CC BY
54
IMMUNOLOGY
© МАРДАНЛЫ С.Г., АВДОНИНА А.С., 2020
Марданлы С.Г.1,2,3, Авдонина А.С.1
ИММУННЫЙ БЛОТТИНГ КАК МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ТОКСОПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИИ
1ЗАО «ЭКОлаб», 142530, г. Электрогорск Московской обл., Россия;
2ГОУ ВО МО Государственный гуманитарно-технологический университет, 142600, г. Орехово-Зуево Московская обл., Россия;
3ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), 119991, Москва, Россия
Разработан набор реагентов для выявления иммуноглобулинов класса G к отдельным антигенам Toxoplasma gondii методом иммунного блоттинга в формате «Western blot». Проведенные лабораторные испытания с использованием первого международного стандарта ВОЗ «Anti-toxoplasma .serum (IgG), human, Lyophilized, 20IU / ampoule» ф. «NIBSC» (Великобритания) продемонстрировали аналитическую чувствительность нового набора, равную 10 МЕ/мл. Предварительное исследование диагностической эффективности нового набора показало его высокую чувствительность, равную 98,51 - 100 %, а также высокую специфичность, равную 99,5 - 100 %. Разработанный набор реагентов предназначен для проведения подтверждающих исследований при лабораторной диагностике токсоплазмоза.
Ключевые слова: клиническая лабораторная диагностика; Toxoplasma gondii; токсоплазмоз; иммуноферментный
анализ; иммунный блоттинг; иммуноглобулины класса G (IgG). Для цитирования: Марданлы С.Г., Авдонина А.С. Иммунный блоттинг как метод диагностики токсоплазменной инфекции. Клиническая лабораторная диагностика 2020; 65(11): 693-698. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-11-693-698 Mardanly S.G.12-3, AvdoninaA.S.1
IMMUNE BLOTTING AS A METHOD FOR DIAGNOSIS OF TOXOPLASMOSIS
1The closed corporation "EKOlab'; Elektrogorsk, 142530, Moscow region, Russia;
2State University of Humanities and Technology, 142600, Orekhovo-Zuyevo, Moscow region, Russia;
3I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), 11991, Moscow, Russia
Test kit for detection ofIgG-antibodies to individual antigens of Toxoplasma gondii by immune blotting («Western blot» format) has been developed. Laboratory testing with first international WHO standard «Anti-toxoplasma serum (IgG), human, Lyophilized, 20 IU / ampoule» (NIBSC, Great Britain) demonstrated the analytical sensitivity of the new kit equal to 10 IU / ml. Study of the diagnostic efficiency of the new kit showed its high sensitivity, equal to 98.51 - 100%, and high specificity, equal to 99.5 - 100%. New test kit is intended for confirmatory testing in laboratory diagnostics of toxoplasmosis.
Key words: clinical laboratory diagnostics; Toxoplasma gondii; toxoplasmosis, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immune blotting (IB), IgG-antibodies.
For citation: Mardanly S.G., Avdonina A.S. Immune blotting as a method for diagnosis of toxoplasmosis. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics. 2020; 65 (11): 693-698 (in Russ.). DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0869-2084-2020-65-11-693-698
For correspondence: Mardanly S.G., doctor of medical sciences, academician of the Russian academy of medical technical sciences; professor of department of pharmacology and pharmaceutical disciplines of State University of Humanities and Technology; professor of department of Epidemiology and Modern Vaccination Technologies Sechenov University; president and director of science of Closed Joint Stock Company «EKOlab»; e-mail: ekolab-president@mail.ru Information about authors:
Mardanly S.G., https://orcid.org/0000-0002-4556-135X; Avdonina A.S., https://orcid.org/0000-0002-2990-4930.
Acknowledgments. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Токсоплазмоз - антропозооноз, входящий в группу инфекций TORCH, в которую в настоящее время включают также краснуху, цитомегаловирусную инфекцию (ЦМВИ) и простой герпес (ПГ или герпетическая инфекция) [1-5].
Хотя токсоплазмоз чаще всего именуют в литературе инфекцией (иногда паразитарной инфекцией) и объединяют в одну группу с названными вирусными инфекциями, он, строго говоря, является не инфекцией, а инва-
Received 03.09.2020 Accepted 15.09.2020
зией - процессом, связанным с заражением простейшим животным - кокцидией Toxoplasma gondii — облигат-ным внутриклеточным паразитом, имеющим сложный цикл развития, в котором человек - это лишь промежуточный хозяин [3, 6]. Хотя T. gondii относится к царству простейших (Protozoa), ее строение по сравнению с другими возбудителями группы TORCH намного сложнее, что в сочетании с особенностями цикла развития делает значительно более сложным и ее взаимодействие с орга-
Для корреспонденции: Марданлы Сейфадин Гашимович, д-р мед. наук, акад. Российской академии медико-технических наук; проф. каф. фармакологии и фармацевтических дисциплин ГГТУ, проф. каф. эпидемиологии и современных технологий вакцинации «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ»; e-mail: ekolab-president@mail.ru
ИММУНОЛОГИЯ
низмом хозяина как на гуморальном, так и на клеточном уровне. По этой причине включение токсоплазмоза в группу инфекций TORCH только на основании тяжести последствий заражения беременной T. gondii для плода и/или новорожденного можно считать несколько искусственным.
У иммунокомпетентных взрослых токсоплазмоз, как правило, протекает доброкачественно или просто бессимптомно, что делает исключительно актуальной своевременную диагностику этой инвазии у женщин, планирующих беременность, у беременных и новорожденных, причем основную роль в этом играют лабораторные методы исследования, в частности, серологическая диагностика. Наиболее эффективным на сегодня методом признан им-муноферментный анализ (ИФА), основанный на использовании компонентов соответствующей серологической реакции, несущих ферментную «метку». ИФА, позволяющий выявлять в сыворотке (плазме) и в спинномозговой жидкости специфические антитела (как правило IgM и IgG), широко используется при перинатальном скрининге и для верификации диагноза [1, 2, 4, 7].
Антитела класса М при токсоплазмозе появляются первыми в ответ на внедрение возбудителя в течение первых двух недель от момента заражения. Их количество достигает максимума на 4-8 нед заболевания, после чего снижается до полного исчезновения в течение нескольких месяцев. В отдельных случаях IgM могут обнаруживаться в крови до 18 месяцев.
Антитела класса G (IgG) появляются на 6-8 нед заболевания и сохраняются в течение нескольких лет, обеспечивая длительный иммунитет. Их количество достигает максимума через 1-2 месяца [1].
Однако при диагностике врожденного токсоплазмоза одного положительного результата исследования в ИФА может оказаться недостаточно, поскольку в крови новорожденного могут присутствовать материнские антитела [8].
Поэтому в настоящее время в практике диагностических лабораторных исследований все шире используется такой вариант ИФА, как иммунный блоттинг (ИБ), который в отличие от классического ИФА дает в одной постановке оценку наличия в исследуемых образцах специфических иммуноглобулинов к различным антигенам возбудителя, что с учетом динамики иммунологической перестройки инфицированного позволяет определять у него не только наличие соответствующей инфекции, но и ее стадию, а применительно к токсоплазмозу оценивать наличие или отсутствие врождённого токсо-плазмоза по спектрам антител у матери и новорожденного [9-12].
Иммунный блотинг (ИБ) - это, по сути, твердофазный ИФА, в котором роль иммуносорбента выполняют полоски (стрипы) нитроцеллюлозной мембраны с нанесенными на нее антигенами, антитела к которым и являются искомым аналитом.
В зависимости от способа нанесения антигенов на мембрану различают ИБ в форматах «Western blot или «Line blot». Для «Western blot» на мембрану методом электропереноса наносят нативные антигены из подвергнутого электрофорезу лизата культуры соответствующего возбудителя, для «Line blot» на мембрану в определенном порядке наносят отдельные антигены (как правило, синтетические или рекомбинантные, поскольку выделение и очистка соответствующих нативных антигенов - достаточно дорогая и трудоемкая операция)
либо цельных лизатов (для одновременной оценки наличия антител к нескольким различным патогенам). Возможна также комбинация этих двух форматов ИБ [9].
Говоря о высокой эффективности ИБ при диагностике различных инфекций, следует отметить, что она определяется прежде всего возможностью адекватной интерпретации результатов исследования, т.е. объективностью идентификации окрашенных зон на стрипах при исследованиях в формате «Western blot», что, очевидно, напрямую связано с наличием достоверной информации об антигенном составе соответствующих возбудителей и роли каждого антигена в иммунологической перестройке зараженного организма, т.е. при наличии обстоятельных исследований динамики спектров специфических антител в крови инфицированного по ходу развития инфекции. Та же информация необходима и при выборе антигенов, наносимых на иммуносорбент при использовании для диагностики формата «Line blot».
В этом отношении T. gondii - не слишком благодарный объект для исследования и, прежде всего, по причине уже упомянутой сложности антигенного строения. Так, S.B. Delibas и соавт. [13] показали, что помимо большого числа антигенов, выявляемых при ИБ в формате «Western blot», различные штаммы возбудителя имеют различный антигенный состав - так, у штамма RH было выявлено 14 антигенов, а у штамма TRH - 18 антигенов с молекулярной массой в диапазоне 17-105 килоДальтон (кДа).
В отношении выбора самых важных с диагностической точки зрения антигенов Toxoplasma gondii наиболее признанным на сегодня можно считать выбор специалистов фирмы «Microgen Diagnostics» (Германия) [14] (табл. 1).
Благодаря возможности выявления антител к отдельным антигенам возбудителя ИБ входит в число тестов, рекомендуемых для диагностики токсоплазмоза [1520], и по этой причине разработка отечественных тест-систем соответствующего формата, очевидно актуальна.
Целью настоящего исследования явилась разработка тест-системы для ИБ в формате «Western blot» для выявления антител класса G к Toxoplasma gondii. При этом был использован опыт разработки таких систем для ряда других инфекций [9, 21-24].
Материал и методы. Основные материалы, использованные в работе:
- нативный лизат T. gondii штамма RH ф. «Biokit» (Испания);
- нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 мкм ф. «Sartorius» (Германия);
- конъюгат козьих антител к IgG человека с щелочной фосфатазой ф. «Jackson Immunoresearch» (США);
- субстратный раствор фирмы «Kem-En-Tec» (Дания), содержащий 5-бром-1-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий.
В качестве референсного материала использовали:
- первый международный стандарт ВОЗ «Anti-toxoplasma serum (IgG), human, Lyophilized, 20 IU / ampoule» ф. «NIBSC» (Великобритания), содержащий IgG человека к T. gondii в количестве 20 международных единиц в ампуле (МЕ/ампула);
- стандартную панель положительных образцов предприятия ЗАО «ЭКОлаб», содержащих IgG к T. gondii (СОП+-Токсоплазма^ - 12 образцов);
- стандартную панель отрицательных образцов предприятия ЗАО «ЭКОлаб», не содержащих IgG к T. gondii (СОП'-Токсоплазма-G - 12 образцов).
IMMUNOLOGY Таблица 1
Перечень диагностически значимых антигенов Toxoplasma gondii (по [14])
Белок(антиген) Описание Характеристика
p66 (ROP1) Rhoptry protein 1 - белок специализированных органелл Антиген тахизоитов и брадизоитов
p65 (MAG1) Matrix antigen 1 - матричный антиген Антиген брадизоитов
p35 (GRA8) Granular antigen 8 - гранулярный антиген Антиген тахизоитов и брадизоитов
p30 (SAG1) Surface antigen 1 - поверхностный антиген Антиген тахизоитов
p29 (GRA7) Granular antigen 7 - гранулярный антиген Антиген тахизоитов и брадизоитов
Образцы стандартных панелей изготавливали из сывороток, полученных в коммерческой лаборатории «ИН-ВИТРО» (Москва) и предварительно исследованных на наличие или отсутствие IgG к T. gondii в тест-системах «ИФА-Токсо-^М» и «Лайн-Блот TORCH-профиль-^М» [25] фирмы ЗАО «ЭКОлаб» (Россия).
В качестве клинического материала были использованы образцы сыворотки и плазмы крови человека, полученные из Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва) и имеющие отрицательный результат в отношении ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С и сифилиса. Данные образцы были исследованы на наличие IgG к T. gondii в тест-системе «ИФА-Токсо-IgG» ф. ЗАО «ЭКОлаб».
Расчет показателей диагностической чувствительности, специфичности и эффективности, а также статистическая обработка полученных результатов выполнены в соответствии с рекомендациями по анализу и статистической оценке результатов клинико-лабораторных исследований [26, 27].
Статистическую достоверность результатов испытаний определяли по формуле:
D% = (1-C/100)(1/n) * 100%,
где D% - статистическая достоверность результатов испытаний, выраженная в процентах;
С - доверительная вероятность;
n - число исследованных проб [26].
Расчеты проводили для доверительной вероятности 95 % (р = 0,05).
В процессе разработки применяли следующие методы:
- вертикальный электрофорез белков в полиакрила-мидном геле (восстановленные условия по U.K. Laem-mli [28]) с целью разделения их по молекулярному весу;
- электроперенос (блоттинг) разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану;
- иммуноферментный анализ в разновидности «иммунный блоттинг».
Результаты и обсуждение. В процессе работы были решены следующие задачи:
- подобрана оптимальная концентрация акриламида и бисакриламида в полиакриламидном геле для наилучшего разделения отдельных белков T. gondii по всему градиенту;
- отработаны условия электрофореза и электропереноса (вольтаж, температура, продолжительность);
- выбран блокирующий буферный раствор для обработки мембран после электропереноса с целью предотвращения неспецифического связывания;
- оптимизированы составы реагентов для проведения анализа;
- отработана процедура проведения анализа (разведение исследуемых образцов, время инкубаций).
Самым важным этапом в разработке новой тест-системы стал этап получения иммуносорбента.
В процессе экспериментальной работы было установлено, что для наилучшего разделения белков, входящих в состав нативного лизата T. gondii, наиболее целесообразно использовать градиентный полиакри-ламидный гель с интервалом значений концентраций в градиенте от 4 до 17 %.
В качестве условий проведения электрофореза были приняты температура +7 °С, продолжительность 4,5 ч и переменный вольтаж (100 В в начале процесса, 150 В через 1 ч и 250 В еще через 1 ч). В качестве условий проведения электропереноса были приняты температура +15 °С, продолжительность 3 ч и вольтаж 100 В.
В качестве блокирующего раствора для мембран был выбран трис-солевой буфер (рН = 7,5) с содержанием 1% бычьего сывороточного альбумина.
Результатом разработки стал набор реагентов «ИФА-Блот-Токсоплазма-IgG», предназначенный для выявления иммуноглобулинов класса G к отдельным антигенам Toxoplasma gondii методом иммунного блоттинга в формате «Western blot».
Реагенты, входящие в состав набора, были подобраны следующим образом:
1. Иммуносорбент — 24 стрипа из нитроцеллюлоз-ной мембраны с нанесенными на них методом электропереноса отдельными антигенами T. gondii и контрольной линией, представленной козьими антителами к IgG человека.
2. Контрольный положительный образец.
3. Контрольный отрицательный образец.
4. Конъюгат козьих антител к IgG человека с щелочной фосфатазой.
5. Субстратный раствор, содержащий 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий.
6. 5-кратный концентрат промывочного раствора.
7. Раствор для разведения сывороток.
8. Фотография референс-стрипа с проявленным антигенным профилем T. gondii.
Процедура проведения анализа была отработана следующим образом:
- выбрано разведение образца 1:100;
- инкубация стрипов иммуносорбента с исследуемыми образцами на шейкере-качалке при комнатной температуре - 30 мин;
- 3 промывки по 5 мин;
- инкубация стрипов иммуносорбента с конъюгатом на шейкере-качалке при комнатной температуре - 30 мин;
- 3 промывки по 5 мин;
- инкубация стрипов иммуносорбента с субстратным раствором на шейкере-качалке при комнатной температуре в темноте - 10 мин;
- остановка реакции водой очищенной.
Электрофоретическое разделение лизата T. gondii
на отдельные белки в сравнении с белковым маркером молекулярного веса показало, что антигенный профиль
ИММУНОЛОГИЯ
нативного лизата Toxoplasma gondii штамма RH ф. «Biokit» представлен белками с молекулярными массами 66, 65, 35, 30 и 29 килоДальтон (кДа), которые являются наиболее диагностически важными антигенами.
Расположение соответствующих зон на стрипе им-муносорбента показано на рисунке.
Результаты теста оценивают визуально. Интерпретация результатов, полученных при исследовании каждого образца, осуществляется в зависимости от того, к каким антигенам были выявлены антитела (табл. 2).
В большинстве случаев достаточно установления факта инвазии, однако для отдельных групп пациентов актуальным является определение стадии заболевания. Для этого полученные результаты по наличию IgG к отдельным антигенам T. gondii рекомендуется рассматривать совместно с данными по наличию IgM к отдельным антигенам.
Специалистами «Microgen Diagnostics» (Германия) [14] предложена интерпретация спектров антител, получаемых при ИБ, с точки зрения клинической информативности (табл. 3).
Следующим этапом разработки стала оценка чувствительности и специфичности нового набора реагентов.
Аналитическая чувствительность тест-системы «ИФА-Блот-Токсоплазма-IgG» в первую очередь была исследована на Первом международном стандарте ВОЗ «Anti-toxoplasma serum (IgG), human, Lyophilized, 20 IU / ampoule» ф. «NIBSC» (Великобритания), содержащем IgG человека к T. gondii в количестве 20 международных единиц в ампуле (МЕ/ампула), и составила 10 МЕ/мл.
Затем чувствительность тест-системы была оценена на образцах стандартных панелей предприятия ЗАО «ЭКОлаб», содержащих и не содержащих IgG к T. gondii. Результаты данного исследования приведены в табл. 4.
Результаты, представленные в табл. 4, свидетельствуют о полном совпадении итоговых оценок, полученных при исследовании образцов стандартных панелей в разработанном наборе реагентов, с их паспортными характеристиками, что позволяет сделать заключение о том,
Таблица 2
Интерпретация результатов ИБ в тест-системе «ИФА-Блот-Токсоплазма-IgG»
Наличие IgG к антигенам T. gondii Обозначение Результат
Выявлены антитела к гранулярному антигену р35 (GRA8). Антитела к + Положительный
другим антигенам могут присутствовать или отсутствовать
Не выявлены антитела ни к одному из антигенов - Отрицательный
Выявлены антитела к любому антигену, кроме р35, при отсутствии анти- +/- Неопределенный
тел к антигену р35
Таблица 3
Спектры антител на разных стадиях токсоплазмоза (по [14])
Стадия инфекции Наличие антител к антигенам ...
p66 (ROP1) p65 (MAG1) p35 (GRA8) p30 (SAG1) p29 (GRA7)
Сероконверсия (0-3 мес с момента заражения) Острая инфекция Активная инфекция (3-6 мес) IgM+ IgG+/-IgM+ IgG+/- IgM+/-IgG+/- IgG+ IgM+ IgG+ IgM+ IgG+ IgG+ IgM+/-IgG+ IgM+/-IgG+
Подострая инфекция (6-12 мес) IgM+ IgG+/- IgG+ IgG+ IgG+ IgG+
Латентная инфекция (более 1 года) IgM+ IgG+/- IgG+/- IgG+ IgG+ IgG+
Прошедшая инфекция (более 2 лет) - IgG+/- - IgG+ IgG+
кДа i 2 кДа 116
97
66 —, 66
42
35 — 35
30 29
27 __ 20 14
Расположение антигенов T. gondii на стрипе иммуносорбента. 1 - результат электрофоретического разделения белкового маркера молекулярного веса; 2 - результат исследования сыворотки, положительной по наличию IgG к T. gondii, при инкубации с мембраной, на которую нанесены отдельные антигены нативного лизата T. gondii, подвергнутого электрофорезу.
что аналитическая чувствительность и специфичность нового набора составляют 100 %. При этом в случае с положительными образцами наблюдается следующая зависимость: по мере увеличения в образцах концентрации IgG к T. gondii в МЕ/мл возрастает количество анти-
IMMUNOLOGY Таблица 4
Результаты исследования образцов стандартных панелей в тест-системе «ИФА-Блот-Токсоплазма-IgG»
Панель № «ИФА-Токсо-IgG» «Лайн-Блот ToRCH- «ИФА-Блот-Токсоплазма-IgG»
образца профиль-IgG»
Индекс Концентрация Результат Результат Наличие антител к Результат
позитивности* IgG в МЕ/мл антигенам ...
Положитель- 1 1,2 17 положит. положит. р35, р30 положит.
ных образцов 2 1,2 21 положит. положит. р35, р30 положит.
3 1,4 28 положит. положит. р66, р35 положит.
4 1,4 34 положит. положит. р35 положит.
5 1,6 42 положит. положит. р66, р35, р30 положит.
6 1,9 62 положит. положит. р66, р35 положит.
7 2,1 88 положит. положит. р35 положит.
8 4,2 167 положит. положит. р66, р65, р35, р30 положит.
9 14,8 199 положит. положит. р66, р65, р35, р30, р29 положит.
10 15,1 200 положит. положит. р66, р65, р35, р30, р29 положит.
11 15,4 200 положит. положит. р66, р65, р35, р30 положит.
12 15,8 200 положит. положит. р66, р65, р35, р30, р29 положит.
Отрицательных 1 0,2 - отрицат. отрицат. - отрицат.
образцов 2 0,2 - отрицат. отрицат. - отрицат.
3 0,3 - отрицат. отрицат. - отрицат.
4 0,5 - отрицат. отрицат. - отрицат.
5 0,2 - отрицат. отрицат. - отрицат.
6 0,3 - отрицат. отрицат. - отрицат.
7 0,4 - отрицат. отрицат. - отрицат.
8 0,4 - отрицат. отрицат. - отрицат.
9 0,6 - отрицат. отрицат. - отрицат.
10 0,5 - отрицат. отрицат. - отрицат.
11 0,7 - отрицат. отрицат. - отрицат.
12 0,3 - отрицат. отрицат. - отрицат.
Примечание. * - индекс позитивности - отношение оптической плотности в лунках с исследуемыми образцами к критической оптической плотности.
Таблица 5
Результаты исследования образцов клинического материала в тест-системе «ИФА-Блот-Токсоплазма-IgG»
Группа образцов Число исследованных Результаты исследования в ИБ
образцов Положительный | Отрицательный
Образцы, содержащие IgG к T. gondii 190 190 0
Образцы, не содержащие IgG к T. gondii 605 0 605
генов, к которым обнаруживаются антитела. Это свидетельствует о хорошей чувствительности разработанной тест-системы и об информативности полученных в ИБ данных.
Оценку диагностической эффективности нового набора реагентов «ИФА-Блот-Токсоплазма-IgG» проводили путем исследования 800 образцов клинического материала. 190 образцов по результатам скринингового исследования содержали IgG к T. gondii, 605 образцов не содержали IgG к T. gondii, 5 образцов были определены как сомнительные (оптическая плотность в ИФА в пределах «серой зоны»).
Результаты данного исследования приведены в обобщенном виде в табл. 5.
Полученные результаты с доверительной вероятностью 95% демонстрируют диагностическую чувствительность, не менее 98,51%, и диагностическую специфичность - не менее 99,5 %.
Из 5 сомнительных образцов 3 были определены как положительные в ИБ, а 2 - как отрицательные.
Итоговая оценка диагностической эффективности
разработанной тест-системы с доверительной вероятностью 95 % дает значение 99-100 %.
Выводы
1. Разработан набор реагентов «ИФА-Блот-Токсоплазма-IgG», предназначенный для выявления иммуноглобулинов класса G к отдельным антигенам Toxoplasma gondii методом иммунного блоттинга в формате «Western blot», который характеризуется высокими показателями чувствительности, специфичности и диагностической эффективности.
2. Данный набор реагентов после прохождения процедуры государственной регистрации медицинского изделия может быть использован для проведения подтверждающих исследований в диагностике токсоплаз-моза с целью верификации сомнительных результатов скрининга и определения стадии заболевания.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ИММУНОЛОГИЯ
ЛИТЕРАТУРА (пп .7, 8, 10-20, 28 см .REFERENCES)
1. Марданлы С.Г., Симонова Е.Г., Симонов В.В. Инфекции ТоИСН-группы: клиническая лабораторная диагностика, эпидемиологический надзор и контроль. М.: Транзит-ИКС; 2018.
2. Долгих Т.И. Токсоплазмоз: современная стратегия лабораторной диагностики. Инфекция и иммунитет. 2011; 1(1): 43-50.
3. Казанцев А.П. Токсоплазмоз. Л.: Медицина, 1985.
4. Марданлы С.Г. Эпидемиологический надзор за инфекциями TORCH-группы на основе современных технологий лабораторной диагностики. Дис. ... д-ра мед. наук. М.; 2016.
5. Марданлы С.Г., Кирпичникова Г.И., Неверов В.А. Токсоплазмоз: этиология, эпидемиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика, профилактика. Методическое пособие. Электрогорск: ЗАО «ЭКОлаб»; 2005.
6. Грачева Л.И. Проблема токсоплазмоза. Педиатрия. 1999; 4: 83-6.
9. Марданлы С.Г., Симонов В.В., Авдонина А.С. Производство
наборов реагентов для клинической лабораторной диагностики иммунохимическимиметодами. Орехово-Зуево: ГГТУ; 2017.
21. Авдонина А.С., Марданлы С.Г., Юминова Н.В. Разработка им-муноферментной тест-системы для выявления антител класса М к индивидуальным белкам цитомегаловируса человека методом иммунного блоттинга в формате «Western blot». Вестник современной клинической медицины. 2016; 9(5): 7-14.
22. Марданлы С. Г., Авдонина А. С., Марданлы С. С., Шершнева Н. Н. Разработка набора реагентов для выявления антител класса G к отдельным антигенам вирусов простого герпеса первого и второго типов методом иммунного блоттинга в формате Western-Line-Blot. Медицинский алфавит. 2017; 4(38): 33-40.
23. Марданлы С.Г., Авдонина А.С. Разработка набора реагентов для выявления антител класса G к отдельным антигенам вируса краснухи методом иммунного блоттинга в формате «Western blot». Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63(11): 696-701.
24. Марданлы С.Г., Авдонина А.С. Разработка набора реагентов для выявления антител класса G к отдельным антигенам цито-мегаловируса методом иммунного блоттинга в формате Western Blot. Клиническая дерматология и венерология. 2014; 1: 18-24.
25. Арсеньева В.А., Амелина Е.А., Марданлы С.Г., Ротанов С.В. Линейный иммуноблоттинг для одновременного выявления антител к основным возбудителям инфекций TORCH-группы. Медицинский алфавит. 2017; 20(317): 43-8.
26. Антонов В.С. Вопросы статистической оценки результатов клинических испытаний медицинских изделий для in vitro диагностики. Доступно по адресу: https://docplayer.ru/118768-Voprosy-statisticheskoy-ocenki-rezultatov-klinicheskih-ispytaniy-medicinskih-izdeliy-dlya-in-vitro-diagnostiki-antonov-v-s-zamesti-tel-generalnogo.html (По состоянию на 28.09.2020).
27. Чернов В.И., Есауленко И.Э., Родионов О.В., Семенов С.Н.. Медицинская информатика: учебное пособие. Ростов н/Д: Феникс; 2007.
REFERENCES
1. Mardanly S.G., Simonova E.G., Simonov V.V. Torch-group infections: clinical laboratory diagnostics, epidemiological surveillance and control [Infektsiya Torch-gruppy: klinicheskaya laboratornaya diagnostika, epidemiologicheskiy nadzor i kontrol']. Moscow: Tranzit-IKS; 2018. (in Russian)
2. Dolgikh T.I. Toxoplasmosis: modern strategies of laboratory diagnostics. Infektsiya i immunitet. 2011; 1(1): 43-50. (in Russian)
3. Kazantsev A.P. Toxoplasmosis.[Toksoplazmoz]. Leningrad: Medit-sina; 1985. (in Russian)
4. Mardanly S.G. Epidemiological surveillance of TORCH-group infections based on modern technologies of laboratory diagnostics. Diss. Moscow; 2016. (in Russian)
5. Mardanly S.G., Kirpichnikova G.I., Neverov V.A. Toxoplasmosis: etiology, epidemiology, pathogenesis, clinical picture, laboratory diagnostics, prevention. [Toksoplazmoz: jetiologija, jepidemiologija, pato-genez, klinika, laboratornaja diagnostika, profilaktika. Metodicheskoe posobie]. Jelektrogorsk: ZAO "JeKOlab"; 2005. (in Russian)
6. Gracheva L.I. Toxoplasmosis problem. Pediatriya. 1999; 4: 83-6. (in Russian)
7. Holec L., Hiszczynska-Sawicka E., Gasior A., Brillowska-Dab-rowska A., Kur J. Use of MAG1 Recombinant Antigen for Diagnosis of Toxoplasma gondii Infection in Humans. Clin. Vaccine Immunol. 2007; 14(3): 220-5.
8. Robert-Gangneux F., Gavinet M.F., Ancelle T., Raymond J., Tourte-Schaefer C., Dupouy-Camet J. Value of prenatal diagnosis and early
postnatal diagnosis of congenital toxoplasmosis: retrospective study of 110 cases. J. Clin. Microbiol. 1999; 37: 2893-8.
9. Mardanly S.G., Simonov V.V., Avdonina A.S. Production of reagent kits for clinical laboratory diagnostics by immunochemical methods. [Proizvodstvo naborov reagentov dlja klinicheskoj labo-ratornoj diagnostiki immunohimicheskimi metodami]. Orekhovo-Zuevo: GGTU; 2017. (in Russian)
10. Capobiango J.D., Monica T.C., Ferreira F.P., Mitsuka-Bregano R., Navarro I.T., Garcia J.L., Reiche E.M.V. Evaluation of the Western blotting method for the diagnosis of congenital toxoplasmosis. J. Pediatr. (Rio J.). 2016; 92(6): 616-23.
11. Machado A.S., Andrade G.M.Q., Januario J.N., Fernandes M.D., Carneiro A.C.A.V, Carneiro M. et al. IgG and IgM western blot assay for diagnosis of congenital toxoplasmosis. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2010; 105(6): 757-61.
12. Magi B., Migliorini L. Western blotting for the diagnosis of congenital toxoplasmosis. New microbiologica. 2011; 34: 93-5.
13. Delibas S.B., Ertabaklar H., Ertug S. Evaluation of antigenic variations between two virulent toxoplasma strains. J. Med. Microbiol. 2006; 55: 1333-5.
14. Pfrepper K.-I., Enders G., Gohl M., Krczal D., Hlobil H., Wassenberg D., Soutschek E. Seroreactivity to and Avidity for Recombinant Antigens in Toxoplasmosis. Clin. Vaccine Immunol. 2005; 12(8): 977-82.
15. Chumpitazi B.F., Boussaid A., Pelloux H., Racinet C., Bost M, Goullier-Fleuret A. Diagnosis of congenital toxoplasmosis by im-munoblotting and relationship with other methods. J. Clin. Micro-biol. 1995; 33: 1479-85.
16. Gross U., Luder C.G., Hendgen V., Heeg C., Sauer I., Weidner A., Krczal D., Enders G. Comparative immunoglobulin G antibody profiles between mother and child (CGMC test) for early diagnosis of congenital toxoplasmosis. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 3619-22.
17. Nielsen H.V., Schmidt D.R., Petersen E. Diagnosis of Congenital Toxoplasmosis by Two-Dimensional Immunoblot Differentiation of Mother and Child Immunoglobulin G Profiles. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(2): 711-5.
18. Rilling V., Dietz K., Krczal D., Knotek F., Enders G. Evaluation of a commercial IgG/IgM Western blot assay for early postnatal diagnosis of congenital toxoplasmosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003; 22: 174-80.
19. Robert-Gangneux F., Commerce V., Tourte-Schaefer C., Dupouy-Camet J. Performance of a Western blot assay to compare mother and newborn anti-Toxoplasma antibodies for the early neonatal diagnosis of congenital toxoplasmosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1999; 18: 648-54.
20. Tissot Dupont D., Fricker-Hidalgo H., Brenier-Pinchart M.P., Bost-Bru C., Ambroise-Thomas P., Pelloux H. Usefulness of Western blot in serological follow-up of newborns suspected of congenital toxoplasmosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003; 22: 122-5.
21. Avdonina A.S., Mardanly S.G., Yuminova N.V. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay system for detecting class M antibodies to individual proteins of human cytomegalovirus by immune blotting in the "Western blot" format. Vestnik sovremennoy klinicheskoy meditsiny. 2016; 9 (5): 7-14. (in Russian)
22. Mardanly S.G., Avdonina A.S., Mardanly S.S., Shershneva N.N. Line-Blot. Meditsinskiy alfavit. 2017; 4 (38): 33-40. (in Russian)
23. Mardanly S.G., Avdonina A.S. Development of a set of reagents for detecting class G antibodies to individual rubella antigens by immune blotting in the "Western blot" format. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2018; 63 (11): 696-701. (in Russian)
24. Mardanly S.G., Avdonina A.S. Development of a set of reagents for the detection of class G antibodies to individual cytomegalovirus antigens by immune blotting in the Western Blot format. Kliniches-kaya dermatologiya i venerologiya. 2014; 1: 18-24. (in Russian)
25. Arsenyeva V.A., Amelina E.A., Mardanly S.G., Rotanov S.V. Linear immunoblotting for the simultaneous detection of antibodies to the main pathogens of the TORCH group. Meditsinskiy alfavit. 2017; 20(317): 43-8. (in Russian)
26. Antonov V.S. Questions of statistical evaluation of the results of clinical trials of medical devices for in vitro diagnostics. Available at: https://docplayer.ru/118768-Voprosy-statisticheskoy-otsenki-rez-ul'tatov-klinicheskikh-ispytaniy-meditsinskikh-izdeliy-dlya-in-vi tro-diagnostiki-antonov-vs-zamestitel-generalnogo (Accessed 28 September 2020). (in Russian)
27. Chernov V.I., Esaulenko I.E., Rodionov O.V., Semenov S.N. Medical informatics: a tutorial.[ Meditsinskaya informatika: uchebnoe posobie]. Rostov- na- Donu: Feniks; 2007. (in Russian)
28. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227: 680-5.
Поступила 03.09.20 Принята к печати 15.09.20
