to oestrogens — since an early stage of a proliferation up to an early stage of a secretion phase, and to progesterone from a middle stage of a proliferation phase and up to a late stage of a secretion phase.
УДК 618.3-008.939.15-092.18
ОБМЕН ЛИПИДОВ В КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАНАХ В ПЕРВОМ ТРИМЕСТРЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ И ОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ
Х.Б. КОКАШВИЛИ, А.А. ОРАЗМУРАДОВ
Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет, 117198 Москва, Россия
К.М. РЯБЦЕВ
Городская клиническая больница № 29 Госпитальная пл., 2, 111020 Москва, Россия
Целью исследования послужило изучение молекулярных изменений состава жирных кислот эритроцитарных мембран при физиологической и осложненной беременности.
Обследовано 60 женщин, которые были разделены на 3 группы: 1-я — небеременные женщины (20 пациенток), П-я — беременные с физиологическим течением (20 случаев) и Ш-я — беременные с угрозой прерывания беременности (20 пациенток). Все беременные
