CC BY
43
УДК 616.248-053.2-02-097
DOI 10.20538/1682-0363-2017-2-170-179
Для цитирования: Просекова Е.В., Ситдикова Т.С., Долгополов М.С., Турянская А.И., Сабыныч В.А., Забелина Н.Р. Иммунные механизмы реализации вирус-индуцированного и аллерген-индуцированного фенотипов бронхиальной астмы у детей. Бюллетень сибирской медицины. 2017; 16 (2): 170-179
Иммунные механизмы реализации вирус-индуцированного и аллерген-индуцированного фенотипов бронхиальной астмы у детей
Просекова Е.В.1, Ситдикова Т.С.2, Долгополов М.С.1, Турянская А.И.1, Сабыныч В.А.1, Забелина Н.Р.1
Тихоокеанский государственный медицинский университет (ТГМУ) Россия, 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2
2 Владивостокский клинико-диагностический центр Россия, 690001, г. Владивосток, ул. Спортивная, 10
РЕЗЮМЕ
Цель исследования - анализ иммунных механизмов реализации вирус-индуцированного и аллерген-индуцированного фенотипов бронхиальной астмы у детей.
Материал и методы. Проведен комплексный анализ показателей врожденного и адаптивного иммунитета у 98 детей с бронхиальной астмой (БА) в возрасте 3-11 лет в группах с вирус-индуцированным (n = 49) и аллерген-индуцированным (n = 49) фенотипами. Верификация фенотипов БА проводилась в соответствии с международным согласительным документом PRACTALL (2008). Критерии исключения из исследования: тяжелое течение БА и иммунокорригирующая терапия в предшествующие 6 мес. Оценку клеток проводили на проточном цитофлуориметре COULTER EPICS XL (Beckman Coulter Inc., США) Иммуноферментным методом определяли уровни цитокинов (реактивы R & D Diagnostics Inc., США) и IgE (реагенты «Компании Алкор Био», г. Санкт-Петербург). Для исследования продукции цитокинов использовали реагенты фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). При статистической обработке результатов использовали программу Statistica 10; исследование связей проводили с помощью метода ранговой корреляции Спирмена; уровень значимости р < 0,05.
Результаты. При БА у детей выявлено усиление экспрессии маркера активации Т-лимфоцитов HLA-DR+ (р < 0,05) при снижении CD3+CD95+ (р < 0,01), высокий уровень сывороточного IgE (р < 0,01), обратная зависимость сывороточного содержания ИНФу и IgE (r = -0,16), ИФНу и ИЛ-13 (r = -0,25), прямая зависимость ИЛ-17А и IgE (r = 0,48), IgE и ИЛ-13 (r = 0,56). При аллерген-индуцированном фенотипе БА отмечены: низкая экспрессия на клетках Т-лимфоцитов CD95+, превалирование цитокинов Th-2 профиля, высокий митоген-индуцированный синтез ИЛ-4 и низкая индукционная выработка ИФ^. При вирус-индуцированном фенотипе БА количество цитотоксических Т-лимфоцитов, натуральных киллеров, экспрессия активационных маркеров и CD95+ на Т-лимфоцитах, митоген индуцированный синтез клетками ИФ^ ниже показателей здоровых детей (при р < 0,05; р < 0,01; р < 0,05; р < 0,04; р < 0,01 соответственно). В данной группе выше, чем у детей с аллерген-индуцированным фенотипом, содержание лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов, абсолютное число Т-лимфоцитов, Т-хелперов, В-лимфоцитов (р < 0,001) и сочетанный Т^2ЛЪ-17-цитокиновый профиль сыворотки крови.
Заключение. При вирус-индуцированном фенотипе БА у детей выявлены иммуноопосредованные факторы, предрасполагающие к персистенции вирусных инфекций и инициации сенсибилизации
Н Просекова Елена Викторовна, e-mail: [email protected].
с развитием эозинофильного воспаления: нарушения клеточной цитотоксичности, преобладание цитокинов профилей и ^17, угнетение индуцированной выработки клетками крови ИФ^. У детей с реализацией аллерген-индуцированного фенотипа БА изменения в системе адаптивного реагирования характеризуются усилением пролиферации, угнетением процессов негативной регуляции, активацией синтеза цитокинов ^2-профиля, усилением синтеза IgE.
Ключевые слова: иммунные механизмы, вирус-индуцированный, аллерген-индуцированный фенотипы, бронхиальная астма, дети.
ВВЕДЕНИЕ
Широкая распространенность у детей, хронический характер воспаления при патофизиологической и клинической гетерогенности определяют актуальность изучения биологических маркеров фенотипов бронхиальной астмы (БА) для подбора патогенетически обоснованной базисной терапии [1—5]. Клинические фенотипы бронхиальной астмы разделяются на подгруппы в зависимости от преобладающего направления иммунного ответа. Биомаркерами эндотипов бронхиальной астмы являются цитокины, регулирующие иммунный ответ по профилю Т-лимфоцитов хелперов (ТЬ-1, ТЬ-2, ТЬ-17) [5-8]. В спектре характеристик воспаления, определяющих фенотип заболевания, учитывается активность цитокинов и функциональные изменения интерферон-продуцирующих клеток, влияющих на эффективность противовоспалительной терапии различных фенотипов БА у детей. Иммунная реакция организма на антигены инфекционной и неинфекционной природы определяется процессами пролиферации, дифференцировки и программированной гибели лимфоцитов. Эффекторные свойства иммуноком-петентные клетки реализуют через синтез различных цитокинов [9-12].
Цель исследования - анализ иммунных механизмов реализации вирус-индуцированного и ал-лерген-индуцированного фенотипов бронхиальной астмы у детей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование включены 98 детей (в возрасте 3-11 лет) с верифицированным диагнозом ви-рус-индуцированного (п = 49) и аллерген-инду-цированного (п = 49) фенотипов бронхиальной астмы с легким (10,22%) и средней степени тяжести (89,78%) клиническим течением болезни в межприступный период, прошедшие обследование, находящиеся на диспансерном наблюдении в городском аллерго-респираторном центре и 30 здоровых сверстников, наблюдавшихся в центре здоровья Владивостокского клинико-диагностического центра. Верификация фенотипов
БА проводилась в соответствии с рекомендациями международного согласительного документа P RA CT ALL (2008) European Academy of Allergy and Clinical Immunology and the American Academy of Allergy по результатам наследственного анамнеза, анамнеза заболевания, аллергологического обследования (скарификационные пробы, определение общего и специфического IgE к бытовым, эпидермальным, пыльцевым аллергенам в сыворотке крови), цитологического исследования мокроты и назального секрета и ПЦР-анали-за выявления РНК и ДНК вирусов в соскобе со слизистой зева (респираторно-синцитиального, парагриппа, аденовируса, риновируса, ВЭБ, цито-мегаловируса). Критериями исключения из исследования являлись тяжелое течение бронхиальной астмы и применение иммунокорригирующих препаратов в предшествующие 6 мес. Клинико-лабо-раторное обследование осуществляли на кафедре клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии Тихоокеанского государственного медицинского университета и в иммунологической лаборатории краевого клинического центра по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями Краевой клинической больницы № 2 (г. Владивосток).
Материалом исследования иммунологических параметров являлась венозная кровь. Анализ лейкоцитов, субпопуляционного состава лимфоцитов, процессов активации клеток периферической крови проводили с помощью многопараме-трового проточного цитофлуориметра COULTER EPICS XL (Beckman Coulter Inc., США), станции для подготовки проб Coulter Prep Plus и Coulter TO-prer с подбором панелей моноклональных антител с многоцветной комбинацией флуорохро-мов. Для иммунофенотипирования использовали флуоресцентные частицы Flow Count. Определяли Т-клетки, Т-хелперы, Т-цитотоксические, регуляторный индекс, В-клетки, натуральные киллеры (NK-клетки), цитолитические Т-клетки (NKT-клетки) и активированные Т- и В-клетки (CD3+CD19-, CD3+CD95+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, СД4+СД8+, CD3-CD19+, CD3- CD16+ CD56+, CD3+
CD16+ CD56+, CD3+CD25+, CD3+HLA-DR+, CD3-HLA-DR+). Результаты представлены в абсолютных и относительных (%) единицах количества позитивных клеток с учетом данных клинического анализа крови.
Уровни интерлейкинов (ИЛ) 4, 6, 8, 13, 17А и интерферона-гамма (ИФ^) в сыворотке крови исследовали в сэндвич-варианте твердофазного иммуноферментного анализа реактивами фирмы R & D Diagnostics Inc. (США) согласно прилагаемой инструкции с учетом результатов на иммуно-ферментном анализаторе и расчетом построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы (в пикограммах в миллилитре, пг/мл). Спонтанную и митоген-индуцированную продукцию ИЛ-4 и ИФНY клетками цельной крови исследовали с применением набора реагентов «ЦИ-ТОКИН-СТИМУЛ-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Содержание общего и специфического IgE исследовали методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов ООО «Компания Алкор Био» (г. Санкт-Петербург) и выражали в ME/мл.
Для статистической обработки цифровых данных использовали методы описательной, параметрической и непараметрической статистики
программы 10 для вычисления средней
арифметической (М), среднего квадратичного отклонения (о), средней ошибки средней арифметической (от), доверительного интервала (ДИ 95-99%), коэффициента достоверности показателя (^ и различий (р) с критическим уровнем значимости р < 0,05. Для исследования связей проводили корреляционный анализ, рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). Проверку нормальности распределения значений признака осуществляли с помощью критерия Шапиро - Уилка. Частотное распределение данных в каждой из сравниваемых групп соответствовало закону нормального распределения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У детей с бронхиальной астмой по сравнению со здоровыми сверстниками выявлены: сопоставимая обеспеченность лейкоцитами и натуральными киллерами, преобладание гранулоцитов, снижение абсолютного числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов, усиление экспрессии активационных маркеров, ответственных за инициацию иммунного ответа (С03+С025+) и раннюю активацию процессов пролиферации Т-лимфоцитов, низкое абсолютное число В-лимфоцитов (табл. 1).
Т а б л и ц а 1
Показатели иммунокомпетентных клеток в периферической крови детей с бронхиальной астмой (БА) и здоровых сверстников
№ Показатель Ед. измерения Здоровые дети, n = 30 Дети с БА, n = 98 t (Р)
M ± m ДИ M ± m ДИ
1. Лейкоциты 109/л 7,32 ± 0,30 6,82-7,82 7,47 ± 0,31 6,96-7,97 0,35 (>0,05)
2 Лимфоциты % 44,39 ± 1,74 41,51-47,27 37,10 ± 1,65 34,36-39,83 3,05 (<0,01)
109/л 3,37 ± 0,18 3,08-3,66 2,78 ± 0,16 2,52-3,06 2,53 (<0,05)
3. Гранулоциты, % 46,26 ± 1,16 44,33-48,18 53,34 ± 2,04 51,95-58,73 3,87 (р<0,001)
109/л 3,48 ± 0,19 3,15-3,81 4,11 ± 0,21 3,74-4,47 2,12 (<0,05)
4. Т-лимфоциты CD3+CD19- % 71,26 ± 1,15 69,34-73,17 71,08 ± 0,84 69,68-72,47 0,13 ( >0,05)
кл/мкл 2356,90 ± 126,95 2146,17-2567,65 1929,64 ± 120,94 1728,87-2130,40 2,44 (<0,05)
5. Т-хелперы CD3+CD4+ % 39,91 ± 1,37 37,64-42,18 36,05 ± 1,29 33,95-38,15 2,075 (0,05)
кл/мкл 1335,91 ± 93,51 1180,68-1491,13 969,91 ± 60,66 869,21-1070,61 3,28 (<0,01)
6. Т-цитотоксические CD3+CD8+ % 27,22 ± 1,24 25,16-29,27 29,31 ± 1,22 27,28-31,33 1,20 (>0,05)
кл/мкл 893,73 ± 55,73 801,22-986,23 809,91 ± 70,47 692,94-926,88 0,93 (>0,05)
7. Т-лимфоциты активированные CD3+CD25+ % 4,38 ± 0,24 4,08-5,21 6,97 ± 0,41 6,28-7,65 3,19 (<0,01)
кл/мкл 137,45 ± 4,67 131,65-144,79 189,14 ± 16,06 162,48-215,79 3,95 (<0,01)
8. В-лимфоциты CD3-CD19+ % 16,49 ± 0,91 14,99-17,99 15,30 ± 0,75 14,05-16,55 1,01 (>0,05)
кл/мкл 548,59 ± 41,31 480,02-617,16 420,36 ± 36,98 358,97-481,75 2,31 (<0,05)
9. Цитолитические NK-клетки CD3-/CD16+/CD56+ % 11,10 ± 1,20 9,09-13,10 11,70 ± 0,96 10,11-13,29 0,39 (>0,05)
кл/мкл 363,50 ± 42,42 293,09-433,91 310,41 ± 28,24 263,54-357,28 1,04 (>0,05)
10. Цитолитические NKT- клетки CD3+/CD16+/CD56+ % 6,71 ± 0,65 5,63-7,79 6,49 ± 0,64 5,43-7,56 0,23 (>0,05)
кл/мкл 211,36 ± 18,78 180,19-242,54 180,77 ± 23,02 142,57-218,99 1,03 (>0,05)
При БА у детей определено усиление экспрессии маркера активации Т-лимфоцитов, участвующих в регуляции распознавания и эффекторных этапах иммунного ответа ИЬЛ-ОК+ ((4,09 ± 0,20)% и (104,14 ± 14,02) кл/мкл против (2,07 ± 0,2з)% и (75,70 ± 12,20) кл/мкл в группе здоровых сверстников соответственно при р < 0,05), количество С03+С095+-лимфоцитов достоверно ниже, чем в группе здоровых сверстников ((2,65 ± 0,35)% против (6,12 ± 0,28)% соответственно р < 0,01). У детей с бронхиальной астмой выявлено увеличение содержания сывороточного 1§Е ((314,80 ± 28,25) МЕ/мл, ДИ (308,62-444,66) МЕ/мл против (53,60 ± 16,17) МЕ/мл, ДИ (26,75-80,46) МЕ/мл в группе здоровых сверстников соответственно при р < 0,01).
Исследования цитокинового профиля сыворотки крови у детей с БА выявили: содержание ИФ^ (15,73 ± 1,66 ) пг/мл в ДИ 12,64-18,77 пг/мл, ИЛ-4 (24,80 ± 1,77) пг/мл в Ди 23,53-26,08 пг/мл, ИЛ-6 (8,70 ± 1,68) пг/мл в Ди 7,05-12,76 пг/мл, ИЛ-8 (31,63 ± 2,76) пг/мл в Ди 27,04-36,01 пг/мл, ИЛ-13 (22,57 ± 0,74) пг/мл в Ди 21,34-23,80 пг/мл, ИЛ-17А (143,74 ± 9,66) пг/мл в ДИ 112,37-172,43 пг/мл. В группе здоровых сверстников данные показатели составили соответственно: ИФНY (38,60 ± 3,46) пг/мл в ДИ 29,31-54,35 пг/мл; ИЛ-4 (2,55 ± 0,8) пг/мл в ДИ 1,99-3,25 пг/мл; ИЛ-6 (3,70 ± 0,80) пг/мл в Ди 1,85-4,95 пг/мл; ИЛ-8 (10,92 ± 1,00) пг/мл в Ди 9,26-12,58 пг/мл; ИЛ-13 (8,01 ± 1,6) пг/мл в ДИ 6,58-13,16 пг/мл; ИЛ-17А (48,40 ± 4,65) пг/мл в ДИ 40,67-56,13 пг/мл при
р < 0,01. Проведенные исследования при БА у детей в сыворотке крови выявили слабую обратную корреляционную зависимость содержания ИНФу и 1§Е (г = -0,16), прямую средней силы корреляционную зависимость уровня ИЛ-17А и общего 1§Е (г = 0,48), прямую корреляционную зависимость содержания 1§Е и ИЛ-13 (г = 0,56) и обратную зависимость концентрации ИФНу и ИЛ-13 (г = -0,25).
Определение функциональной активности ИФНу и ИЛ-4 продуцирующих клеток зафиксировало средние показатели их спонтанной продукции клетками крови у детей с БА на уровне (8,97 ± 0,78) пг/мл и (4,72 ± 0,35) пг/мл, здоровых сверстников (11,70 ± 0,88) пг/мл и (1,72 ± 0,07) пг/мл соответственно при р < 0,001. Среди здоровых детей у 29 из 30 отмечались адекватный ответ на митоген, увеличение продукции и индукция секреции ИФ^ (ДИ 18,21-35,47 пг/мл) и у 21 ребенка из 98 с БА (ДИ 7,42-10,44 пг/мл). Увеличение продукции и индукция секреции ИЛ-4 на митоген наблюдались у 10 здоровых детей (ДИ 6,31-9,15 пг/мл) и 95 детей с БА (ДИ 16,9219,71 пг/мл).
Результаты исследования механизмов врожденного и адаптивного иммунного ответа у детей с вирус-индуцированным и аллерген-инду-цированным фенотипами бронхиальной астмы выявили вариативность функциональных и количественных характеристик иммунокомпетентных клеток (табл. 2) и цитокинового профиля у детей с различными фенотипами болезни.
Т а б л и ц а 2
Показатели иммунокомпетентных клеток в периферической крови детей с вирус-индуцированным и аллерген-индуцированным фенотипами бронхиальной астмы
№ Показатель Ед. измерения Дети с вирус-индуцированной БА (п = 49) Дети с аллерген-индуцированной БА (п = 49) t (р)
М ± т ДИ М ± т ДИ
1. Лейкоциты 10'/л 10,73 ± 0,59 9,70-11,76 7,39 ± 0,13 6,89-7,90 4,74 (<0,001)
2. Лимфоциты % 37,21 ± 1,65 34,47-39,94 40,38 ± 1,90 37,23-43,54 1,26 (>0,05)
10'/л 3,74 ± 0,18 3,43-4,06 2,70 ± 0,19 2,48-3,01 3,95 (<0,001)
3. Гранулоциты % 57,84 ± 1,78 54,88-60,79 54,98 ± 1,94 50,76-58,20 1,01 (>0,05)
10'/л 5,23 ± 0,50 4,39-6,07 4,08 ± 0,26 3,59-4,38 2,04 (<0,05)
4. Т-лимфоциты СЭ3+С019- % 72,31 ± 1,07 70,53-74,08 71,03 ± 0,90 69,53-72,94 0,91 (>0,05)
кл/мкл 2596,75±128,07 2384,15-2809,35 1902,83 ± 112,39 1716,26-2089,41 4,072 (<0,001)
5. Т-хелперы СЭ3+С04+ % 44,01 ± 1,08 42,22-45,80 35,47 ± 1,23 33,44-37,50 5,22 (<0,001)
кл/мкл 1425,83 ± 94,28 1269,33-1582,34 953,42 ± 58,12 856,92-1049,91 4,26 (<0,001)
6. Т-цитотоксические СЭ3+С08+ % 25,35 ± 0,94 23,78-26,91 28,39 ± 1,09 26,58-30,28 2,11 (<0,05)
кл/мкл 727,17 ± 64,15 620,67-833,66 799,42 ± 65,03 691,47-907,36 0,79 (>0,05)
7. Т-лимфоциты активированные СЭ3+СШ5+ % 6,13 ± 0,29 5,64-6,61 6,97 ± 0,41 6,28-7,65 1,66 (>0,05)
кл/мкл 204,00 ± 14,67 179,65-228,35 189,14 ± 16,06 162,48-215,79 0,68 (>0,05)
8. В-лимфоциты СЭ3-С019+ % 17,53 ± 0,75 16,29-18,78 15,23 ± 0,69 14,05-16,41 2,23 (<0,05)
кл/мкл 616,92 ± 41,04 548,78-685,05 412,92 ± 34,35 355,89-469,93 3,81 (<0,001)
О к о н ч а н и е т а б л. 2
№ Показатель Ед. изме- Дети с вирус-индуцированной БА (п = 49) Дети с аллерген-индуцированной БА (п = 49) t (р)
М ± т ДИ М ± т ДИ
Цитолитические МК-клетки СЭ3-/С016+/С056+ % 8,27 ± 0,35 7,69-8,85 12,93 ± 0,92 10,39-13,47 3,70 (<0,001)
кл/мкл 261,70 ± 10,90 243,58-279,84 327,04 ± 12,87 274,43-365,60 2,37 (<0,05)
10. Цитолитические % 4,61 ± 0,23 4,13-5,09 6,37 ± 0,60 5,37-7,36 2,62 (<0,05)
МКТ-клетки СЭ3+/С016+/С056+ кл/мкл 157,25 ± 9,39 130,04-185,29 178,92 ± 11,53 143,77-213,66 0,78 (>0,05)
У детей с вирус-индуцированным фенотипом БА в периферической крови содержание лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов, абсолютное число Т-лимфоцитов (С03+СШ9-), Т-хелперов (С03+С04+) и В-лимфоцитов (СО3-СШ9+) достоверно выше (р < 0,001), чем у детей с аллерген-ин-дуцированным фенотипом болезни (см. табл. 2). В данной группе у детей абсолютное число Т-лим-фоцитов с цитотоксическими функциями, натуральных киллеров и показатели экспрессии акти-вационных маркеров (С03+ИЬЛ-0К+) достоверно ниже показателей здоровых детей (при р < 0,05; р < 0,01; р < 0,05 соответственно, см. табл. 1, 2) в сочетании с низкой экспрессией на клетках Т-лимфоцитов СЭ95+ (2,76 ± 0,32)% (у здоровых (6,12 ± 0,28)% при р < 0,01).
У детей с реализацией аллерген-индуциро-ванного фенотипа БА в периферической крови показатели содержания лейкоцитов, гранулоци-тов, цитотоксических Т-лимфоцитов и цитоли-тических клеток (МК-клетки МК-клетки С03+/СШ6+/С056+) сопоставимы с данными здоровых сверстников (см. табл. 1, 2), при низкой экспрессии на клетках Т-лимфоцитов СЭ95+ (2,54 ± 0,28)% (у здоровых (6,12 ± 0,28)% при р < 0,01).
Показатели цитокинового спектра сыворотки крови детей с вирус-индуцированным фенотипом бронхиальной астмы составляли: ИФНY (14,32 ±
1.22) пг/мл в ДИ 12,29-16,33 пг/мл; ИЛ-4 (18,60 ± 1,60) пг/мл в ДИ 16,83-23,16 пг/мл; ИЛ-6 (12,76 ± 1,27) пг/мл в Ди 10,03-14,86 пг/мл; ИЛ-8(34,55 ±
2.23) пг/мл в Ди 30,843-8,26 пг/мл; ИЛ-13 (20,97 ± 0,94) пг/мл в Ди 16,98-22,80 пг/мл.
У детей с реализацией аллерген-индуцирован-ного фенотипа БА показатели сывороточного содержания цитокинов составляли: ИФНY (19,31 ± ± 1,92) пг/мл в ДИ 16,13-22,50 пг/мл; ИЛ-4 (30,83 ± ± 0,58) пг/мл в Ди 29,87-31,79 пг/мл; ИЛ-6 (5,85 ± ± 1,40) пг/мл в Ди 4,15-9,96 пг/мл; ИЛ-8 (22,43 ± ± 2,30) пг/мл в ДИ 19,15-26,45 пг/мл; ИЛ-13 (31,93 ± 0,92) пг/мл в ДИ 30,40-33,46 пг/мл.
Исследования цитокин-продуцирующей активности клеток крови определили показатели спонтанной продукции ИФНY и ИЛ-4 на уровне (4,75 ± 0,45) пг/мл и (1,69 ± 0,09) пг/мл у детей с вирус-индуцированным фенотипом БА и (11,38 ± ± 2,42) пг/мл и (1,76 ± 0,08) пг/мл при аллерген-индуцированном. После индукции митогеном показатели ИФНY и ИЛ-4 у детей с вирус-индуцированным фенотипом БА составили (4,54 ± ± 0,39) пг/мл и (10,5 ± 1,8) пг/мл и при аллерген-индуцированном (22,54 ± 2,77) пг/мл и (27,64 ± ± 2,2) пг/мл соответственно.
Мониторинг содержания ИЛ-17А в сыворотке крови зафиксировал высокие уровни у детей с БА при вирус-индуцированном - (152,73 ± ± 12,32) пг/мл в ДИ 115,87-188,65 пг/мл и аллерген-индуцированном фенотипе болезни -(112,37 ± 12,94) пг/мл в ДИ 79,70-117,81 пг/мл при р < 0,01 соответственно. В обеих подгруппах не было значимых различий в показателях сывороточного содержания общего 1§Е (ДИ 280,81-457,74 МЕ/мл и 297,15-426,43 МЕ/мл при р > 0,05). Среднее содержание специфического (к бытовым и эпидермальным аллергенам) 1§Е в сыворотке крови у детей с аллерген-индуци-рованным фенотипом составляло (22,57 ± 2,72) МЕ/мл и (0,53 ± 0,04) МЕ/мл у детей с вирус-индуцированным фенотипом.
ОБСУЖДЕНИЕ
Клеточные популяции иммунной системы человека высокочувствительны и отражают реакции организма на негативное воздействие средовых физиологических или патологических факторов, активацию или истощение иммунной системы [9-12]. Цитотоксическим Т-лимфоцитам с фенотипом С03+С08+ принадлежит ведущая роль в специфической защите организма от внутриклеточных патогенов и собственных измененных клеток [12, 13]. Эффекторные свойства цитоток-сические Т-лимфоциты реализуют через синтез цитокинов, секреторную дегрануляцию и высво-
бождение перфорина и гранзимов, определяются уровнем зрелости или стадией дифференцировки клетки [10, 11, 13]. Пролиферативный потенциал цитотоксических Т-лимфоцитов обеспечивается высокой плотностью мембранных рецепторов к ИЛ-2 (CD25) [14]. Интенсивность иммунных реакций, процессов пролиферации, миграции и дифференцировки клеток, нормальное функционирование иммунной системы обеспечиваются балансом продукции и акцепции цитокинов, образующих цитокиновую сеть. Исследования последних лет зафиксировали дисбаланс в системе интерферонов, функциональные изменения ин-терферон-продуцирующих клеток, влияющих на эффективность противовоспалительной терапии различных фенотипов БА у детей [2, 3, 5, 6, 15]. Интерлейкины 4, 13 и 17А оппозиционно с ИНФу поддерживают баланс Thl/Th2/Th17, регулируют апоптоз нормальных, инфицированных и трансформированных клеток, обеспечивают иммуно-регуляторный, противовирусный и антипролифе-ративный эффекты [2, 4, 6, 15].
C. Doe с соавт. (2010) отметили, что ИЛ-17А не ассоциирован с нейтрофильным воспалением, а усиливает эозинофильное воспаление дыхательных путей, опосредованное Th-2, у пациентов с бронхиальной астмой [16]. I. Agache с соавт. (2010) выявили, что повышенный уровень сывороточного ИЛ-17 является независимым фактором риска тяжелой астмы [17]. Цитокины Th-2-клеток ИЛ-4 и ИЛ-13 регулируют синтез IgE, и при моделировании астмы на животных выявлена способность ИЛ-5 и ИЛ-17 привлекать эози-нофилы в дыхательные пути. A. Mubeccel (2013) отметил, что выявленное у людей сочетанное участие лимфоцитов Th-2 и Th-17 в реализации бронхиальной астмы более значимо по сравнению с вовлечением только Th-2-клеток [18]. Вирусные и бактериальные инфекции могут индуцировать развитие бронхиальной астмы через активацию клеток врожденного (макрофаги, естественные киллеры) и адаптивного иммунитета Th-1 и Th-17. Клетки Th-17 и продуцируемые ими цитокины задействованы в защите от инфекционных агентов, и выявлено их участие в развитии хронического воспаления при БА [8, 15, 18]. Маркер поздней и длительной активации клеток HLA-DR, его экспрессия наиболее полно отражают активационное состояние клеток [9]. Проведенные исследования отметили усиление экспрессии активационных маркеров регуляции распознавания антигенов, запуска и реализации иммунного ответа, пролиферации и дифференцировки лимфоцитов у детей с бронхиальной астмой по сравнению со здоровыми
сверстниками и вариативность показателей активации, пролиферации и регуляции эффекторных реакций иммуногенеза у детей с реализацией различных фенотипов болезни.
Исследования показателей врожденного и адаптивного иммунного ответа у детей с вирус-ин-дуцированным фенотипом БА выявили снижение абсолютного числа Т-лимфоцитов с цитотокси-ческими функциями, экспрессию активационных маркеров (С03+ИЬЛ-0К+) в сочетании с низкой экспрессией молекулы СЭ95+ на Т-лимфоцитах (участвующей в поддержании клонального баланса лимфоидных клеток и предотвращении избыточной активации иммунной системы), дефицит ]МК- и ]МКТ-клеток, активацию синтеза ци-токинов профиля ТЬ-2 и ТЬ-17, угнетение индукционного потенциала синтеза клетками ИФНу с регуляторным коэффициентом КИФНу/,Ид 4 = 2,06 ± ± 0,19. У детей с аллерген-индуцированным фенотипом БА определены снижение абсолютного числа лимфоцитов, Т-лимфоцитов, усиление экспрессии активационных маркеров инициации иммунного ответа (СЭ25+) и эффекторного реагирования (ИЬЛ-ЭК+), низкое обеспечение ]МК-клеток при сохранении числа ]МКТ-клеток на уровне здоровых сверстников, активация синтеза цитокинов ТЬ-2 (КИФНу/ИЛ_4 = 1,08 ± 0,09) с высоким ответом выработки ИЛ-4 на митоген и низким уровнем индукционной выработки ИФНY клетками периферической крови.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования отметили усиление экспрессии активационных маркеров регуляции распознавания антигенов, запуска и реализации иммунного ответа, пролиферации и дифференцировки лимфоцитов у детей с бронхиальной астмой по сравнению со здоровыми сверстниками и различия показателей врожденного и адаптивного иммунного ответа у детей с реализацией вирус-индуцированного и аллерген-инду-цированного фенотипов болезни. При вирус-ин-дуцированном фенотипе БА у детей выявлены количественные и функциональные нарушения клеточной цитотоксичности, высокое содержание цитокинов профилей ТЬ2 и ТЬ17 (интерлей-кины 4, 6, 8, 13, 17А) в сыворотке крови, угнетение индуцированной выработки ИФНY клетками крови, что можно отнести к факторам, предрасполагающим к длительной персистенции вирусных инфекций в дыхательных путях и инициации сенсибилизации организма с развитием эози-нофильного воспаления. У детей с реализацией аллерген-индуцированного фенотипа показатели
противовирусного иммунитета соответствуют возрастной норме, отмечены активация синтеза цитокинов Tf^-профиля, снижение регуляторно-го коэффициента КИфНу/ИД 4, изменения в системе адаптивного реагирования с усилением пролиферации, угнетением процессов негативной регуляции, высокий синтез IgE.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ И ВКЛАД АВТОРОВ
Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи, и сообщают о вкладе авторов. Просекова Е.В. - разработка концепции и дизайна исследования, интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания, внесение принципиальных изменений, окончательное утверждение версии, которая сдается в печать. Ситдикова T.C. -разработка дизайна исследования, анализ и интерпретация данных. Долгополов М.С. - подготовка текста статьи, проверка критически важного интеллектуального содержания. Tурян-ская А.И. - анализ и интерпретация данных. Сабыныч В.А. - обоснование рукописи, проверка критически важного интеллектуального содержания. Забелина Н.Р. - подготовка текста статьи.
ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ
Авторы заявляют об отсутствии финансирования при проведении исследования.
СООТВЕТСТВИЕ ПРИНЦИПАМ ЭТИКИ
Клиническое исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Дизайн исследования одобрен междисциплинарным комитетом по этике Tихоокеанского государственного медицинского университета (протоколы № 7 от 23.06.2014 г., № 8 от 24.04.2015 г.)
ЛИТЕРАТУРА
1. Bacharier L., Boner B.A., Carlsen K.-H. et al. The European Pediatric Asthma Group Diagnosis and treatment of asthma in childhood: a PRACTALL consensus report // Allergy. 2008; 63: 5-34.
2. Agache С., Akdis C., Jutel M., Virchov J. S. Untangling asthma phenotypes and endotypes // European J. of Allergy and Clinical Immunology. 2012; 67: 835-846.
3. Wenzel S. Phenotypes & endotypes: emerging concepts on asthma heterogeneity // Global atlas of Asthma. 2013; 34-36.
4. Курбачева О.М., Павлова К.С. Фенотипы и эндо-типы бронхиальной астмы: от патогенеза и клинической картины к выбору терапии // Российский аллергологический журнал. 2013; 1: 15-24.
5. Мицкевич С.Э. Фенотипы бронхиальной астмы у детей и дифференцированная тактика диагностики и лечения // Вестник Челябинского государственного университета. 2014; 4 (333): 79-85.
6. Fitzpatrick A.M., Baena-Cagnani C.E., Bacharier L.B. Severe Asthma in Childhood: Recent Advances in Phenotyp-ing and Pathogenesis // Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 2012; 12 (2): 193-201.
7. Poulsen L.K. Cytokines in allergy // Global Atlas of Allergy. 2014; 69-71.
8. Willem van de Veen., Mubeccel Akdis. Mechanisms of immune regulation in allergy // Global Atlas of Allergy. 2014; 90-91.
9. Литвинова Л.С., Гуцол А.А., Сохоневич Н.А., Кофано-ва К.А., Хазиахматова О.Г., Шуплецова В.В., Кайгоро-дова Е.В., Гончаров А.Г. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Т-лимфоцитов // Медицинская иммунология.. 2014; 16 (1): 7-26.
10. Кудрявцев И.В., Борисов А.Г., Волков А.Е., Савченко А.А., Серебрякова М.К., Полевщиков А.В. Анализ уровня экспрессии CD56 и CD57 цитотоксическими Т-лимфоцитами различного уровня дифференцировки // Тихоокеанский медицинский журнал. 2015; 2: 30-35.
11. Троценко А.А. Особенности формирования иммунитета на разных этапах жизненного цикла человека // Международный научно-исследовательский журнал. 2015; 6-2 (37): 40-42. DOI: 10.18454/IRJ.2227-6017.
12. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010: 752.
13. Кудрявцев И.В., Борисов А.Г., Кробинец И.И., Савченко А.А., Серебрякова М.К. Определение основных субпопуляций цитотоксических Т-лимфоцитов методом многоцветной проточной цитометрии // Медицинская иммунология. 2015; 17 (6): 525-538.
14. Clausen J., Vergeiner B., Enk M., Petzer A.L., Gastl G., Gunsilius E. Functional significance of the activation-associated receptor СD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells // Immunobiology. 2003; 207 (2): 85-93.
15. Cezmi A. Akdis. Global atlas of asthma. Switzerland: Published by the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, 2013: 2-179.
16. Doe C., Bafahel M., Siddiqui S. et al. Expression of the T-helper 17-associated cytokines IL-17A and IL-17F in asthma and COPD // CHEST. 2010; 138 (5): 1140-1147.
17. Agache I., Ciobanu C., Agache C., Anghel M. Increased serum IL-17 is an independent risk factor for severe asthma // Respiratory Medicine. 2010; 104: 1131-1137.
18. Mubeccel A. The pathogenesis of astma// Global atlas of asthma. 2013; 28-30.
Поступила в редакцию 07.03.2017 Утверждена к печати 10.05.2017
Просекова Елена Викторовна, д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, ТГМУ, г. Владивосток.
Ситдикова Татьяна Сергеевна, врач аллерголог-иммунолог, зав. отделением, Владивостокский клинико-диагностический центр, г. Владивосток.
Долгополов Максим Сергеевич, ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, аспирант, ТГМУ, г. Владивосток.
Турянская Алина Ивановна, ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, аспирант, ТГМУ, г. Владивосток.
Сабыныч Виталий Александрович, канд. мед. наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, ТГМУ, г. Владивосток.
Забелина Наталья Робертовна, канд. мед наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, ТГМУ, г. Владивосток.
(*) Просекова Елена Викторовна, e-mail: [email protected].
УДК 616.248-053.2-02-097
DOI 10.20538/1682-0363-2017-2-170-179
For citation: Prosekova E.V., Sitdikova T.S., Dolgopolov M.S., Turyanskya A.I., Sabynych V.A., Zabelina N.R. Parameters of innate and adaptive immune response in children with virus-induced and allergen-induced bronchial asthma phenotypes. Bulletin of Siberian Medicine. 2017; 16 (2): 170-179
Parameters of innate and adaptive immune response in children with virus-induced and allergen-induced bronchial asthma phenotypes
Prosekova E.V.1, Sitdikova T.S.2, Dolgopolov M.S.1, Turyanskya A.I.1, Sabynych V.A.1, Zabelina N.R.1
1 Pacific State Medical University
2, Ostryakova Av, Vladivostok, 690002, Russian Federation
2 Vladivostok Clinical and Diagnostic Centre
10, Sportivnaya Str, Vladivostok, 690001, Russian Federation
ABSTRACT
Aim. To analyze the immune mechanisms of activation of virus-induced and allergen-induced bronchial asthma phenotypes in children.
Materials and мethods. We have performed an integrated assessment of parameters of innate and acquired immunity in 98 children with bronchial asthma (BA) at the age of 3-11 years in groups with virus-induced (n = 49) and allergen-induced (n = 49) phenotypes. Bronchial asthma phenotypes were verified in accordance with PRACTALL international consensus report (2008). Study exclusion criteria were: severe course of bronchial asthma and application of immunocorrecting drugs during preceding six months. To analyze immune competent cells we used flow cytofluorometer COULTER EPICS XL by Beckman Coulter Inc. Cytokine levels were identified using immunoenzyme method and reagents by R & D Diagnostics Inc. (USA); IgE - using reagents by Alkor Bio company (Saint-Petersburg); production of cytokines - using reagents by Vektor-Best (Novosibirsk city). Statistical processing of data was performed by Statistica. 10 program with critical significance level p < 0,05, correlations were analyzed using Spearman rank correlation coefficient.
Results. Children with bronchial asthma showed enhanced expression of T-lymphocyte activation marker HLA-DR+(p < 0,05) with reduced level of CD3+CD95+- (р < 0,01), high level of serum IgE (р < 0,01), the inverse correlation between serum levels of IFNy and IgE (r = -0,16), IFNy and IL-13 (r = -0,25), direct correlation between IL-17A and IgE (r = 0,48), IgE and IL-13 (r = 0,56). The children with allergen-induced BA phenotype showed low expression of CD95+ on T-lymphocyte cells, predominance of Th-2 profile cytokines, high mitogen-induced production of IL-4 and low induction of IFNy production. Levels of cytotoxic T-lymphocytes, natural killers, expression of activation markers and CD95+ on T-lymphocyte
cells and mitogen-induced synthesis of IFNy by cells in children with virus-induced BA phenotype were lower than the same indices in healthy children (at p < 0,05; p < 0,01; p < 0,05; p < 0,01; p < 0,01). Levels of leucocytes, neutrocytes, absolute number of T-lymphocytes, T-helpers, B-lymphocytes (p < 0,001) and Th-2 -Th-17 cytokine profile in blood serum in this group were higher than the same indices in children with allergen-induced phenotype.
Conclusion. Children with virus-induced BA phenotype showed presence of immune-mediated factors predisposing them to persistent viral infections and initiation of body sensibilization with development of eosinophilic inflammation, such as impairment of cellular cytotoxicity, predominance of Th-2 - Th-17 profile cytokines, inhibition of induction of IFNy production by blood cells. The changes of thr adaptive response system in children with activation of allergen-induced BA phenotype are characterized by enhanced proliferation, inhibition of negative regulation processes, activation of synthesis of Th2 profile cytokines, and enhanced synthesis of IgE.
Key words: immune mechanisms, virus-induced, allergen-induced phenotypes, bronchial asthma, children.
REFERENCES
1. Bacharier L., Boner B.A., Carlsen K.-H. et al. The European Pediatric Asthma Group Diagnosis and treatment of asthma in childhood: a PRACTALL consensus report // Allergy. 2008; 63: 5-34.
2. Agache С., Akdis C., Jutel M., Virchov J. S. Untangling asthma phenotypes and endotypes // European J. of Allergy and Clinical Immunology. 2012; 67: 835-846.
3. Wenzel S. Phenotypes & endotypes: emerging concepts on asthma heterogeneity // Global atlas of Asthma. 2013; 34-36.
4. Kurbacheva O.M., Pavlova K.S. Fenotipy i endoti-py bronkhial'noy asthmy: ot patogeneza i klinicheskoy kartiny k vyboru terapii [Phenotypes and endotypes of bronchial asthma: from pathogenesis and clinical features to therapy] // Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal -Russian Allergology Journal. 2013; 1: 15-24 (in Russian).
5. Mitskevich S.E. Fenotipy bronkhial'noy asthmy u detey i differentsirovannaya taktika diagnostiki i lecheniya [Asthma phenotypes in children and differential tactic of diagnostic and treatment] // Vestnik Chelyabinskogo go-sudarstvennogo universiteta. - Bulletin of Chelyabinsk State University. 2014; 4 (333): 79-85 (in Russian).
6. Fitzpatrick A.M., Baena-Cagnani C.E., Bacharier L.B. Severe Asthma in Childhood: Recent Advances in Phenotyp-ing and Pathogenesis // Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 2012; 12 (2): 193-201.
7. Poulsen L.K. Cytokines in allergy // Global Atlas of Allergy. 2014; 69-71.
8. Willem van de Veen., Mubeccel Akdis. Mechanisms of immune regulation in allergy // Global Atlas of Allergy. 2014; 90-91.
9. Litvinova L.S., Gutsol A.A., Sokhonevich N.A., Kofano-va K.A., Khaziakhmatova O.G., Shupletsova V.V., Kay-gorodova E.V., Goncharov A.G. Osnovnye poverkhnos-tnye markery funktsional'noy aktivnosti T-limfotsitov [Basic surface markers of functional activity T-lympho-cytes] // Meditsinskaya immunologiya - Medical Immunology. 2014; 16 (1): 7-26 (in Russian).
10. Kudryavtsev I.V., Borisov A.G., Volkov A.E., Savchen-ko A.A., Serebryakova M.K., Polevshchikov A.V. Analiz urovnya ekspressii CD56 i CD57 tsitotoksicheskimi T-lim-fotsitami razlichnogo urovnya differentsirovki [CD56 and CD57 expression by distinct populations of human cytotoxic T lymphocytes] // Tikhookeanskiy meditsinskiy zhurnal - Pacific Medical Journal. 2015; 2: 30-35 (in Russian).
11. Trotsenko A.A. Osobennosti formirovaniya immuniteta na raznykh etapakh zhiznennogo tsikla cheloveka [Peculiarities of immunity formation at different stages of human life-cycle] // Mezhdunarodnyy nauchno-issle-dovatel'skiy zhurnal - International Research Journal. 2015; 6-2 (37): 40-42. DOI: 10.18454/IRJ.2227-6017 (in Russian).
12. Yarilin A.A. Immunologiya [Immunology]. M.: GEO-TAR-Media Publ., 2010: 752 (in Russian).
13. Kudryavtsev I.V., Borisov A.G., Krobinets I.I., Savchen-ko A.A., Serebryakova M.K. Opredelenie osnovnykh sub-populyatsiy tsitotoksicheskikh T-limfotsitov metodom mnogotsvetnoy protochnoy tsitometrii [Multicolor flow cytometric analysis of cytotoxic T cell subsets] // Med-itsinskaya immunologiya - Medical Immunology. 2015; 17 (6): 525-538 (in Russian).
14. Clausen J., Vergeiner B., Enk M., Petzer A.L., Gastl G., Gunsilius E. Functional significance of the activation-associated receptor CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells // Immunobiology. 2003; 207 (2): 85-93.
15. Cezmi A. Akdis. Global atlas of asthma. Switzerland: Published by the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, 2013: 2-179.
16. Doe C., Bafahel M., Siddiqui S. et al. Expression of the T helper 17-associated cytokines IL-17A and IL-17F in asthma and COPD // CHEST. 2010; 138 (5): 1140-1147.
17. Agache I., Ciobanu C., Agache C., Anghel M. Increased serum IL-17 is an independent risk factor for severe asthma // Respiratory Medicine. 2010; 104: 1131-1137.
18. Mubeccel A. The pathogenesis of astma // Global atlas of Asthma. 2013; 28-30.
Received March 07.2017 Accepted May 10.2017
Prosekova Elena V., DM, Professor, Head of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics and General and Clinical Immunology, Pacific State Medical University, Vladivostok, Russian Federation.
Sitdikova Tatiana S., Allergist and Clinical Immunologist, Head of the Department of Vladivostok Clinical and Diagnostic Centre, Postgraduate Student, Pacific State Medical University, Vladivostok, Russian Federation.
Dolgopolov Maxim S., Teaching Assistant of Department of Clinical Laboratory Diagnostics and General and Clinical Immunology, Postgraduate Student, Pacific State Medical University, Vladivostok, Russian Federation.
Turyanskaya Alina I., Teaching Assistant Department of Clinical Laboratory Diagnostics and General and Clinical Immunology, Postgraduate Student, Pacific State Medical University, Vladivostok, Russian Federation.
Sabynych Vitaly A., PhD, Associate Professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics and General and Clinical Immunology, Pacific State Medical University, Vladivostok, Russian Federation.
Zabelina Natalia R., PhD, Associate Professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics and General and Clinical Immunology, Pacific State Medical University, Vladivostok, Russian Federation.
(*) Prosekova Elena V., e-mail: [email protected].
