CC BY
16
Оригинальные исследования УДК 616.441-006.6-033.2-037-076 ао1: 10.25298/2221-8785-2018-16-6-661-665
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РИСКА ЛИМ0ОГЕННОГО
МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ПАПИЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Бутолина К. М.(butkar.74@mail.ru)/ 'Штабинская Т. Т.(shtabik@list.ru)/ 'Басинский В. А.(basinsk@gmail.com), 'Ляликов С. А.(lalikov@tut.by), 2Маршалэк А. (amars@ump.edu.pl) 1УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь 2Университет им. Н. Коперника, Торунь, Польша
Введение. Метастазы ПРЩЖ в лимфоузлы шеи являются фактором риска рецидива заболевания. Иммунная клеточная инфильтрация в опухоли и вокруг нее играет важную роль в процессах опухолевой прогрессии и метастазирования.
Цель. дать иммуногистохимическую оценку характера иммунного клеточного инфильтрата в ПРЩЖ при наличии лимфогенных метастазов опухоли.
Материал и методы. Выполнено иммуногистохимическое исследование на серийных парафиновых срезах с использованием мышиных моноклональных антител к антигенам CD3, CD4, CD1a, CD23, CD25, CD8 и TGF-в.
Выводы. При уровне позитивности CD1a, равном 2,215, с чувствительностью 60% и специфичностью 100%, а также при уровне CD1a/CD3, равном 0,20 с чувствительностью 100% и специфичностью 71,4% можно прогнозировать лимфогенные метастазы ПРЩЖ у женщин младше 45 лет. В случае, когда экспрессия CD1a и уровень позитивности CD1a/CD3 выше или ниже указанных пороговых значений, для диагностики лимфогенных метастазов ПРЩЖ у женщин младше 45 лет можно использовать дискриминантное уравнение.
Ключевые слова: рак щитовидной железы, лимфогенные метастазы, иммуногистохимия, субпопуляции лимфоцитов.
Введение
Рак щитовидной железы составляет 2,7% всех злокачественных опухолей у женщин в мире с ежегодной заболеваемостью 6,2% [1, 2]. Папиллярный рак щитовидной железы (ПРЩЖ) - наиболее распространенный тип дифференцированного рака щитовидной железы, 10- и 15-летняя выживаемость составляет 91,38 и 88,69%, соответственно [3]. Несмотря на благоприятный прогноз, в 30-40% случаев ПРЩЖ развиваются метастазы в лимфоузлы шеи, которые рассматриваются как фактор риска рецидива заболевания, что значительно ухудшает прогноз. Роль профилактической центральной и периферической диссекции лимфоузлов у пациентов с клинически отрицательными лимфогенными метастазами остается спорной из-за возможных осложнений. Ультразвуковое исследование шеи и компьютерная томография с контрастным усилением, широко используемые для предоперационной визуализации лимфогенных метастазов, не являются особо точными и характеризуются низкой чувствительностью: 23-53,2 и 41-66,7%, соответственно [4].
Убедительно доказано, что такие факторы, как возраст младше 45 лет, билатеральность и мультифокальность поражения щитовидной железы, гистологический тип ПРЩЖ, сосудистая инвазия, отсутствие капсулы опухоли и экстра-тиреоидное ее распространение, оказывают значительное влияние на развитие лимфогенных метастазов [5].
В процессах опухолевой прогрессии и ме-тастазирования важную роль играют иммунные реакции [6]. Местным иммунным ответом организма является воспалительная клеточная инфильтрация в опухоли и вокруг нее. Преоб-
ладающими среди клеток иммунного воспалительного инфильтрата являются лимфоциты, представленные разными субпопуляциями Т-лимфоцитов и В-лимфоцитами. Рост опухоли контролируется главным образом с помощью CD4+ и CD8+ Т-клеток. Выраженная инфильтрация опухоли цитотоксическими CD8+ Т-лимфо-цитами, как правило, служит показателем благоприятного прогноза заболевания [7]. Небольшая субпопуляция CD4+ Т-лимфоцитов - регуля-торные Т-клетки, экспрессирующие молекулы CD25 и Foxp3, - угнетают иммунную реакцию на опухоль. Увеличение количества регулятор-ных Т-лимфоцитов связано с плохим прогнозом во многих раках, включая рак яичников, молочных желез и лимфому [7]. Т-регуляторные клетки обнаруживаются внутри и вокруг опухолей щитовидной железы, их количество коррелирует с тяжестью заболевания и метастазами в лимфатические узлы [8, 9]. В опухолевом иммунном клеточном инфильтрате присутствуют дендритные клетки, которые активируют Т- и В-лимфо-циты, представляя антигены на основных комплексах гистосовместимости I и II классов. В ряде исследований показано, что высокое количество дендритных клеток положительно влияет на исход злокачественных опухолей, в том числе и ПРЩЖ [7, 10].
Цель исследования: дать иммуногистохими-ческую оценку характера иммунного клеточного инфильтрата в ПРЩЖ при наличии лимфоген-ных метастазов опухоли.
Материал и методы
Материалом для исследования стали 34 наблюдения ПРЩЖ у женщин, удаленного в Гродненской областной клинической больнице (Бе-
ларусь). Изучаемые случаи рассматривались в 2 группах. В 1-ю группу было отобрано 16 наблюдений ПРЩЖ у пациенток молодой возрастной группы (младше 45 лет), во 2-ю группу - 18 пациенток среднего и пожилого возраста с ПРЩЖ.
Выполнено иммуногистохимическое (ИГХ) исследование на серийных парафиновых срезах с использованием мышиных моноклональных антител к антигенам CD3, CD4, CD1a, CD23, CD25, CD8 и TGF-ß (фирма «Dako», Дания). Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 3 мкм и переносили на предметные стекла ultra frost+. Срезы высушивали 18 часов при комнатной температуре в вертикальном положении и помещали на 30 минут в термостат при температуре 60°С. После этого проводилась депа-рафинация в ксилоле (в батарее из 3 емкостей, по 3 минуты в каждой) и обработка в спирте (в батарее из трех емкостей спиртов в нисходящей крепости, по 3 минуты). Далее предметные стекла со срезами помещались в цитратный буфер рН 6.0 и ставились на 30 минут в водяную баню при температуре 98°С. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы обрабатывались 3% перекисью водорода в течение 5 минут. Затем наносились первичные антитела в разведении 1:50, и срезы инкубировались в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве вторичных антител и пероксидазного комплекса использовали стандартный набор EnVision (фирма «Dako», Дания). Для визуализации реакции применяли раствор диаминобензидина (DAB) (фирма «Dako», Дания), которым срезы обрабатывались в течение 10 минут. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера и заключали в полистирол под покровное стекло. Контрольный срез оставляли без первой инкубации. Позитивным критерием оценки реакции с антителами считали светло-коричневое и коричневое мембранное окрашивание лимфоцитов, а для маркера TGFß - также цитоплазматическое окрашивание тиреоидных клеток.
Для количественной оценки результатов им-муногистохимической реакции микропрепараты фотографировали при помощи микроскопа Leica и цифровой камеры Leica 425C с использованием объектива х20 с разрешением 1600^1200 пикселей в 7 неперекрывающихся полях зрения. Для интерпретации результатов в среде компьютерной программы «MashaCV» (свидетельство о регистрации № 452, 12.11.2012, РБ) определялся показатель «позитивность» - отношение коричневых пикселов к общему их числу. Для каждого случая рассчитывалось среднее значение позитивности всех изображений.
Статистический анализ данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 (SNAXAR207F394425FA-Q). При оценке достоверности воздействия одного из факторов с учетом одновременного влияния на изучаемые показатели ряда других факторов, а также для вычленения и оценки вклада каждого конкретного фактора и их композиций на величину дисперсии изучаемого показателя применялся многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA).
Построение многофакторной модели диагностики лимфогенных метастазов проводилось с использованием дискриминантного анализа (прямым пошаговым методом). В качестве зависимых переменных использовались показатели позитивности изучаемых антигенов, в качестве группирующих (независимых) переменных - категория pN (pN0 и pN1 - отсутствие и наличие метастазов в лимфоузлы шеи, соответственно), установленная после оперативного вмешательства, и возраст (до 45 лет/45 лет и старше). Нулевая гипотеза (об отсутствии различий между переменными, отсутствии влияния группирующей переменной) отвергалась на уровне значимости а=0,05 (p<0,05) для каждого из использованных тестов. Прогностическая значимость переменных и критические значения (точки разделения) оценивали с помощью анализа характеристических кривых (receiver operating characteristic. ROC). Представление признака в работе приводилось в формате Me (LQ;UQ), где Me - медиана, LQ и UQ - нижний и верхний квартили, соответственно.
Результаты и обсуждение
Анализ экспрессии изучаемых маркеров в зависимости от возраста пациенток с метастазами и без таковых показал, что статистически значимо в опухолевом узле различаются уровни CDla и соотношение CD1a/CD3.
Установлена статистическая значимость вклада сочетания двух независимых переменных (F=5,27; p=0,03) в дисперсию CDla (рис. 1). В группе пациенток молодого возраста с метастазами в регионарных лимфатических узлах уровень CDla достоверно выше (3,02 (1,053,55)), чем у пациенток без метастазов (0,97 (0,26-1,755)), р=0,05. В группе 2 уровень CDla составил 1,358 (0,760-2,57) при pN0 и 1,07 (0,825-1,460) - если pN1. Однако эти различия не являются статистически значимыми (р=0,62).
Current effect: F(1, 26)=5,2706, p=,03000
5,0 4,5 4,0 3,5 3,0
S 2,5
I. 2,0
8 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0
N 1
1 - молодой возраст;
2 - средний возраст.
pN 0
pN 1
Рисунок 1. - Уровень CD1a в опухоли в зависимости от категории рМу пациентов разных возрастных групп
Примечание: вертикальные отрезки обозначают 95% доверительные интервалы
ROC-анализ позволил определить точку разделения для диагностики лимфогенных метастазов у пациенток молодого возраста в зависимости от уровня CD1a в опухолевом узле (рис. 2). Площадь под ROC-кривой равняется 0,80±0,15 (достоверность различия с площадью под диагональю равна 0,039). Наиболее оптимальное соотношение чувствительности и специфичности, установленное с помощью ROC-анализа, соответствует уровню CD1a, равному 2,215 (чувствительность - 60%, специфичность - 100%).
СиггегЛ б1б<* F(1, 26)=3,5418, p=,07108
Рисунок 2. - Соотношение чувствительности и специфичности ^ОС-кривая) при диагностике метастазов в зависимости от уровня CD1a в опухолевом узле у пациенток молодого возраста
При оценке влияния группирующих переменных на соотношение уровней CD1a и CD3 в опухолевом узле с помощью ANOVA установлено, что достоверен вклад как переменной pN ^=4,10; р=0,05), так и сочетания возраста и pN ^=3,54; р=0,07) (рис. 3). В группе пациенток в возрасте до 45 лет с метастазами в регионарных лимфатических узлах соотношение CD1a и CD3 в ПРЩЖ достоверно выше, чем без таковых (0,67 (0,49-1,59) и 0,09 (0,08-0,620, соответственно; р=0,04)). В группе пациенток 45 лет и старше соотношение изучаемых маркеров также выше в случаях с рШ, однако эти различия не значимы (0,51 (0,25-0,77) и 0,32 (0,07-0,73), соответственно; р=0,5).
ROC-анализ позволил определить точку разделения для диагностики лимфогенных метастазов у пациенток молодого возраста в зависимости от соотношения CD1a и CD3 в опухолевом узле (рис. 4). Площадь под ROC-кривой равняется 0,86±0,11 (достоверность различия с площадью под диагональю = 0,001). Наиболее оптимальное соотношение чувствительности и специфичности, установленное с помощью ROC-анализа, соответствует уровню CD1a/CD3. равному 0,20 (чувствительность - 100%, специфичность - 71,4%).
При построении математической модели диагностики лимфогенных метастазов (дискрими-нантной функции) обратным пошаговым методом у пациентов с ПРЩЖ были использованы
ь-
ь
1
и
1 - молодой возраст;
2 - средний возраст.
pN 0
pN 1
Рисунок 3. - Соотношение CD1a/CD3 в опухоли в зависимости от категории рМу пациенток разных возрастных групп
С01_С03_узгы_
100 80 $ 60
с
<и СО
40
20
100,0 5реа((йу 71,4 Сгйепоп: >0,2031
... "Г АиС = 0,857 Р = 0,001 . . 1 . . . 1 . . .
0 20 40 60 80 100 100-8реаЯсйу
Рисунок 4. - Соотношение чувствительности и специфичности ^ОС-кривая) при диагностике метастазов в зависимости от уровня CD1a/CD3 в опухолевом узле у пациенток молодого возраста
90 клинико-анамнестических и морфологических показателей. Однако установлено, что достоверно влияют на наличие метастазов всего 3 из них.
Характеристика переменных, включенных в модель прогнозирования, представлена в таблице 1.
Таблица 1. - Характеристика переменных, включенных в модель прогнозирования
Переменные Лямбда Уилкса F-исключить Р
СБ1а/СБ3 0,779 26,97 0,003
СБ4/СБ3 0,505 15,71 0,01
СБ25/СБ3 0,346 9.18 0,029
2,0
1,8
1,6
1,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
Классификационная функция, полученная с использованием указанных переменных, представлена в таблице 2, классификационная матрица - в таблице 3.
Таблица 2. - Функция классификации для диагностики лимфогенных метастазов
Переменные Коэффициенты Y
CD1a/CD3 26,9189
CD4/CD3 0,7528
CD25/CD3 -0,0915
Константа -20,5868
Таблица 3. - Классификационная матрица, полученная в результате применения классификационной функции для диагностики лимфогенных метастазов
Доля правильных прогнозов Неблагоприятный исход (случаев) (прогнозируемое состояние) Благоприятный исход (случаев) (прогнозируемое состояние)
Неблагоприятный исход (наблюдаемое состояние) 80% 4 1
Благоприятный исход (наблюдаемое состояние) 100% 0 7
Всего 91,7% 4 8
Анализ классификационной матрицы, значение лямбды Уилкса, равное 0,12, значение F-критерия, равного 9,00 (при р<0,0166) позволяет сделать вывод, что данная классификация является корректной.
Чувствительность предлагаемой дискрими-нантной модели составляет 80%, специфичность - 100%. Прогностическая значимость положительного результата (наличие лимфогенных метастазов) - 80%. Прогностическая значимость отрицательного результата (отсутствие лимфо-генных метастазов) - 100%. Общая прогностическая значимость - 91,7%.
Для диагностики лимфогенных метастазов у пациентов до 45 лет с ПРЩЖ необходимо опре-
делить уровни CD1a, CD3, CD4, CD25. Затем, используя полученные значения этих показателей, необходимо посчитать дискриминантное уравнение:
у=-20,5868+26,9189 т1+0,7528 т2-0,0915 т3,
где т1 - уровень CD1a/CD3;
т2 - уровень CD4/CD3;
т3 - уровень CD25/CD3.
Если у<0, прогнозируют высокий риск наличия метастазов в регионарных лимфоузлах, если у>0, прогнозируют отсутствие метастазов.
Выводы
1. Морфологическая оценка местного иммунитета в щитовидной железе с имму-ногистохимическим фенотипирова-нием интратиреоидных лимфоцитов имеет несомненное практическое значение для оценки метастатического потенциала папиллярного рака щитовидной железы.
2. При уровне позитивности CD1a, равном 2,215, с чувствительностью 60% и специфичностью 100%, а также при уровне CD1a/ CD3, равном 0,20, с чувствительностью 100% и специфичностью 71,4% можно прогнозировать лимфоген-ные метастазы ПРЩЖ у женщин младше 45 лет.
3. В случае, когда одно из условий не выполняется (экспрессия CD1a и уровень позитивности CD1a/CD3 в ПРЩЖ выше или ниже указанных
пороговых значений), для диагностики лимфо-генных метастазов ПРЩЖ у женщин младше 45 лет можно использовать дискриминантное уравнение:
у=-20,5868+26,9189 т1+0,7528т2-0,0915 т3,
где т1 - уровень CD1a/CD3;
т2 - уровень CD4/CD3;
т3 - уровень CD25/CD3.
Если у<0, прогнозируют высокий риск наличия метастазов в регионарных лимфоузлах, если у>0, прогнозируют отсутствие метастазов. Чувствительность предлагаемой дискриминантной модели составляет 80%, специфичность - 100%.
Литература
1. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 / J. Ferlay [et al.] // Int. J. Cancer. -2010. - Vol. 127, iss. 12. - P. 2893-2917. - doi: 10.1002/ ijc.25516.
2. Cancer statistics, 2009 / A. Jemal [et al.] // CA Cancer J. Clin. - 2009. - Vol. 59, iss. 4. - P. 225-249. - doi: 10.3322/caac.20006.
3. Papillary Thyroid Carcinoma: Factors Influencing Recurrence and Survival / A. Toniato [et al.] // Ann. Surg. Oncol. - 2008. - Vol. 15, iss. 5. - P. 1518-1522. - doi: 10.1245/s10434-008-9859-4.
4. Miccoli, P. Application of Molecular Diagnostics to the Evaluation of the Surgical Approach to Thyroid Cancer /
P. Miccoli // Curr. Genomics. - 2014. - Vol. 15, iss. 3. - P. 184-189. - doi: 10.2174/1389202915999140404101257.
5. Predictive factors for central lymph node metastasis in patients with cN0 papillary thyroid carcinoma: A systematic review and meta-analysis / B. Ma [et al.] // Int. J. Surg. - 2016. - Vol. 28. - Р. 153-161. - doi: 10.1016/j. ijsu.2016.02.093.
6. Liotti, F. Inflammation in thyroid oncogenesis / F. Liotti, C. Visciano, R. M. Melillo // Am. J. Cancer Res. - 2012.
- Vol. 2, iss. 3. - P. 286-297.
7. Леенман, Е. Е. Клеточное микроокружение злокачественных опухолей и его значение в их прогнозе / Е. Е. Леенман, М. С. Мухина // Вопросы онкологии. - 2013.
- Т. 59, № 4. - С. 444-452.
8. Ward, L. S. Immune Response in Thyroid Cancer: Widening the Boundaries / L. S. Ward // Scientifica. - 2014.
- Vol. 2014. - P. 125450. - doi: 10.1155/2014/125450.
9. Lymphocyte and immature dendritic cell infiltrates in differentiated, poorly differentiated, and undifferentiated thyroid carcinoma / C. Ugolini [et al.] // Thyroid. - 2007. -Vol. 17, iss. 5. - P. 389-393. - doi: 10.1089/thy.2006.0306.
10. CD1a-positive dendritic cell density predicts disease-free survival in papillary thyroid carcinoma / O. Hilly [et al.] // Pathol. Res. Pract. - 2015. - Vol. 211, iss. 9. - P. 652-656.
- doi: 10.1016/j.prp.2015.05.009.
References
1. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int. J. Cancer. 2010;127(12):2893-2917. doi: 10.1002/ijc.25516.
2. Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Thun MJ. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 2009;59(4):225-249. doi: 10.3322/caac.20006.
3. Toniato A, Boschin I, Casara D, Mazzarotto R, Rubello D, Pelizzo M. Papillary Thyroid Carcinoma: Factors Influencing Recurrence and Survival. Ann. Surg. Oncol. 2008;15(5):1518-1522. doi: 10.1245/s10434-008-9859-4.
4. Miccoli P. Application of Molecular Diagnostics to the Evaluation of the Surgical Approach to Thyroid Cancer.
Curr. Genomics. 2014;15(3):184-189. doi: 10.2174/1389 202915999140404101257.
5. Ma B, Wang Y, Yang S, Ji Q. Predictive factors for central lymph node metastasis in patients with cN0 papillary thyroid carcinoma: A systematic review and meta-analysis. Int. J. Surg. 2016;28:153-161. doi: 10.1016/j. ijsu.2016.02.093.
6. Liotti F, Visciano C, Melillo RM. Inflammation in thyroid oncogenesis. Am. J. Cancer Res. 2012;2(3):286-297.
7. Leenman EE, Muchina MS. Kletochnoe mikrookruzhenie zlokachestvennyh opuholej i ego znachenie v ih progno-ze [The cellular microenvironment of malignant tumors and its significance in their prognosis]. Voprosy onkologii [Problems in oncology]. 2013;59(4):444-452. (Russian).
8. Ward LS. Immune response in thyroid cancer: widening the boundaries. Scientifica. 2014;2014:125450. doi: 10.1155/2014/125450.
9. Ugolini C, Basolo F, Proietti A, Vitti P, Elisei R, Miccoli P, Toniolo A. Lymphocyte and immature dendritic cell infiltrates in differentiated, poorly differentiated, and undif-ferentiated thyroid carcinoma. Thyroid. 2007;17(5):389-393. doi: 10.1089/thy.2006.0306.
10. Hilly O, Rath-Wolfson L, Koren R, Mizrachi A, Hamzany Y, Bachar G, Shpitzer T. CD1a-positive dendritic cell density predicts disease-free survival in papillary thyroid carcinoma. Pathol. Res. Pract. 2015;211(9):652-656. doi: 10.1016/j.prp.2015.05.009.
IMMUNOHISTOCHEMICAL RISK ASSESSMENT OF THE LYMPHOGENOUS
METASTASIS OF PAPILLARY THYROID CARCINOMA
'Butolina K. M, 'Shtabinskaya T T, 'Basinsky V. A, 'Lyalikov S. A, 2Marshalek A.
1 Educational Institution "Grodno State Medical University", Grodno, Belarus 2Nicolaus Copernicus University, Torun, Poland
Background. Metastatic papillary thyroid carcinoma to the cervical lymph nodes is a risk factor for disease recurrence. Immune cell infiltration in and around the tumor plays an important role in the processes of tumor progression and metastasis.
Objective. To assess the nature of the immune cell infiltration in papillary thyroid cancer with lymphogenous metastases.
Material and methods. An immunohistochemical study was performed on serial paraffin sections using monoclonal antibodies to CD3, CD4, CD1a, CD23, CD25, CD8 and TGF-fi antigens.
Conclusions. It was noted that in a CDla positivity of 2.215 with a sensitivity of 60% and a specificity of 100%, as well as in a CDla /CD3 level of 0.20 with a sensitivity of 100% and a specificity of 71.4%, lymphogenous metastases of papillary thyroid carcinoma can be predicted in women under 45 years of age. In cases when CD1a expression and CD1a / CD3 positivity in papillary thyroid carcinoma are above or below the threshold values, a discriminant equation may be used to diagnose lymphogenous metastases in women under 45 years of age.
Keywords: thyroid cancer, lymphogenous metastases, immunohistochemistry, lymphocyte subpopulations.
Поступила: 02.10.2018 Отрецензирована: 05.11.2018
