CC BY
7П.В. Кузмицкая О.Ю.Урбанович1, З.А. Козловская2
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА ХЛОРОТИЧЕСКОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2РУП «Институт плодоводства» Республика Беларусь, 223013, Минский район, пос. Самохваловичи, ул. Ковалева, 2
Введение
Одной из важнейших проблем промышленного садоводства является распространение опасных заболеваний в садах интенсивного типа. Среди инфекций, имеющих важный экономический эффект, следует упомянуть заболевания вирусной этиологии. Опасной особенностью таких инфекций является часто встречающееся бессимптомное протекание. В то же время эти инфекции могут быть причиной значительных потерь урожая, вплоть до 60% от его общего количества в случае смешанных инфекций [1-3]. Этому благоприятствует способ размножения плодовых культур. Все культуры, являющиеся объектами коммерческого садоводства, размножаются вегетативно. Такой способ размножения, помимо своих очевидных преимуществ, может являться причиной прямого распространения вирусных инфекций, происходящего путем передачи вирусных частиц от зараженного маточного растения всем его потомкам. На сегодняшний день эффективные способы лечения вирусных инфекций растений отсутствуют. Основной мерой предотвращения появления вирусных инфекций в садовых насаждениях является размножение сертифицированного безвирусного материала. В качестве мероприятия, способствующего оздоровлению садовых насаждений, проводят санитарную вырубку инфицированных деревьев. Учитывая то, что садовые насаждения представлены древесными многолетними культурами и выращивание каждого отдельного растения от стадии саженца до взрослого плодоносящего растения требует значительных материальных и трудовых затрат, важность своевременного выявления зараженного материала сложно переоценить.
Стандарт международной организации EP-PO (European and Mediterranean Plant Protec-
tion Organization), членом которой является Республика Беларусь, предусматривает тестирование посадочного материала яблони, являющейся основным объектом промышленного садоводства в стране, на предмет заражения четырьмя вирусными инфекциями [4]. Одной из них является вирус хлоротической пятнистости листьев яблони, ACLSV (Apple chlorotic leaf spot trichovirus). Данный вирус способен инфицировать большинство плодовых деревьев семейства Розоцветных, включая яблоню, грушу, сливу, вишню, черешню, абрикос, персик, айву [2, 5, 6].
Основными методами диагностики вирусных инфекций растений являются:
• Использование деревьев-индикаторов. К недостаткам метода можно отнести большие временные затраты (по стандарту EP-PO для проведения методики требуется до пяти лет), дороговизну, сложность в интерпретации результатов [4, 7].
• Иммуноферментный анализ. Чаще всего для диагностики вирусов растений используют твердофазный гетерогенный иммунный анализ - ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Именно этот метод применяется для тестирования плодовых культур в Беларуси [8, 9]. Метод может давать ложноотрица-тельные результаты в случае низкого титра вирусных частиц, а также ингибирующего эффекта сока древесных растений. Использование метода имеет сезонные ограничения, связанные с изменением активности вируса в течение года [7, 10, 11].
• ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией). Наиболее современный метод диагностики. Характеризуется большей точностью результатов и наименьшими затратами времени. Ис-
пользуя кору деревьев, тестирование можно проводить круглый год [4, 7, 10, 11]. Преимущества метода обусловили его выбор для данного исследования в качестве
потенциальной методики тестирования садовых насаждений Республики Беларусь на предмет заражения вирусом хлоротической пятнистости яблони.
Материалы и методы
Исследования проводились на 14 сортах яблони, предоставленных РУП «Институт плодоводства». Образцы отбирали с каждого отдельного дерева.
Выделение РНК из растительного материала проводилось с помощью GeneJet™ Plant Genomic RNA Purification Mini Kit (Thermo scientific (EC)) согласно рекомендуемому протоколу. Для выделения РНК использовали фрагменты листовой пластинки. Синтез минус-цепи кДНК проводили с помощью RevertAid™ H Minus First Srtand cDNA Synthesis Kit (Thermo scientific (EC)) согласно протоколу производителя. Для идентификации вируса использовали маркеры, описанные в методике [7]. Амплификацию кДНК проводили по методике [11] с модификациями. В реакции использовали внутренний контроль, а именно амплификацию растительной мРНК. Контрольную амплификацию проводили с помощью праймеров к созревшей мРНК гена, кодирующего субъединицу 5-НАДН-дегидрогеназы. Этот ген состоит из двух экзонов, a и b, разделенных интроном в 848 п.н. Дизайн этих праймеров был выполнен таким образом, чтобы последние три нуклеоти-да 3' -конца смыслового праймера были комплементарны первым трем нуклеотидам экзона b, а остальные нуклеотиды были комплементарны 5'-концу экзона а. Второй праймер полностью комплементарен экзону b. Это позволяет проводить контроль эксклюзивности амплификации РНК, поскольку последовательность смыслового праймера может использовать в качестве матрицы только РНК, прошедшую сплайсинг. Такой контроль позволяет избежать ложно-отрицательных результатов, связанных с деградацией РНК или присутствием ингибиторов обратной транскриптазы [7]. В качестве отрицательного контроля матрицу кДНК в реакции
заменяли равным количеством деионизирован-ной воды. Продукты амплификации разделяли в 1% агарозном геле в трис-ацетатном буфере. Гели документировали с помощью фотографирования после окрашивания этидиум бромидом. В качестве маркера молекулярного веса использовали 100 bp DNA Ladder Plus (Thermo scientific (EC)).
Для подтверждения принадлежности полученных фрагментов геному вируса ACLSV продукты амплификации одного из образцов после электрофоретического разделения вырезали из агарозного геля для последующего их выделения с использованием GeneJet™ Gel Extraction Kit (Thermo scientific (EC)). Выделенные фрагменты лигировались в плазмиду pTZ57R/T, которой трансформировали E.coli DH5a с помощью InsTAclone™ PCR Cloning Kit (Thermo scientific (EC)) согласно рекомендациям производителя. После выращивания на LB-Amp среде из трансформантов выделяли плазмидную ДНК используя Plasmid GeneJet™ Miniprep Kit (Thermo scientific (EC)) согласно протоколу производителя. Фрагмент, встроенный в плазмидную ДНК, секвенировали с помощью праймеров к последовательности полилинкера вектора pTZ57R/T M13F (GTA-AAACGACGGCCAGT) и М13 R (CAGGAAA-CAGCTATGAC). Для проведения реакции использовали BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Амплификацию для секвенирования и очистку полученных продуктов амплификации проводили в соответствии с методикой производителя. Компьютерный анализ полученной нуклеотид-ной последовательности выполняли с помощью программного обеспечения, предоставленного на сайте NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov) и программы Geneious 4.7.6.
Результаты и обсуждение
Вирус хлоротической пятнистости листьев яблони содержит однонитевую плюс-цепь РНК, окруженную множеством копий белка капси-да (CP, coat protein), имеющего молекулярную
массу 22 кДа [12]. Размер изученных геномов вируса (без учета поли(А)-хвоста на З'-конце) колеблется от 7474 до 7561 п.о. [6, 13-18]. Геном ACLSV содержит три перекрывающиеся
открытые рамки считывания (ORFs 1, 2 и 3). ORF 1 кодирует белок, ассоциированный с репликацией - Rep, имеющий молекулярную массу 216 кДа. ORF 2 кодирует транспортный белок MP (moving protein), ORF 3 кодирует вышеупомянутый белок СР. Идентификация вируса ACLSV в представленном исследовании проводилась при помощи молекулярного маркера, амплифицирующего фрагмент вирусного генома, кодирующего белок СР. Наличие вируса
подтверждалось присутствием фрагмента амплификации длиной 677 п.о.
Тестированию были подвергнуты 32 образца яблони. С помощью ОТ-ПЦР вирус хлоротической пятнистости листьев яблони был идентифицирован в 24 образцах из 32. Результаты представлены в таблице. Вирус был обнаружен у 11 сортов яблони из 14 исследованных. У образцов сортов Ауксис, Надзейны и Чарав-ница вирус не был детектирован.
Результат тестирования яблонь на зараженность вирусом хлоротической пятнистости
яблони методом ОТ-ПЦР
№ Название сорта Наличие ACLSV по результатам ОТ-ПЦР
1 Антей +
2 +
3 Антоновка Белсад +
4 +
5 Ауксис -
6 -
7 Вербнае +
8 +
9 Дыямент +
10 +
11 Заславское +
12 +
13 Красавгга +
14 +
15 +
16 +
17 Лучезарное +
18 +
19 Мечта +
20 -
21 Надзейны -
22 -
23 Сакавгга -
24 +
25 Сябрына +
26 +
27 +
28 +
Продолжение табл.
№ Название сорта Наличие ACLSV по результатам ОТ-ПЦР
29 Топаз +
30 +
31 Чаравница -
32 -
Соответствие фрагмента амплификации, полученного при помощи ОТ-ПЦР, тестируемому вирусу ACLSV было подтверждено секвениро-ванием. В качестве объекта для секвенирования был взят фрагмент амплификации образца сорта яблони Сакав^а. Всего было выполнено 4 прочтения нуклеотидной последовательности данного фрагмента из двух клонов. Размер секвенированной последовательности соответствовал ожидаемому - 677 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность фрагмента генома вируса ACLSV белорусского изолята, получившая название Сакавгта-1, была опубликована в GenBank (National Center for Biotechnology Information) (номер доступа KC244768).
Нуклеотидная последовательность Сакавта-1 сравнивалась с аннотированными нуклео-тидными последовательностями, опубликованными в GenBank. Анализ подтвердил, что она представляет собой фрагмент гена оболочки вируса ACLSV и последующий 3'-не-транслируемый регион. Сравнение фрагмента Сакав^а-1 показало идентичность изучаемой последовательности в пределах 87-94 % при 100% перекрытии сравниваемых областей с выборкой отдельных известных нуклеотидных последовательностей вируса ACLSV. В частности, 94% идентичности было отмечено между Сакавгта-1 и фрагментами генома вирусов из Италии, Китая, Японии (номер доступа в GenBank AJ586624.1, GQ334204.1, AB326224.1 соответственно). Следует отметить, что для геномов вируса ACLSV характерна достаточно высокая дивергенция нуклеотидных последовательностей. Идентичность секвенированных на сегодняшний день геномов находится в пределах 67,2-95,1%. Различия в нуклеотидных последовательностях генома могут наблюдаться даже в случаях выделения вирусного материала из одного и того же растения. Описан случай заражения дерева смесью трех вариантов вируса ACLSV, между которыми наблюдалась
значительная степень дивергенции [5]. Помимо этого, для вируса хлоротической пятнистости листьев яблони характерны различия в степени дивергенции областей непосредственно внутри генома вируса. Результаты множественного выравнивания отдельных рамок считывания показали, что последовательность генома вируса, кодирующая белок СР, является наиболее консервативной, в то время как последовательность, кодирующая МР, - наименее консервативна [15]. Это необходимо учитывать при выборе области генома, которая будет ампли-фицироваться в процессе тестирования растений на присутствие вируса хлоротической пятнистости листьев яблони. В случае попадания праймеров на области с более высокой степенью дивергенции возрастает вероятность получения ложноотрицательных результатов тестирования. Примененные в представленном исследовании праймеры амплифицируют участок генома вируса, кодирующий относительно консервативный белок СР. Использование наименее вариабельной области генома вируса повышает точность получаемых результатов.
Компьютерная трансляция нуклеотидной последовательности Сакав^а-1 в аминокислотную и последующее выравнивание предполагаемой аминокислотной последовательности с депонированными в GenBank аминокислотными последовательностями белка оболочки ACLSV (номера доступа в GenBank BAF64461.1, BAF64464.1, BAF64467.1, AAA42589.1, AAA42589.1, CAA68083.1, BAA03643.1, CAB46654.1, NP_040553.1) показали наличие между ними замен отдельных аминокислот. Результаты выравнивания аминокислотных последовательностей представлены на рисунке. Как видно из иллюстрации, замены отдельных аминокислот встречаются у разных изолятов ACLSV. Возможное влияние таких замен на функциональную активность белка представляет определенный интерес.
с
сот
с и н т
й йок
с е
т
о р
о
а с
в
а
и н
нол
аб вя
§ 8 § н
0 I
3
н т
тол
с
он и
с е
т е т о
и н
нва &
-О
в
3
та
ать
&
е Р
Считается, что белки капсида вирусов растений имеют множество функций. Помимо непосредственного формирования вирусных частиц, их участие было показано в репликации вирусных нуклеиновых кислот, перемещении вирусных частиц от одной клетки к другой, формировании симптомов, супрессии РНК-сайленсинга, системном распространении вируса [19, 20]. Было показано, что вирус мозаики люцерны (АМУ) и его РНК не способны инфицировать растение при инокуляции в случае отсутствия в инокуляте нескольких молекул белка капсида или соответствующего транскрипта [21-23]. Белок СР вируса
хлоротической пятнистости листьев яблони принимает участие в репликации вирусного генома в клетке, что было доказано экспериментально [17]. Для эффективной репликации критическими оказались комбинации аминокислот в позициях 40 и 75 данного белка. Функционально активному белку соответствуют комбинации аминокислот либо аланин40 + фенилаланин75, либо серин40 + тирозин75 [17]. Аминокислоты гипотетического белка СР фрагмента вируса Сакав^а-1, находящиеся в позициях 40 и 75, представлены серином и тирозином соответственно, что говорит о возможной его функциональной активности.
Заключение
Метод ОТ-ПЦР, примененный в данном исследовании для тестирования сортов яблони на наличие ACLSV, позволил обнаружить вирус у 11 из 14 исследованных сортов. Из яблони сорта Сакав^а был выделен и секвенирован фрагмент генома вируса ACLSV. Данная последовательность представляет собой фрагмент гена вируса, кодирующего капсидный белок и последующий З'-нетранслируемый
регион. Идентичность клонированной ну-клеотидной последовательности отдельным последовательностям данной области генома вируса, представленным в базе данных GenBank, находится в пределах 87-94 %. Метод может быть использован для выявления распространения вируса хлоротической пятнистости листьев яблони (ACLSV) в плодовых насаждениях.
Список используемых источников
1. Campbell, A.I. The effect of some latent virus infections of the growth and cropping apples / A.I. Campbell // Journal of Horticultural Sciences. - 1963. - Vol. 38. -P. 15-19.
2. Posnett, A.F. The effect of virus infection on the growth and cropp of apple, pear and plum trees / A.F. Posnett, R. Cropley, C.E. Ellenberg-er // Phytopathologia Mediterranea. - 1963. -Vol. 2, № 158-161.
3. Schmidt, H. The effect of 'latent' virus infections on the yield of maiden trees on 20 apo-mictic apple seedling root-stocks / H. Schmidt // Journal of Horticultural Sciences. - 1972. -Vol. 47. - P. 159-163.
4. EPPO Standards - Certification schemes -PM 4/27(1) Pathogen-tested material of Malus, Pyrus and Cydonia // EPPO Bulletin. - 1999. -Vol. 29, № 3. - P. 239-252.
5. An immuno-capture PCR assay adapted to the detection and the analysis of the molecular variability of the apple chlorotic leaf spot virus / T. Candresse [et al.] // Acta Horticulturae. -1995. - Vol. 386. - P. 136-147.
6. Complete nucleotide sequence of the genome of a serve cherry isolate of Apple chlorotic leaf spot tricho virus (ACLSV) / S. German [et al.] // Archives of Virology. -1997. - Vol. 142. - P. 833-841.
7. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control / W. Menzel, W. Jelkmann, E. Maiss // Journal of Virological Methods. - 2002. - Vol. 99. - P. 81-92.
8. Положение о производстве посадочного материала плодовых и ягодных культур в Республике Беларусь / В.А. Самусь, Н.В. Кухарчик // РУП «Институт плодоводства». - 2009. - С. 35.
9. Кухарчик, Н.В. Вирусные и фитоплаз-менные болезни плодовых и ягодных культур в Беларуси / Н.В. Кухарчик. - Минск: Бела-руская навука, 2012. - 210 с.
10. Detection of four apple viruses by ELISA and RT-PCR assays in Turkey / K. Caglayan [et al.] // Turkish Journal of Agriculture and Forestry. - 2006. - Vol. 30. - P. 241-246.
11. Hassan, M. Simultaneous detection and identification of four pome fruit viruses by one-
tube pentaplex RT-PCR / M. Hassan, A. Myrta, J. Polak // Journal of Virological Methods. -2006. - Vol. 133. - P. 124-129.
12. Yoshikawa, N. Properties of RNAs and proteins of Apple stem grooving and Apple chlo-rotic leaf spot viruses / N. Yoshikawa, T. Taka-hashi // Journal of General Virology. - 1998. -Vol. 88. - P. 2611-2618.
13. Jelkmann, W. The nucleotide sequence of a strain of Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) responsible for plum pseudopox and its relation to an apple and plum bark split strain / W. Jelkmann // Phytopatology. - 1996. -Vol. 86. - P. 101.
14. Marini, D.B. The complete nucleotide sequence of an isolate of Apple chlorotic leaf spot virus from peach (Prunica persica (L.) Batch) / D.B. Marini, B.G. Gibson, S.W. Scott // Archives of Virology. - 2008. - Vol. 153. - P. 1003-1005.
15. Complete nucleotide sequences of the genomes of two isolates of apple chlorotic leaf spot virus from peach (Prunus persica) in China / F. Niu [et al.] // Archives of Virology. - 2012. -Vol. 157. - P. 783-786.
16. Sato, K. Complete nucleotide sequence of the genome of an apple isolate of Apple chlorotic leaf spot virus / K. Sato, N. Yoshikawa, T. Taka-hashi // Journal of General Virology. - 1993. -Vol. 74. - P. 1927-1931.
17. Combinations of two amino acids (Ala40 and Phe75 or Ser40 and Tyr75) in the coat protein of Apple chlorotic leaf spot virus are crucial for in-fectivity / H. Yaegashi [et al.] // Journal of General Virology. - 2007. - Vol. 88. - P. 2611-2618.
18. Nucleotide sequence and genomic organization of Apple chlorotic leaf spot clostero-virus / S. German [et al.] // Virology. - 1990. -Vol. 179. - P. 104-112.
19. The multifunctional capsid proteins of plant RNA viruses / A. Callaway [et al.] // Annual Review of Phytopathology. - 2001. - Vol. 39. -P. 419-460.
20. Three distinct suppressors of RNA silencing encoded by a 20-kb viral RNA genome / R. Lu [et al.] // PNAS. - 2004. - Vol. 101. -P. 15 742-15 747.
21. Bol, J.F. Alfalfa mosaic virus and ilavi-ruses: involvement of coat protein in multiple steps of the replication cycle / J.F. Bol // Journal of General Virology. - 1999. - Vol. 80. -P. 1089-1102.
22. Bol, J.F. Alfalfa mosaic virus: coat protein-dependent initiation of infection / J.F. Bol // Molecular Plant Pathology. - 2003. - Vol. 4. -P. 1-8.
23. Jaspars, E.M. Genome activation in alfa-mo- and ilaviruses / E.M. Jaspars // Archives of Virology. - 1999. - Vol. 144. - P. 843-863.
Дата поступления статьи 11 июня 2013 г.
