CC BY
12
УДК 616.65-002:612.67
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БОЛЕЗНЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ЛИЦ ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА
В.М. Попков1, Г.Н. Маслякова2, Б.И. Блюмберг
ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Росздрава»
На основании обследования 57 больных, находившихся на лечении в НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского, проведена сравнительная оценка секреции молекулярных маркеров при болезнях предстательной железы воспалительной, дис-гормональной и опухолевой природы и определена особенность протекания гистохимических реакций у лиц пожилого возраста.
Ключевые слова: предстательная железа, иммуногистохимичес-кие маркеры, пожилой возраст
Key words: prostate gland, immunohistochemical markers, aged people
По данным официальной статистики, абсолютное число зарегистрированных больных с заболеваниями предстательной железы в Российской Федерации в последние годы прогрессивно возрастало, увеличившись на 56,6%: 717 800 больных в 2002 г. и 1 124 417 человек в 2008 г. [1].
Показатель числа зарегистрированных больных на 100 тыс взрослого мужского населения за эти годы также увеличился с 1408,5 до 2154,1 — на 52,9%. По регионам максимальный показатель распространенности болезней предстательной железы на 100 тыс взрослого мужского населения отмечен в Москве и Санкт-Петербурге [1].
В структуре онкоурологической заболеваемости в 2008 г. доля злокачественных новообра-
1 Попков Владимир Михайлович, канд. мед. наук, ректор Саратовского ГМУ им. В.И. Разумовского. Тел.: 8 (8452) 27-33-70.
2 Маслякова Галина Никифоровна, д-р мед. наук, зав. кафедрой патологической анатомии Саратовского ГМУим. В.И. Разумовского. Тел.: 8 (84520) 66-97-51. E-mail: [email protected].
зований предстательной железы составила 9,7% [2]. Рак предстательной железы занимает 2-е место среди причин смерти от злокачественных новообразований у мужчин [4], чаще встречается у пожилых мужчин. Следовательно, он представляет большую проблему в развитых странах, где процент пожилых мужчин выше, составляя около 15% случаев рака у них, тогда как в развивающихся странах — 4% [5].
Триада патологических процессов в предстательной железе, а именно: хронический простатит, доброкачественная гиперплазия и рак составляют у пожилых мужчин доминирующую группу болезней по сравнению с любыми нозологическими единицами. Эти болезни имеют общий патогенез и сходную клиническую картину, что в значительной степени затрудняет раннюю диагностику онкологического процесса в простате. В связи с этим возникает настоятельная необходимость поиска, разработки и внедрения новых критериев ранней диагностики различных вариантов опухолевого процесса в предстательной железе, что возможно с применением маркеров
молекулярной диагностики и прежде всего имму-ногистохимии. Однако необходимо учитывать особенности иммуногистохимических реакций у мужчин пожилого возраста.
В клинических рекомендациях по онкоуроло-гии, выпущенных Европейской ассоциацией урологов (2010), критерии диагностики на молекулярном уровне отсутствуют, хотя хорошо известно, что в патогенезе опухолей большое место занимает нарушение именно молекулярных механизмов. Причиной этих нарушений может быть воспалительная и дисгормональная патология предстательной железы.
С нашей точки зрения, один из резервов ранней диагностики рака простаты кроется в установлении признаков прогноза развития воспалительного или дисгормонального заболевания простаты по канцерогенному пути.
Цель работы — сравнительная оценка секреции молекулярных маркеров при заболеваниях предстательной железы воспалительной, дисгор-мональной и опухолевой природы и оценка особенностей гистохимических реакций у лиц пожилого возраста.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследованы 57 пациентов, находившихся на лечении в НИИ фундаментальной и клинической уро-нефрологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского. Выделено 3 группы пациентов: 1-я группа — 22 пациента с доброкачественной гиперплазией предстательной железы и определенной при биопсии простатической интраэпителиальной неоплазией высокой степени; 2-я группа — 20 больных раком предстательной железы и 3-я группа — 15 пациентов с доброкачественной гиперплазией и нормальным уровнем общего простатического специфического антигена в сыворотке крови, которым в связи с неудовлетворительным мочеиспусканием была выполнена трансуретральная резекция простаты, а при гистологическом исследовании резецированных фрагментов диагностирована интраэпителиальная неоплазия низкой степени и/или фиброзно-железисто-мышечная гиперплазия с выраженными морфологическими признаками хронического воспаления.
Для диагностики заболеваний предстательной железы, в том числе скрининга рака простаты, использовались: анализ жалоб пациента, исследование общего уровня простатического специфического антигена в сыворотке крови; пальцевое ректальное исследование простаты; трансректальное ультразвуко-
вое исследование простаты и семенных пузырьков с определением остаточной мочи; патоморфологичес-кая верификация заболеваний простаты при помощи полифокальной биопсии простаты под трансректальным ультразвуковым контролем (по показаниям) и операционный материал. Показанием к биопсии простаты были уровень простатического специфического антигена в сыворотке крови свыше 4 нг/мл, подозрение на рак простаты при пальцевом ректальном исследовании или при ультразвуковом сканировании. Биопсия простаты выполнялась из 8—12 точек (в среднем 10 точек) и прицельно из участков паренхимы простаты, подозрительных на рак.
Гистохимические и иммуногистохимические реакции проводили на серийных парафиновых срезах, используя стрептовидин-биотиновый метод.
Для иммуногистохимического исследования были использованы 16 коммерческих моноклональных антител, разделенных на группы по функциональной значимости: маркеры пролиферативной активности (Ki-67, PCNA); регуляторы клеточного цикла (р53 и р63); маркеры апоптоза (bcl-2, ВАХ); рецептор эпидермального фактора роста (EGFR); цитоке-ратин 34РЕ12; маркеры гормональной активности (AR, ER); маркер межклеточного взаимодействия (Е-кадгерин); простатические специфические антигены (PSA, PSMA, AMACR); маркер нейроэндокрин-ных клеток (Chr); маркеры мембранных рецепторов (лектины пшеницы и бобовника).
Обработка материала проводилась на автоматизированной системе анализа морфологических изображений Ariol фирмы Genetix (США). Количественную оценку результатов иммуногистохимической реакции проводили на микрофотографиях, полученных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа, цифровой камеры, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4. Для анализа данных применен пакет программ статистической обработки результатов «Statists 6.0».
Результаты и обсуждение
После статистической обработки материала с помощью методов параметрической и непараметрической статистики мы установили достоверную значимую корреляцию между некоторыми маркерами, характером патологического процесса и возрастом пациентов, что позволяло говорить о возможности использования данных показателей в качестве прогностических и диагностических факторов.
Установлено, что маркеры пролиферативной активности Ki-67 и PCNA наблюдались во всех изучаемых группах, однако количество клеток,
продуцирующих К1-67, было минимальным у больных 3-й группы и увеличивалось в 1-й группе больных; самое высокое значение маркеров отмечено во 2-й группе больных раком простаты. Показатели маркеров увеличивались с повышением количества продуцирующих клеток.
Такая же тенденция наблюдалась и при определении маркера РСМА. В 3-й группе пролифера-тивная активность клеток была втрое ниже, чем в группе больных раком предстательной железы. Именно для данного маркера была установлена статистически значимая корреляция его уровня и возраста больных (г < 0,05) с воспалительными процессами и доброкачественной дисгормональ-ной дисплазией предстательной железы. По мере увеличения возраста больных уровень данного маркера в клетках уменьшался. В группе больных раком предстательной железы статистически значимой достоверности между уровнем маркера и возрастом не наблюдалось.
Из маркеров-регуляторов клеточного цикла р53 и р63 наличие р53 отмечено в 90% случаев рака простаты, в 78% случаев ее доброкачественной гиперплазии, при хроническом простатите — в единичных случаях. Возможно, это связано с тем, что при хроническом воспалении макрофаги и фагоциты образуют большое количество свободных радикалов, которые прямо или опосредованно нарушают структуру и функциональную активность белков, в частности белка р53, а также способствуют мутагенной активности клеток.
По последним литературным данным, маркер р63 продуцируют стволовые клетки базального эпителия, что свидетельствует об их большом потенциале к самообновлению и дифференциров-ке. р63 присутствовал в базальных клетках железы у больных всех трех групп. Однако в группе больных с хроническим простатитом подобные клетки были сохранены, и это свидетельствовало о регенераторной способности железистого эпителия; в группе больных раком количество их было резко снижено.
Из трех простатических специфических маркеров наиболее демонстративен АМАСИ (а-ме-тилацил-СоА-рацемаза), что согласуется с данными других авторов [3]. Наличие АМАСИ в физиологической жидкости организма существенно ограничивает его значение из-за невысокой специфичности, так как этот маркер секретируют злокачественные новообразования другой локализации (например, молочной или поджелудоч-
ной железы). При иммуногистохимическом исследовании он высоко специфичен при раке предстательной железы. Однако у пациентов пожилого возраста отмечалось снижение его секреции с увеличением возраста. Несомненно, это обстоятельство необходимо учитывать при гистологическом исследовании.
Простатический специфический мембранный антиген (PSMA) — интегральный мембранный белок с ферментативной активностью. В нашем материале отмечалась его активная мембранная секреция при раке простаты. При доброкачественной гиперплазии железы преобладала слабая цитоплазматическая продукция, причем отмечен феномен перемещения высвобождения маркера из цитоплазмы к мембране клетки, что может служить признаком начальной стадии канцерогенеза. Отмечена выраженная корреляция уровня маркера и возраста пациента: с увеличением возраста уровень снижался.
Уровень простат-специфического антигена в ткани нормальной простаты в миллион раз превышает его показатели в сыворотке крови. В нашем материале с помощью иммуногистохимичес-кого метода антиген определялся во всех структурах как нормальной, так и гиперпластической и неопластической простаты. Интенсивность гистохимической реакции не коррелировала с концентрацией антигена в периферической крови. Кроме того, количество его при раке простаты уменьшалось независимо от возраста.
Считают, что простат-специфический антиген является андрогензависимым маркером. В нашем материале мы также наблюдали корреляцию между снижением его уровня и количеством ан-дрогенов. Что касается эстрогенов, то мы не установили закономерности между их количеством и характером болезни.
Установлено, что на нейроэндокринных клетках отсутствуют рецепторы к андрогену, а уменьшение количества андрогена, в том числе и анд-рогенная блокада, может привести к преимущественному росту этих клеток. Нейроэндокринные клетки сами по себе обладают низкой способностью к пролиферации и осуществляют свой эффект через секрецию нейропептидов. Есть предположение, что нейроэндокринные клетки влияют на развитие андрогеннезависимых опухолей простаты через паракринный эффект ростовых факторов. Наши исследования показали, что количество нейроэндокринных клеток в изучаемых
группах статистически недостоверно отличалось друг от друга. Однако установлено наличие корреляции между выраженным количеством хро-могранина у больных раком простаты после максимальной андрогенной блокады. Мы считаем, что увеличение количества нейроэндокринных клеток в биопсийном материале может служить признаком андрогенрефрактерного рака предстательной железы.
Известно, что в нормальной ткани предстательной железы скорость апоптотической клеточной гибели составляет 1—2% в день. Этот процесс уравновешивается пролиферацией клеток. При исследовании маркеров апоптоза в изучаемых группах отмечено их закономерное поведение в опухоли: увеличивалась секреция маркера блокатора апоптоза Ьс1-2 и уменьшалась — активатора ВАХ, что свидетельствует о закономерном сдвиге канцерогенеза в сторону пролифератив-ных процессов.
Эпителиальный кадгерин (Е-кадгерин) является кальцийзависимой молекулой адгезии, связывающей клетки путем гомотипического взаимодействия. Подавление или утрата его функции ассоциированы с инвазивным и агрессивным поведением различных типов опухолей человека. При сравнительном анализе содержания данного белка в исследуемых группах установлено его значительное уменьшение при раке простаты. Ни в одном из случаев мы не зарегистрировали отсутствие данного белка, что свидетельствовало бы о плохом прогнозе заболевания и возможности скорых метастазов.
С высокой степенью корреляции наблюдалась секреция цитокератина-34рЕ12, который интенсивно окрашивался в ткани предстательной железы при неопухолевых процессах и снижался при раке простаты.
В литературе мы не встретили данных об использовании в качестве маркеров диагностики рака простаты лектинов, которые в нашем исследовании показали высокую специфичность и чувствительность. Существует определенная аналогия между методами лектингистохимии и им-муногистохимии. Но, в отличие от антител, лек-тины взаимодействуют только с углеводными детерминантами биополимеров и имеют гораздо меньшую стоимость.
Набор углеводов раковых клеток резко отличается от такового нормальных клеток и может служить маркером опухоли. В своем исследова-
нии мы использовали 5 различных лектинов, но только с помощью 2 из них — WCA (лектин зародыша пшеницы) и LBA (лектин бобовника) — результаты оказались значимыми. Секреция углеводных детерминант, взаимодействующих с лектинами, при раке простаты была существенно выше, чем при других заболеваниях, и не зависела от возраста пациентов.
ВЫВОДЫ
1. При статистическом анализе корреляция высокой степени значимости между группами больных с простатитом, доброкачественной гиперплазией предстательной железы и раком простаты отмечалась в секреции маркеров AMACR, Ki-67, p53, p63, цитокератина-34, лектина зародышей пшеницы и bcl-2. Корреляция умеренной степени отмечалась в содержании маркеров лек-тина бобовника, Е-кадгерина и ВАХ.
2. При иммуногистохимическом исследовании необходимо учитывать, что интенсивность продукции маркеров опухолевого роста у лиц пожилого возраста снижается. Статистически достоверные показатели зависимости их количества от возраста установлены для маркеров PSNA, PSMA, AMACR и хромогранина, что обусловлено, по всей видимости, снижением активности метаболических процессов и изменением гормонального фона.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аполихин О.И., Сивков А.В., Бешлиев Д.А. и соавт. Анализ уронефрологической заболеваемости в Российской Федерации по данным официальной статистики // Экспериментальная и клиническая урология. 2010. № 1. С. 4-10.
2. Злокачественные новообразования в России в 2008 г. (заболеваемость и смертность). Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, 2010. 256 с.
3. Пожарийский К.М., Леенман Е.Е., Арзуманов А.А. Успехи морфологической диагностики рака предстательной железы: а-метилацил-коэнзим А-рацемаза — новый маркер злокачественной трансформации клеток // Архив патологии. 2005. № 5. С. 15-19.
4. Jemal A., Siegel R., Ward E., Hao Y., Xu J., Murray T., Thun M.J. Cancer statistics, 2008 // C A Cancer J. Clin. 2008. № 58 (2). Р. 71-96.
5. Parkin D.M., Bray F.I., Devesa S.S. Cancer burden in the year 2000: the global picture // Europ. J. Cancer. 2001. № 37 (8). Р. 4-66.
Поступила 18.11.2010
