CC BY
23144
Птицеводство
www.agroyug.ru
DOI: 10.24411/9999-007А-2020-10024 УДК: 619:578. 831.3
Никитина Н. В., кандидат биологических наук,
ведущий научный сотрудник отдела вирусологии vnivip.nikitina@yandex.ru Дмитриев К. Ю., младший научный сотрудник отдела вирусологии Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства -
филиал ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» РАН vnivip.dmitriev-18@yandex.ru
ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА УТЯТ ТИПА-1
Аннотация. Представлены экспериментальные данные по разработке иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител в сыворотке крови к вирусу гепатита утят типа 1. Показано, что иммуноферментная тест-система обладает высокой чувствительностью, специфичностью и может найти широкое применение в процессе ретроспективной диагностики и определения уровня поствакцинального иммунитета при вирусном гепатите утят типа I.
Ключевые слова. иммуноферментный анализ, вирус гепатита утят типа I, антиген, сыворотка крови, специфические антитела.
Annotation. Experimental data on the development of an enzyme-linked immunosorbent assay system for the quantitative determination of antibodies in the blood serum to ducklings hepatitis virus type 1 are presented. It is shown that the enzyme-linked immunosorbent assay system has high sensitivity, specificity and can be widely used in the process of retrospective diagnosis and determination of post-vaccination immunity in viral hepatitis ducklings type I.
Key words: enzyme linked immunosorbent assay, ducklings hepatitis virus type I, antigen, blood serum, specific antibodies.
Вирусный гепатит утят типа I (ВГУ- I) является высоко контагиозной, протекающей сверхостро у утят и латентно у взрослой птицы, болезнью с преимущественным поражением печени и высокой смертностью молодняка (9095%) [1,2], что приводит к значительным экономическим потерям в утководстве [2,3].
Первостепенным этапом в борьбе с инфекцией в племенных стадах уток является своевременная и правильная диагностика болезни [4].
В нашей стране среди серологических методов для определения уровня антител в пробах сыворотки крови уток широко используют реакцию нейтрализации.
За рубежом для контроля иммунного ответа многие исследователи успешно используют твердофазный метод ИФА [5,6], обладающий специфичностью, высокой чувствительностью, скоростью проведения анализа перед другими аналитическими методами [7].
ЭФФЕКТИВНОЕ № 4 июнь ЖИВОТНОВОДСТВО 2020
Серологические исследования сыворотки крови утят/уток методом ИФА позволяют делать предварительные прогнозы об инфицированности стада, скорректировать сроки вакцинации, тем самым позволяют более рационально и надежно организовывать работу по профилактике и оздоровлению хозяйств от вирусного гепатита утят типа I.
Из-за отсутствия аналогичных тестов в нашей стране разработка отечественной иммунофермент-ной тест-системы по определению антител к ВГУ-1 имеет первостепенное значение.
Целью нашей работы явилась разработка имму-ноферментной тест-системы для количественного определения антител к вирусу гепатита утят типа 1.
Вирус гепатита утят типа I штамма «ВН-3» культивировали на развивающихся 11-12 - суточных утиных эмбрионах. Вируссодержащую хориоаллан-тоисную жидкость, собранную от павших эмбрионов с характерными изменениями для вируса гепатита утят, однократно замораживали, оттаивали и осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут, затем концентрировали методом дифференциального центрифугирования при 60000 g в течение 1,5 часов. Вирус очищали гель-фильтрацией на колонке с макропористым стеклом (МПС) марки 1000 ВГХ в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,3-7,5.
Разработанная на основе высоко очищенного вируса гепатита тест-система основана на использовании принципа непрямого твердофазного ИФА, в ходе которого происходит выявление в сыворотке крови утят/уток специфических антител за счет их связывания с иммобилизованным в лунках полистиролового планшета антигена вируса гепатита утят типа 1. Очищенный вирус гепатита утят сорбировали в лунках планшета «Maxisorp» (Nunc), в концентрации 6 мкг/мл в течение 18-20 часов при (4-8) оС в 0,01 М фосфатно-солевом буфере, рН 7,3-7,5. Эффективным путем подавления неспецифического взаимодействия с носителем является использование промывочного буфера 0,01 М ФСБ рН 7,3-7,5, содержащего 0,5 М NaCl c 0,1% конечной концентрацией детергента твина-20. Отрицательным контролем служила нормальная сыворотка крови клинически здоровых утятах, не имеющих антител к возбудителям вирусных болезней. Высокоактивную специфическую сыворотку получали путем трехкратной иммунизации утят нарастающими дозами очищенного вируса гепатита.
Контроли и исследуемые образцы сыворотки крови утят/уток, разведенные 1:400 в фосфатно-со-левом буфере, содержащем 0,5 М NaCl c 0,1% конечной концентрацией детергента твина-20, инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. После 3-кратной отмывки тем же буфером в лунках инкубировали конъюгат (антитела к IgG уток, меченные перокси-дазой хрена), в течение 30 мин при 37 °С. Специфический комплекс «антиген-антитело» выявляли антивидовыми IgG, ковалентно связанными с ферментом - пероксидазой хрена, который при взаимодействии с субстратом (Н2О2) в составе хромоген-ной смеси (ОФД) вызывал ее окрашивание.
Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе. После остановки реакции 10% раствором серной кислоты, производили учет реакции на иммуноферментном анализаторе при длине волны 492 нм.
Инструментальный спектрофотометрический способ учета результатов может быть использован как при постановке ИФА в одном разведении, так и при раститровке сыворотки крови. Он позволяет количественно оценить титры специфических антител в исследуемых пробах путем измерения значений оптической плотности при длине волны 492 нм. Уравнение линейной регрессии 1д Т = 1,36089 1д ^/Р) + 3,53062, связывает S/P-отношение при разведении 1:400 с конечным титром.
При постановке ИФА методом титрования конечным разведением исследуемой сыворотки считается последнее ее разведение, в котором ОП492 превышает ОП492 отрицательного контроля в 2,0-2,1 раза.
Оценку чувствительности и специфичности им-муноферментной тест-системы проводили в сравнении с реакцией нейтрализацией (РН) [8]. При сравнительной оценке титров антител в ИФА и РН установлена высокая корреляция (г= -1,0) их значений. С отрицательными и гетерологичными сыворотками крови результаты в обоих тестах были отрицательными (Р <0,05), что согласуется с данными зарубежных исследователей [6,9].
Апробация разработанной иммуноферментной тест-системы свидетельствует о ее воспроизводимости, высокой чувствительности и специфичности и можно полагать, что данная тест-система найдет широкое применение в процессе ретроспективной диагностики и определения уровня поствакцинального иммунитета при вирусном гепатите утят типа I.
Статья написана по госзаданию, № 0599-2019-0024.
ЛИТЕРАТУРА
1. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Дмитриев К.Ю., Трубицын М.М. Вирусный гепатит утят типа I (эпизоотология, патогенез и диагностика) // Жур. Эффективное животноводство. - 2017. - № 3. - С. 12-13.
2. Lin S. L. Circulation and in vivo distribution of duck hepatitis A virus types 1 and 3 in infected ducklings / S. L. Lin, R. C. Cong, R. H. Zhang [et al.] // Archives of Virology. - 2016. -V. 161. - P. 405-416.
3. Soliman M. The prevalence of duck hepatitis A virus types 1 and 3 on Korean duck farms. /M. Soliman, M.M. Alfajaro, M.-H. Lee [et al.] // Arch Virol. - 2015. - V. 160.
- P. 493-498.
4. Woolcock P.R. and H.J. Tsai. Duck hepatitis. In: Diseases of Poultry/ D.E. Swayne, J.R. Glisson, L.R. Mc Douglad [et al.] eds Tohn Wiley & Sons// 2013. - P. 422-431.
5. Бондаренко В. Иммуноферментный метод диагностики вирусного гепатита утят / В. Бондаренко // Вет. мед. Украины. - 1998. - № 6. - С. 38-39.
6. Liu M. Development and evaluation of a VP1-ELISA for detection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus 3 / M. Liu, T. Zhang, Y. Zhang [et al.] // Journal of Virological Methods. - 2010. - V. 169. - P. 66-69.
7. Верховский О.А. Иммуноферментные тест-системы для оценки иммунологического статуса птиц / О.А. Верховский, Т.А. Тимофеева, С.Л. Кальнов // Био. -2004. - № 5. - С. 31.
8. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Дмитриев К.Ю. Чувствительность и специфичность ИФА при выявлении антител к вирусу гепатита утят типа I/ Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. -СПб, 2018. - № 1. - С. 30-34.
9. Shen Y. Development of an indirect ELISA method based on the VP3 protein of duck hepatitis A virus type 1 (DHAV-1) for dual detection of DHAV-1 and DHAV-3 antibodies / Y. Shen, A. Cheng, M. Wang [et al.] // Journal of Virological Methods. - 2015. - V. 225. - P. 30-34.
