CC BY
94
УДК 615.37:612.017.1:57.08
Ж.И. Авдеева, Н.А. Алпатова, С.Е. Акользина, Н.В. Медуницын
Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (119002 г. Москва, пер. Сивцев Вражек, 41)
ИММУНОАДЪЮВАНТНЫЙ ЭФФЕКТ ЦИТОКИНОВ
Ключевые слова: цитокины, адъюванты, вакцины, иммунный ответ.
Изучение адъювантных свойств цитокинов на экспериментальных моделях свидетельствует о стимуляции иммуно-генной активности вакцины против бешенства. Наиболее выраженный эффект наблюдался при использовании вместе с вакциной комплекса рекомбинантных цитокинов. При этом развитие иммунного ответа сопровождалось формированием высокого уровня вируснейтрализующих антител. Иммуноадъювантный эффект отмечен и при использовании рекомбинантных интерлейкина-1р и фактора некроза опухоли-а в виде монопрепаратов, а также препарата «Полиоксидоний». Результаты исследований свидетельствуют о возможности использования цитокинов и других иммуномодулирующих препаратов в качестве адъювантов, способных повышать иммуногенную активность вакцин, а также о перспективности изучения новых подходов к управлению иммунным ответом.
Цитокины — низкомолекулярные гликопротеины, секретируемые преимущественно активированными клетками иммунной системы, обладают широким спектром биологического действия. Основные классы цитокинов включают интерлейкины (ИЛ), интер-фероны а, в и у, колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухолей (ФНО) а и в, семейство ростовых факторов и хемокины [3, 8].
Цитокины определяют особенности формирования иммунного ответа, способствуя распознаванию антигенов, повышая экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости, молекул адгезии, вызывая активацию, пролиферацию и дифференцировку клеток иммунной системы и способствуя формированию клеток-эффекторов [3, 6, 9, 10]. Интенсивность и характер иммунного ответа при вакцинации зависят от многих факторов, прежде всего от свойств самой вакцины, пути и схемы ее введения, а также от функционального состояния организма и его генетических особенностей [4, 5].
Одним из перспективных направлений современной вакцинологии является обеспечение адекватного иммунного ответа при вакцинации. Использование препаратов с иммуномодулирующей активностью на фоне вакцинации может изменять баланс эндогенных цитокинов в организме и оказывать влияние на развитие антигенспецифического иммунного ответа [1, 2, 4, 5, 7]. В связи с этим цитокины, регулирующие каскад иммунных реакций на любое антигенное воздействие, можно рассматривать как потенциальные иммуноадъюванты.
Авдеева Жанна Ильдаровна — д-р. мед. наук, профессор, заведующая лабораторией иммунологии ГНИИ стандартизации и контроля; тел.: 8 (495) 241-25-34; e-mail: аvd-cytok@newmail.гu.
Материал и методы. Экспериментальные исследования адъювантных свойств рекомбинантных цитокинов человека и препарата «Полиоксидоний» проведены на моделях иммунизации беспородных белых мышей вакциной против бешенства. Животные массой 12—14 г получены из питомника РАМН «Столбовая». Для иммунизации использованы культуральная концентрированная, очищенная методом ультрафильтрации, инактивированная сухая антира-бическая вакцина (КОКАВ) и культуральная инактивированная сухая антирабическая вакцина (КАВ) производства ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова.
Для внутримозгового заражения мышей применяли разрешающий фиксированный вирус бешенства, штамм CVS (Challenge virus standard) в объеме 0,03 мл. Заражающая доза вируса составляла 3—5 lg LD50. В работе использованы рекомбинантные цитоки-ны человека: ИЛ-1в (НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург), ИЛ-2 (ООО «Биотех», Санкт-Петербург), ФНОа (ВБ «Вектор», Бердск). Также использованы препараты, условно объединенные термином цитокины: тимо-зин-а1 человека рекомбинантный, гибридный белок «Неотим», состоящий из ФНОа и тимозина-а1 (НИИ прикладной микробиологии, Оболенск), а также препарат «Полиоксидоний» (Институт иммунологии, Москва).
В первой серии экспериментов вакцину КОКАВ вводили внутрибрюшинно в разведениях 1:50, 1:500 и 1:5000. Каждая группа, соответствующая одному из разведений, включала по 10—15 мышей. Вакцину и цитокины в виде монопрепаратов или комплексов вводили животным одновременно двукратно с интервалом в одну неделю. Дозы для ИЛ-1в, ФНОа, тимо-зина-а1 и неотима составляли 1 мкг на мышь. Дозы цитокинов, включенных в комплекс, составляли для ИЛ-1в 10 нг, для ИЛ-2 — 10 МЕ, для ФНОа — 0,01 мкг на животное. В контрольных группах мышей вакцину применяли в тех же разведениях, но без цитоки-нов. На 8-й день после иммунизации мышам вводили фиксированный вирус бешенства. Наблюдение осуществляли в течение 30 дней, отмечая гибель животных с б дня после заражения.
Для оценки гуморального иммунного ответа у животных на 7-е сутки после иммунизации брали кровь. В сыворотке крови определяли титр вируснейтрали-зующих специфических антител в реакции биологической нейтрализации на беспородных белых мышах.
Во второй серии экспериментов оценивали имму-ноадъювантное действие ФНОа и полиоксидония. Вакцину КАВ по вышеописанной схеме вводили
Таблица 1
Влияние комплекса рекомбинантных цитокинов (ИЛ-1в, ИЛ-2, ФНОа) на интенсивность иммунного ответа животных, иммунизированных антирабической вакциной
Группа Разведения вакцины Кол-во выживших животных, % 18 КР50 КР50
Контроль — КОКАВ (п=120) 1:50 40,0 ± 4,3
1:500 0 1,70 ± 0,1 1:50
1:5000 16,7±1,2
КОКАВ + 1:50 83,4±3,81
цитокины 1:500 46,1±2,31 2,56 ± 0,11 1:365
(п=120) 1:5000 7,7±1,3
1 Разница с контролем статистически значима.
Таблица 2
Влияние монопрепаратов цитокинов на эффективность иммунизации животных вакциной КОКАВ (результаты 3 экспериментов)
Группа Разведения вакцины і І 1 и 18 КР50 КР50 Титр антител1
Контроль — КОКАВ (п=108) 1:25 27,3±3,5 <1,40 <1:25 1:33,1
1:125 25,0±3,4 1:26,2
1:625 0 1:10,0
КОКАВ + ИЛ-1р (п=108) 1:25 45,5±4,22 1,66±0,10 1:46 1:160,0
1:125 40,0±3,82 1:67,8
1:625 8,3±1,6 1:10,0
КОКАВ + ФНОа (п=105) 1:25 46,2±3,72 1,45±0,11 1:29 1:63,7
1:125 20,0±1,8 1:44,8
1:125 0 1:10,0
КОКАВ + тимозин-а1 (п=106) 1:25 23,1±1,5 <1,40 <1:25 1:32,3
1:125 0 1:12,6
1:625 0 1:10,0
КОКАВ + неотим (п=108) 1:25 27,3±2,0 <1,40 <1:25 1:28,2
1:125 20,0±1,9 1:20,0
1:625 0 1:10,0
1 В реакции биологической нейтрализации.
2 Разница с контролем статистически значима.
в дозе 0,25 МЕ, ФНОа вводили внутрибрюшинно в дозах 0,1 и 1,0 мкг (100 и 1000 Ед на особь) за 24 часа одновременно или через 24 часа после иммунизации вакциной. Полиоксидоний использовали в дозах 40 или 500 мкг на мышь, а также в сочетании с ФНОа (0,1 мкг на мышь) через 24 часа после иммунизации. Контролем служили группы животных, которые получали одну вакцину, указанные дозы ФНОа, полиоксидония или полиоксидония в сочетании с ФНОа (двукратно с интервалом в одну
неделю), а также неиммунизированные мыши. Как и в первой серии экспериментов, после окончания иммунизации животным вводили фиксированный вирус бешенства.
Эффективность иммунизации, как при изолированном использовании антирабической вакцины, так и при сочетании ее с цитокинами, оценивали по проценту выживаемости животных, показателю предельно допустимого разведения вакцины, обеспечивающего 50% выживаемость в абсолютных значениях (КР50) и в логарифмах (^ КР50), а также по уровню титров вируснейтрализующих антител.
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statgraflcs. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью ^критерия Стьюдента.
Результаты исследования и обсуждение полученных данных. Комплекс цитокинов, использованный при иммунизации животных антирабической вакциной КОКАВ, способствовал повышению ее эффективности. Отмечена большая выживаемость мышей при заражении их вирусом бешенства по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированных одной вакциной. Выживаемость в опытной группе, получившей вместе с вакциной комплекс цитокинов, увеличилась в 7,3 раза по сравнению с контролем (табл. 1). Процент выживших животных, иммунизированных вакциной в разведении 1:50 и 1:500, в опытной группе статистически достоверно превышал показатели контрольной группы.
Использование в качестве адъювантов ИЛ-1р или ФНОа при иммунизации животных антирабической вакциной способствовало повышению ее эффективности. Процент выживших мышей в группе с ИЛ-1Р при разведениях вакцины 1:25 и 1:125 был в 1,6 раза выше аналогичных показателей в контроле. В группе с ФНОа при разведении вакцины 1:25 указанный показатель был в 1,7 раза выше контрольного. У животных, получивших вместе с вакциной ФНОа или ИЛ-1р, выживаемость увеличивалась в 1,2—1,8 раза по сравнению с контролем. В группах животных, получивших одновременно с вакциной тимозин-а1 или неотим, этот показатель остался на уровне контроля (табл. 2).
При оценке титров вируснейтрализующих антител установлено, что наиболее выраженное стимулирующее действие на процесс антителообразования оказывали ИЛ-1р и ФНОа. При введении вакцины в разведении 1:25 в сочетании с указанными цитоки-нами отмечено увеличение титров антител в 1,9—4,8 раза. При разведении вакцины 1:125 ФНОа и ИЛ-1р повышали титры антител в 1,7—2,5 раза выше уровня контроля. При большем разведении вакцины стимулирующего влияния цитокинов на антителообра-зование не отмечено. В группах животных, которым вводились тимозин-а1 и неотим, титры антител не повышались (табл. 2).
90 Кол-во выживших животных, %
70-
50-
30-
10-
II
* * 60 —1 Кол-во выживших
= животных, %
н *
1 30- щ
1 20- II щ
н 1 1Ш
Контроль ФНОа
без вакцины
За 24 часа 0 часов Через 24 часа
; ФНОа, ОД мкг
| ФНОа, 1 мкг
Контроль (вакцина, 0,25 МЕ)
Вакцина + полиоксидоний
= 40 мкг
II
500 мкг
Вакцина + полиоксидоний + ФНОа
Рис. 1. Уровень защиты животных, иммунизированных вакциной КАВ в сочетании с ФНОа, при заражении вирусом бешенства («звездочкой» обозначена достоверность различий с контрольной группой).
Рис. 2. Уровень защиты животных, иммунизированных вакциной КАВ в сочетании с полиоксидонием и ФНОа («звездочкой» обозначена достоверность различий с контрольной группой).
Во второй серии экспериментов ФНОа способствовал повышению резистентности животных при заражении их вирусом в дозе 5 ^ LD50. Большая выживаемость отмечена при введении цитокина в дозе 0,1 мкг на мышь, при этом процент выживших животных, соответственно схемам введения, был в 1,8, 2,2 и 3,1 раза выше показателя контрольной группы. Введение ФНОа в обеих дозах через 24 часа после иммунизации приводило к наиболее выраженному повышению противовирусной устойчивости. Доля выживших мышей в опытных группах равнялась 87,5%, в контроле — 28%. Введение ФНОа в дозе
0,1 мкг неиммунизированным животным также повышало их резистентность к последующему заражению вирусом. Доля выживших мышей в указанной группе составила 37,5%. Повышение дозы цитокина до 1 мкг не сопровождалось появлением защитного эффекта (рис. 1).
На основании полученных результатов можно заключить, что использование рекомбинантного человеческого ФНОа при иммунизации мышей анти-рабической вакциной приводит к существенному повышению резистентности животных при заражении их вирусом бешенства. Адъювантный эффект зависит от дозы и схемы введения цитокина.
При изучении влияния препарата «Полиоксидоний» на противовирусную устойчивость животных установлено, что его введение через сутки после иммунизации способствовало повышению протективной активности антирабической вакцины и увеличивало выживаемость животных при заражении их вирусом бешенства. Защитный эффект зависел от дозы полиок-сидония, при этом количество выживших мышей составило 44 и 56% соответственно (в контроле — 12,5%).
При сочетанном введении полиоксидония и рекомбинантного ФНОа (0,1 мкг на мышь) выживаемость экспериментальных животных составила 22 и 33% соответственно использованным дозам поли-
оксидония, что несколько ниже, чем при введении вакцины с полиоксидонием неиммунизированным антирабической вакциной мышам, что не защищало их от гибели (рис. 2).
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о стимуляции цитокинами иммуно-генной активности вакцины против бешенства. Наиболее выраженная защита наблюдается при применении вместе с вакциной комплекса рекомбинантных цитокинов, который увеличивал выживаемость экспериментальных животных в 7,3 раза. При этом развитие иммунного ответа сопровождалось формированием более высокого уровня вируснейтрализую-щих антител. Иммуноадъювантный эффект отмечен также при использовании цитокинов в виде монопрепаратов. Рекомбинантный человеческий ФНОа наиболее эффективен при введении в дозе 0,1 мкг на мышь через сутки после иммунизации антираби-ческой вакциной, повышая при этом противовирусную устойчивость у неиммунизированных мышей. Препарат «Полиоксидоний» в дозах 40 и 500 мкг также дозозависимо усиливал защитные свойства антирабической вакцины. Результаты экспериментов свидетельствуют о возможности использования цитокинов и других иммуномодулирующих препаратов в качестве адъювантов, способных повышать иммуногенную активность вакцин, а также о перспективности изучения новых подходов к управлению иммунным ответом.
Литература
1. Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А. и др. Действие цитокинов на протективные свойства антирабической вакцины // Цитокины и воспаление. 2007. Том 6, № 2. С. 46-50.
2. Акользина С.Е. Цитокины в вакцинах и их адъювантное действие: автореф. дис. ... канд. мед. наук. 1996. 30с.
3. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб.: Фолиант. 2008, 554 с.
4. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада Х, 2004. 446 с.
5. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Вакцины нового поколения на основе синтетических полиионов: история создания, феноменология и механизм действия, внедрения в практику // Иммунология. 1998. № 5. С. 4—11.
6. Симбирцев А.С. Цитокины - новая система регуляции защитных реакций организма. Цитокины и воспаление. 2002. Т. 1, № 1. С. 9-17.
7. Шестопалов А.М., Рассадкин Ю.Н., Устинова Е.Н. и др. Влияние фактора некроза опухолей альфа на эффективность вакцинации против бешенства // Вопросы вирусологии. 2002. № 3. С. 37-40.
8. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. 606 с.
9. Fradelizi D. Les cytokines: Facteurs solubles de la communication intercellulaire // Med. trop. 1998. Vol. 58, No. 4. P. 427-432.
10. Nash A.D., Lofthouse S.A., Barcham G.J. et al. Recombinant cytokines as immunological adjuvants // Immunol. Cell Biol. 1993. Vol. 71, No. 5. P. 367-379.
Поступила в редакцию 03.04.2009.
IMMUNOADJUVANT EFFECT OF CYTOKINES Zh.I. Avdeeva, N.A. Alpatova, S.E. Akolzina, N.V. Medunitsin L.I. Tarasevich State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Preparations (41 Sivtsev Vrazhek Lane Moscow 119002 Russia)
Summary — The paper gives consideration to the adjuvant properties of cytokines studied by using experimental models. They induced immunogenic activities by means of rabies vaccine. Combined with a complex of recombinant cytokines, the vaccine exhibited the most noticeable effects. Augmenting immune response was observed in parallel to high-level virus neutralizing antibody formation. The immunoadjuvant effects were observed when using recombinant interleukin-lb and tumor necrosis factor-a for monodrug therapy and “Polyoxidonium”. The research results were indicative of the possibility to apply cytokines and other immune-response modulating drugs as adjuvants capable of increasing immunogenic activities of the vaccines and highlight promising opportunities of researching into new approaches to immune response control. Key words: cytokines, adjuvants, vaccines, immune response.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 19—22.
УДК 615.37:612.017.1
Ж.И. Авдеева, Н.А. Алпатова, С.Е. Акользина, Н.В. Медуницын
Государственный НИИ стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича (119002 Москва, пер. Сивцев Вражек, 41)
ЦИТОКИНЫ И ВАКЦИНЫ
Ключевые слова: цитокины, иммуноадъюванты, вакцины, иммунный ответ.
Вакцины, изготовленные на основе клеток млекопитающих, содержат ряд провоспалительных цитокинов, набор и концентрация которых зависят от вида вакцины. Спонтанная и антигениндуцированная продукция цитокинов зависит от клеточной линии и характера антигена. Диплоидные клеточные штаммы (М-22 и L-68) секретируют цитокины спонтанно. Изучение синтеза цитокинов клеточными культурами может быть одним из критериев выбора субстрата для производства культуральных вакцин. Исследование адъювантных свойств цитокинов и препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью, на ряде экспериментальных моделей свидетельствуют о стимулирующем действии цитокинов на иммуногенную активность вакцин против гепатитов А и В. Наиболее выраженными иммуностимулирующими свойствами обладают рекомбинантные цитокины — фактор некроза опухоли-а и интерлейкин-1р, а также препараты «Полиоксидоний» и «Имунофан».
Цитокины оказывают влияние практически на все клетки, воздействуя на большинство процессов, протекающих в организме. Они обеспечивают межклеточную кооперацию и регулируют иммунные процессы. Их активная продукция происходит в ответ на различные стимулирующие агенты, их действие неспецифично. Цитокины образуют особую сеть, модулируя экспрессию поверхностных рецепторов и индуцируя секрецию друг друга. Благодаря высокоаффинным рецепторам на клетках-мишенях (константа диссоциации в пределах 10-10—10-12 M), они способны вызывать биологические эффекты в
Авдеева Жанна Ильдаровна — д-р мед. наук, профессор, заведующая лабораторией иммунологии ГНИИ стандартизации и контроля; тел.: 8 (495) 241-25-34; e-mail: аvd-cytok@newmail.ru.
малых концентрациях. Действие цитокинов плейо-тропно, им присуща локальная (ауто- и паракрин-ная) и системная (эндокринная) регуляторная активность [4, 8, 9, 12].
В настоящее время для оптимизации вакцинального процесса используются различные иммуномодуляторы, которые отличаются друг от друга по происхождению и механизму действия. Исследования по использованию цитокинов в качестве адъювантов немногочисленны, хотя иммуномодулирующий эффект таких адъювантов, как липополисахарид и му-рамилдипептид, объясняют вовлечением в этот процесс цитокинов [1, 10, 11].
Цитокины обнаружены в вакцинах и других иммунобиологических препаратах, субстратом для изготовления которых являются клетки эукариотов. Значимость выявления цитокинов в вакцинных препаратах важна для оценки их влияния на иммуноген-ную активность вакцин. Эпителиальные, фиброблас-тные и лимфоидные клеточные линии, используемые для производства иммунобиологических препаратов, способны секретировать цитокины спонтанно или при антигенной стимуляции [3, 11, 12]. Установлено содержание интерлейкинов (ИЛ) 1 и 6, а также гра-нулоцитарного и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующих факторов в антирабичес-кой и ряде других противовирусных вакцин. ИЛ-1р и фактор некроза опухоли-а (ФНОа) выявлены в лекарственных препаратах моноклональных антител, изготовленных на основе лимфоидных клеток человека. Большое количество цитокинов присутствует
