CC BY
70
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.127-005.8-036.11-078.33
Л.М. Чобану1, С.И. Сырбу1, И.М. Попович1, В.М. Иванова1, В.С. Гудумак2, М.И. Попович1
иммуноферментный метод выявления са2+ атфазы САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА - нового БИОЛОГИЧЕСКОГО МАРКЕРА ОСТРОГО ИнФАРКТА МИОКАРДА
1Институт кардиологии; 2Государственный университет медицины и фармации им. Н.А. Тестемицану Республики Молдова, Кишинев
Разработана иммуноферментная тест-система для определения уровня Са2+-АТФазы саркоплазматического ретику-лума (СР) с использованием моноклональных антител IgM и IgG к Са2+-АТФазе. Клиническую апробацию метода проводили у 19 больных с острым инфарктом миокарда Q, подтвержденным повышением содержания общепринятых маркеров некроза миокарда (тропонин Т и КФК-МВ). Установлено повышение уровня Са2+-АТФазы СР у всех больных: его выявляют примерно через 4-6 ч после дебюта, исчезает через 144 ч (6 дней). В то же время Са2+-АТФаза не выявлена у 10 больных с острыми травматическими повреждениями скелетной мускулатуры, у 10 с хронической почечной недостаточностью, находившихся на гемодиализе, а также у 20 с острым коронарным синдромом без подъема сегмента ST на ЭКГ, что указывает на достаточно высокую специфичность и чувствительность разработанного метода определения в крови уровня Са2+-АТФазы СР - биологического маркера некроза миокарда.
Ключевые слова: СА2+-АТФаза саркоплазматического ретикулума, острый инфаркт миокарда, биомаркеры L.M. Tchobanu, S.I. Syrbu, I.M. Popovitch, V.M. Ivanova, V.S. Gudumak, M.I. Popovitch
THE IMMUNE-ENZYME TECHNIQUE OF DETECTION OF CA2+ ATPASE OF SARCOPLASMIC RETICULUM -A NEW BIOLOGIC MARKER OF ACUTE CARDIAC INFARCTION
The immune-enzyme system of testing was developed to detect the level of Ca2+ATPase ofsarcoplasmic reticulum using monoclonal IgM andIgG antibodies to Ca2+ATPase. The clinical approbation of the technique was carried out using the .sample of 19 patients with acute cardiac infarction Q validated by the increase of content of such common markers of myocardium necrosis as troponin T and creatine phosphokinase MB. The increase of the level of Ca2+ ATPase of sarcoplasmic reticulum was detected in all patients. This occurrence is detected approximately in 4-6 hours after debut and it disappears in 144 hours (6 days). At the same time, Ca2+ATPase was not detected in10 Patients with acute traumatic damages of skeleton musculature, in 10 patients with chronic renal failure under hemodialysis and in 20 patients with acute coronary syndrome without rise of ST-segment of cardiogram. These facts testify rather high specificity and sensitivity of the developed technique of detection of the level of Ca2+ ATPase of sarcoplasmic reticulum in blood as biological marker of myocardium necrosis.
Key words: Ca2+ ATPase of sarcoplasmic reticulum, acute cardiac infarction, biomarker
Диагностика острого инфаркта миокарда (ОИМ) до настоящего времени продолжает оставаться сложной проблемой современной кардиологии. Научно-технический прогресс и разработка новых усовершенствованных лабораторных тестов привели к изменению критериев диагностики ОИМ. Так, в 2000 г. Европейское общество кардиологов совместно с Американским опубликовали новый гид по диагностике и лечению ОИМ, в котором исследование кардиоспецифических биомаркеров считается обязательным для постановки диагноза ОИМ, при этом тестом выбора для суждения о наличии некроза миокарда является определение уровня тропо-нина и креатинфосфокиназы фракции МВ (КФК-МВ) [9]. В то же время следует отметить, что идеальных маркеров, свидетельствующих о некрозе миокарда, нет, поскольку даже самый чувствительный и широко применяемый в клинической практике биомаркер тропонин (он считается золотым стандартом), способный выявить микронекрозы миокарда, зачастую дает ложноположи-тельные результаты при целом ряде экстракардиальных поражений, таких как геморрагическая язва, травматические поражения мягких тканей, рабдомиолиз, тромбоз легочной артерии и др.
Для корреспонденции:
Гудумак Валентин Семионович, зав. каф. клин. лаб. диагностики Адрес: Молдова, Кишинэу, МД 2004, б-р Штефан чел Маре, 165 Телефон: 00-373-22-205-136 E-mail: vgudumac@yahoo.com
Поэтому поиск новых биомаркеров, а также разработка методов их определения, которые позволяли бы с высокой достоверностью выявлять некроз кардио-миоцитов, дифференцировать необратимые изменения от обратимых и проводить диагностику ОИМ, являются актуальной задачей кардиологии. В качестве такого маркера мог бы быть кальций-аденозинтрифосфатаза (Са2+-АТФаза) саркоплазматического ретикулума (СР), фермент, который выполняет важную роль в физиологии и патологии сердечной мышцы [2, 3, 5, 8]. По нашим сведениям, в литературе отсутствуют данные об определении уровня этого фермента в крови больных.
Цель данного исследования - разработка иммуно-ферментного теста для определения содержания Са2+-АТФазы СР в сыворотке крови в норме и при поражении миокарда.
Материалы и методы В работе использовали конъюгаты антител (АТ) к Са2+-АТФазе СР, меченные пероксидазой хрена (ПХ). Высокоочищенный препарат Са2+-АТФазы СР и моно-клональные АТ (МКАТ) к Са2+-АТФазе двух типов -МКАТ/^М и МКАТ/^О - получены нами ранее [1, 3, 6, 7]. Стабильные клоны перевели в асцитную форму для наработки и последующей очистки МКАТ методом ВЭЖХ (для ^О) или гельфильтрации (для ^М).
Разработка иммуноферментной тест-системы для определения содержания Са2+-АТФазы СР. Использо-
—♦— 1дС-1дМс —•— 1дС-1дСс —А— 1дМ-1дСс —■— 1дМ-1дМс
Рис. 1. Зависимость ОП от степени разведения антигена Са2+-АТФазы СР (маркер) для различных вариантов МКАТ стрип - конъюгант.
Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс - степень разведения маркера. Здесь и на рис. 2, 3: по оси ординат - ОП.
вали иммунометрический («сандвич») одностадийный вариант иммуноферментного анализа (ИФА). Его проводили на 96-луночных планшетах «Ткейек".
Разработка иммунометрического ИФА невозможна без МКАТ, специфичных к пространственно удаленным антигенным детерминантам (эпитопам), когда одни из этих МКАТ иммобилизованы на твердой фазе (лунки планшета), а вторые используют в виде конъюгата с пе-роксидазой, поэтому мы использовали два типа МКАТ к белку Са2+-АТФазы, принадлежащих к разным классам иммуноглобулинов. На первом этапе исследования нужно было определить, какая из комбинаций этих антител обладает максимальной чувствительностью при опреде-лениии уровня Са2+-АТФазы СР.
С этой целью приготовили два конъюгата МКАТ к белку Са2+-АТФазы СР с ПХ: один с МКАТ из класса ^О, другой из класса ^М. Синтез конъюгата МКАТ/ ^М, а также МКАТ/^О к белку Са2+-АТФазы СР с ПХ выполняли по стандартной процедуре [4]. Также приготовили два планшета с иммобилизованными МКАТ из двух классов иммуноглобулинов: ^О и ^М.
Изучали минимальную концентрацию Са2+-АТРазы СР, которую можно выявить, используя различные комбинации разных пар МКАТ:
1) планшет с МКАТ/^О - конъюгат МКАТ/^М-ПХ;
2) планшет с МКАТ/^О - конъюгат МКАТ/^О-ПХ;
3) планшет с МКАТ/^М - конъюгат МКАТ/^О-ПХ;
4) планшет с МКАТ/^М - конъюгат МКАТ/^М-ПХ.
Для всех комбинаций МКАТ построили калибровочные кривые. Полученные результаты приведены ниже (рис. 1).
Как видно из представленных данных, только при использовании комбинации МКАТ/^М - конъюгат МКАТ/^О-ПХ интенсивность связывания очень высо-
ка (значение оптического поглощения (ОП) около 3). При всех остальных возможных комбинациях (МКАТ/ ^О - конъюгат МКАТ /^О- ПХ, МКАТ/^О - конъюгат МКАТ/^М- ПХ, МКАТ/^М - конъюгат МКАТ/^М-ПХ) МКАТ конкурируют с антигеном Са2+-АТФазой СР за центры связывания (значение ОП более низкое).
Исходя из этих результатов, при разработке набора для иммобилизации на фазе избрали МКАТ/^М, а в качестве АТ, конъюгированных с пероксидазой, выбор пал на МКАТ/^О. Именно эта комбинация дает наилучшие результаты для диапазона максимальных концентраций Са2+-АТФазы СР и показывает наибольшую чувствительность, поэтому для дальнейшего исследования избрали вышеизложенную комбинацию: на ячейках планшеты абсорбируются МКАТ класса ^М, а АТ ^О-ПХ использовали в качестве конъюгата.
Оптимальные условия ИФА подбирали в серии экспериментов. Определяли необходимую концентрацию и объем наносимых на планшеты АТ, а также состав и рН буфера для их разведения, оптимальные соотношения объемов калибровочных проб, содержащих антиген Са2+-АТФазу СР, и рабочих разведений, конъюгированных с пероксидазой МКАТ/^О.
Зависимость ОП от степени разведения маркера -антигена Са2+-АТФазы СР миокарда для различных концентраций МКАТ/^М на стенке ячеек планшета приведена на рис. 2.
По результатам анализа калибровочных кривых выбрали следующие параметры: использующиеся для иммобилизации МКАТ/^М разводят фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР) рН 7,4 до концентрации 25 мкг/мл. Объем реагентов 100 мкл, время проведения иммунологической стадии ИФА 2 ч. При этих условиях минимальная определяемая концентрация антигена Са2+-АТФазы СР при использовании МКАТ/^О, конъюгированных с пероксидазой, составила 0,015-0,025 мкг/мл.
На следующем этапе опытным путем установили, что разведение конъюгата МКАТ/^О-ПХ 1:40 оптимально для получения приемлемого фона диапазона единиц ОП 0,04-0,047.
Ход выполнения исследования и основные этапы приготовления тест-системы для определения уровня Са2+-АТФазы СР. Сначала готовят раствор МКАТ/ ^М (25 мкг/мл) на ФСБР рН 7,4, затем переносят по 100 мкл этого раствора в каждую ячейку чистого 96-ячеечного планшета. Инкубируют 24 ч при температуре 4оС. Промывают планшет от избытка несвязав-шихся АТ, используя промывочный ФСБР с 0,05% твином-20, причем повторяют эту процедуру 5 раз. Затем в каждую ячейку вносят по 150 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) на ФСБР и инкубируют 60 мин при 37оС. Избыток 1% раствора БСА удаляют. Приготовленные таким образом планшеты после высушивания готовы для работы.
В состав тест-системы для определения уровня Са2+-АТФазы СР входят:
1) планшеты, сенсибилизированные МКАТ/^М к Са2+-АТФазе СР;
2) препарат Са2+-АТФазы СР из миокарда собаки (160 мкг/мл);
3) конъюгат МКАТ/^О-ПХ;
4) концентрат 10-кратного промывочного ФСБР с
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 О
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 О
100 мкг/мл 50 мкг/мл 25 мкг/мл
640 ' 1280 ' 2560 ' 5012 ' 10024 ' 20048
6,25 мкг/мл 3,125 мкг/мл 1,5625 мкг/мл
640 ' 1280 ' 2560 ' 5012 ' 10024 ' 20048 '
Рис. 2. Зависимость ОП от степени разведения антигена Са2+-АТФазы СР для различных концентраций MKAT/IgM. Здесь и на рис. 3: длина волны 450 нм.
0,05% твином-20; перед употреблением его разводят дистиллированной водой в 10 раз;
5) субстратиндикаторная смесь, содержащая Н2О2 и 3,3', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ);
6) стоп-реагент (1 М HCl).
В лунки 96-ячеечного полистиролового планшета с иммобилизованными MKAT/IgM к Са2+-АТФазе СР вносили по 50 мкл ФСБР без твина и по 50 мкл калибровочных проб или образцов сывороток, инкубировали 2 ч при 37°С , затем троекратно отмывали ФСБР с твином. На следующем этапе в лунки полистиролового планше-
0,25 0,125 0,062 0,031 0,015
Рис. 3. Калибровочная кривая для определения содержания (в мкг/мл) Са -АТФазы СР в сыворотке крови.
та вносили по 100 мкл конъюгата МКАТ/^О-ПХ в рабочем разведении (иммунологическая реакция). Инкубировали 30 мин при 37°С. После троекратного отмывания ФСБР с твином проводили ферментативную реакцию в течение 15 мин при 37°С. Субстратиндикаторная реакционная смесь (200 мкл) включала 5 мМ раствора ТМБ в диметилсульфоксиде и цитратный буфер, содержащий 3 мМ перекиси водорода, в соотношении 1:5. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М раствора НС1. Измеряли ОП на иммуноферментном ридере фирмы "Тесап" (Австрия) при длине волны 450 нм.
Для построения калибровочной кривой использовали рабочие разведения в диапазоне 0-0,5 мкг/мл Са2+-АТФазы СР (рис. 3).
Как следует из рис. 3, предел чувствительности определения уровня Са2+-АТФазы СР составляет 0,015 мкг/мл.
Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью компьютерной программы Statgraph.
Результаты и обсуждение
Разработанный метод ИФА определения содержания Са2+-АТФазы СР в сыворотке крови был апробирован на 19 больных с ОИМ Q, подтвержденным повышением в крови уровня кардиоспецифических маркеров некроза миокарда - тропонина Т и КФК-МВ, изменением показателей на ЭКГ и типичной клинической картиной. Определение уровня тропонина Т и КФК-МВ, а также исследование содержания Са2+-АТФазы СР проводили в динамике: при поступлении в клинику, через 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120, 144 ч после начала болевого приступа. Полученные результаты представлены в таблице.
Как видно из представленных данных, повышение уровня Са2+-АТФазы СР выявили у всех больных, вошедших в исследование: его отмечают примерно через 4-6 ч после дебюта, исчезает через 144 ч (6 дней). Параллельно у тех же больных определяли содержание общепринятых маркеров некроза кардиомиоцитов - КФК-МВ и тропонина Т (качественный тест). У всех 19 больных отметили положительную корреляцию
содержание в динамике са2+-АТФазы ср в сыворотке крови у 19 больных с оим Q и корреляция этого показателя с активностью кфк-мв
Группа больных n Время исследования от начала приступов, ч Са2+-АТФаза, мкг/мл (X ± m) КФК-MB, МЕ/л (X ± m) Показатель корреляции
ОИМ Q 19 6 0,029±0,001 87,7±6,3 0,41*
12 0,133±0,037 101,1±11,6 0,56*
24 0,127±0,023 51,9±4,5 0,61**
36 0,133±0,019 76,6±8,4 0,54**
48 0,069±0,021 70,2±9,8 0,62**
60 0,085±0,017 66,6±5,1 0,46*
72 0,146±0,077 46,9±4,4 0,51**
96 0,065±0,014 40,6±3,8 0,63**
120 0,036±0,021 41,1±3,3 0,61**
144 0,015±0,005 24,9±3,5 0,54*
Примечание. * - p > 0,05; ** - p < 0,05.
между повышением активности КФК-МВ и уровнем Са2+-АТФазы СР.
Контрольная группа включала 10 практически здоровых лиц в возрасте от 25 до 40 лет с нормальными биохимическими показателями крови. Концентрация Са2+-АТФазы СР не превышала у них 0,015 мкг/мл.
Для того чтобы проверить специфичность разработанного теста, одновременно определяли содержание КФК-МВ и тропонина Т у 10 пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), находившихся на гемодиализе, а также у 10 с острыми травматическими повреждениями скелетной мускулатуры. Получили следующие результаты: у 1 больного с ХПН показатели Са2+-АТФазы СР были в пределах нормы, у 6 выявили повышенный уровень КФК-МВ, у 2 - положительный тест на тропонин Т. Из 10 больных с острыми травматическими повреждениями скелетной мускулатуры повышенный уровень КФК-МВ был у 8, а тест на тро-понин Т оказался положительным у 1.
Изучили также содержание Са2+-АТФазы СР в сыворотке крови у 20 больных с острым коронарным синдромом без подъема сегмента ST, концентрация Са2+-АТФазы СР у них была на том же уровне, как и у здоровых лиц.
Выводы. В результате проведенного исследования разработан новый метод ИФА для определения в крови уровня Са2+-АТФазы СР. Данный тест может быть использован в качестве биологического маркера для диагностики ОИМ. Дальнейшие клинические исследования позволят выявить степень специфичности этого теста для диагностики ОИМ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Левицкий Д. О., Сырбу С.И., Черепахин В.В., Рохлин С.В., Попович М.И. Моноклональные антитела к мембранам саркоплазматическо-го ретикулума, ингибирующие транспорт кальция и Са++-АТФазную активность. Биологические мембраны. Москва, 1986; 3(2): 101-6.
2. Сырбу С.И., Левицкий Д.О., Черепахин В.В., Попович М.И., Рохман О.В. Механизм ингибирования Са2+транспортирующей и АТФ-гидролитической активности саркоплазматического ре-тикулума моноклональными антителами к Са2+-АТФазе сердца собаки. В кн.: Актуальные вопросы кардиологии: Сборник науч. трудов. Кишинев; 1989: 149-63.
3. Сырбу С.И., Мачука О.И., Попович М.И., Гудумак В.С. Функциональное состояние и содержание Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума сердца при ишемии. В кн.: Материалы научной конференции Гос. мед. ун-та им. Н. Тестемицану Респ. Молдова (12-15 мая 1992 г.). Кишинев; 1992: 39.
4. Donacki N. Peroxidase conjugation by periodate method. May 14 2002. http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/Peroxidase-Conjugation-by-Periodate-Method-440.html
5. Garcia-Dorado D., Piper H.M., Eisner D.A. Sarcoplasmic reticulum and mitochondria in cardiac pathophysiology. Cardiovasc. Res. 2008; 77(2): 231-3.
6. Levitsky D.O., Syrbu S.I., Cherepakhin V.V., Rokhlin O.W. Monoclonal antibodies to dog heart sarcoplasmic reticulum. Antibodies that inhibit Ca-pump systems of cardiac and skeletal muscles. Eur. J. Bi-ochem. 1987; 164: 477-84.
7. Levitsky D.O., Syrbu S.I., Cherepakhin V.V., Rokhlin O.W. Monoclonal antibodies to dog heart sarcoplasmic reticulum. Application of the mAbs for study's structure and function of Ca-ATPase. Biomed. Biochem. Acta. 1987; 8: 382-7.
8. PeriasamyM., Bhupathy P., Babu G.J. Regulation of sarcoplasmic reti-culum Ca2+-ATPase pump expression and its relevance to cardiac muscle physiology and pathology. Cardiovasc. Res. 2008; 77 (2): 265-73.
9. The Joint European Society of Cardiology/American College of Cardiology Committee. Myocardial infarction redefined - A consensus document of the Joint European Society of Cardiology/American College of Cardiology Committee for the Redefinition of Myocardial Infarction. Eur. Heart J. 2000; 21:1502-13.
Поступила 03.09.12
микробиология
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 615.45.03:616.932-078.33
B. B. Агафонова, К P. Телесманич, Ю. м. Ломов, А. П. Кочеткова, А. Н. Наркевич, м. В. Полеева
использование стандартных методических подходов для определения эпидемической значимости холерных вибрионов
ФКУз Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Проводили испытания нового диагностического антилипазного препарата и бактериологического метода выявления гемолитических штаммов холерных вибрионов с целью внедрения в лабораторную практику и стандартизации подходов к определению эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов.
Ключевые слова: холерные вибрионы, современные технологии определения, эпидемическая значимость
V.V. Agafonova, N.R. Telesmanitch, Yu.M. Lomov, A.P. Kotchetkova, A.N. Narkevitch, M.V. Poleyeva
THE APPLICATION OF STANDARD APPROACHES TO DETERMINE EPIDEMIC VALUE OF CHOLERA VIBRIO
The article deals with the results of testing of new diagnostic anti-lipase preparation and bacterial technique of detection of
hemolytic strains of cholera vibrio with purpose to implement them in the laboratory practice and standardization of detection of
epidemically dangerous strains of cholera vibrio.
Key words: cholera vibrio, modern techniques of detection, epidemic value
