CC BY
16УДК 633.63:631.52
doi.org/10.24412/2413-5518-2023-5-29-31
Идентификация типа цитоплазмы линий Beta vulgaris L. с использованием ПЦР в реальном времени
Е.О. КОЛЕСНИКОВА, канд. биолог. наук, руководитель отдела биотехнологии (e-mail: [email protected]) P.B. БЕРДНИКОВ, канд. с/х наук, генеральный директор А.В. ЛИНОВ, специалист отдела биотехнологии ООО «СоюзСемСвекла»
Введение
Современные селекционные программы по сахарной свёкле (Beta vulgaris L.) направлены на создание отечественных гибридов, обладающих целым рядом ценных признаков. В работе селекционеры сталкиваются с определёнными трудностями. Одна из них заключается в том, что данная культура является двулетней, соответственно, на фенотипическое подтверждение признака требуется больше времени и трудозатрат. В связи с этим для выявления различных свойств и отбора селекционного материала целесообразно применение биотехнологий, в том числе мо-лекулярно-биологических методов, использование которых должно быть максимально производительным [1, 6].
Создание современных гибридов сахарной свёклы основано на использовании цитоплазматической мужской стерильности, описанной F.V. Owen ещё в 1945 г. [3]. На тот момент не были известны моле-кулярно-генетические аспекты проявления данного признака. Однако технологии развивались, и в 2000 г. группой учёных под руководством Satsuki Nishizawa было установлено, что проявление ЦМС обусловливает полиморфизм в митохондриальном геноме сахарной свёклы, в котором был обнаружен участок, содержащий минисателлитные повторы. Позже на их основе был создан молекулярный маркер, позволяющий идентифицировать тип цитоплазмы сахарной свёклы. Так, у образцов с нормальным типом цитоплазмы (N-тип) размер продукта маркера TR3 составляет 450 п. н., а у образцов со стерильным типом цитоплазмы (S-тип) — 350 п. н. [2]. Этот молекулярный маркер получил широкое распространение.
№ 5 • 2023 САХАР 29 -
На данный момент его эффективность считается подтверждённой рядом исследований [4, 5].
При получении линий и создании гибридов в селекционно-генетическом центре ООО «СоюзСемСвекла» на постоянной основе ведутся работы по выявлению хозяйственно ценных признаков сахарной свёклы с использованием генотипирования. Такой подход позволяет определить тип цитоплазмы и другие показатели исследуемых образцов на начальной стадии развития и не требует получения взрослого растения. В селекционную программу предприятия внедрено применение в том числе маркера стерильности цитоплазмы. Анализ исследуемых образцов включает в себя проведение ПЦР с последующей визуализацией продукта в агарозном геле. Для повышения производительности данного метода было решено перевести молекулярный маркер TR3 на платформу ПЦР в реальном времени с последующей оценкой кривых плавления полученного продукта.
Материалы и методы
Объектом исследования служили образцы листьев микроклонов сахарной свёклы различных генотипов in vitro, полученные в селекционно-генетическом центре «СоюзСемСвекла». Для этого были отобраны пять линий по три образца в каждой: 1-МС (образцы 7403, 7405, 7406), 2-МС (7416, 7419, 7420), 3-МС (7451, 7452, 7453), 1-От (7395, 7397, 7398), 2-От (7441, 7444, 7446).
ДНК выделяли из листьев массой 50—100 мг колоночными наборами Qiagen DNeasy Plant Pro Kit по методике производителя. Оценку количества и каче-
QtLypnaMj «Caxap» - 100 лет!
ства выделенной ДНК осуществляли спектрофотоме-трически на Implen NP80.
В целях выявления типа цитоплазмы использовали маркер TR3. Синтез праймеров был осуществлён компанией НПК СИНТОЛ. Последовательности праймеров для маркера TR3:
5'-AGAACTTCGATAGGCGAGAGG-3'
5'-GCAATTTTCAGGGCATGAACC-3'.
ПЦР в реальном времени проводили на амплифи-каторе Bio-Rad CFX384 с наборами «Биолабмикс БиоМастер» HS-qPCR SYBR Blue (2*). Обработку полученных результатов и анализ кривых плавления осуществляли в программе Bio-Rad CFX Manager.
Разделение и визуализация продуктов ПЦР происходили в 1,5%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия при 70В в течение 1 ч. 30 мин. Детекцию результатов выполняли на гельдокументиру-ющей системе Bio-Rad GelDoc Go.
Результаты и обсуждение
В процессе работы ранее была проведена оценка эффективности молекулярного маркера TR3, при этом определён тип цитоплазмы с помощью ПЦР и выполнены цитологические исследования проанализированных образцов по признаку фертильности пыльцевых зёрен. Результаты, полученные с помощью микроскопии пыльцы, коррелировали с данными молекулярно-генетического анализа стерильности цитоплазмы.
Из листьев микроклонов исследуемых образцов была выделена суммарная ДНК. Спектрофотометри-ческий анализ показал достаточную её концентрацию в интересах дальнейших исследований, а соотноше-
Результаты спектрофотометрического анализа ДНК микроклонов исследуемых образцов сахарной свёклы
ние поглощения А260/А280 в пределах 1,8 свидетельствовало о низком уровне загрязнения полученных препаратов (см. табл.).
Для исполнения последующей работы ДНК была нормализована до концентрации 10 нг/мкл. При проведении ПЦР в реальном времени детекция флуоресценции осуществлялась на этапе отжига праймеров (рис. 1).
Далее проанализировали кривые плавления с шагом 0,5 оС (рис. 2). Были получены два пика — при 83,5 и 84,5 оС. Причём для образцов со стерильным типом цитоплазмы, которые представлены 1-МС, 2-МС, 3-МС, был характерен пик при 83,5 оС, а для образцов с нормальным типом цитоплазмы — линии 1-От, 2-От — соответствовал пик при 84,5 оС.
Чтобы оценить визуально полученные в ходе ПЦР продукты, провели электрофорез в агарозном геле
6000 Г
^ 5000 -I
£ 4000 ■■■ и :
| 3000 ■■■
© 2000 -
1000 -■■
0
5 10 15 20 25
Номер цикла
Рис. 1. Амплификация продукта ПЦР с маркером стерильности цитоплазмы ТЯ3. Зелёным окрашены образцы линий со стерильной цитоплазмой — 1-МС, 2-МС, 3-МС; синим — линии с нормальным типом цитоплазмы — 1-От, 2-От
Температура образца, оС
Рис. 2. Кривые плавления продукта ПЦР с маркером стерильности цитоплазмы ТЯ3. Зелёным окрашены образцы линий со стерильной цитоплазмой — 1-МС, 2-МС, 3-МС; синим — линии с нормальным типом цитоплазмы — 1-От, 2-От
30 САХАР № 5 • 2023
Линия Номер образца Концентрация ДНК, нг/мкл A260/A280
1-МС 7403 31,550 1,808
1-МС 7405 50,850 1,839
1-МС 7406 56,950 1,777
2-МС 7416 36,350 1,778
2-МС 7419 26,700 1,841
2-МС 7420 35,650 1,769
3-МС 7451 42,200 1,986
3-МС 7452 37,600 2,011
3-МС 7453 30,850 1,898
1-От 7395 29,200 1,805
1-От 7397 23,850 1,900
1-От 7398 54,950 1.814
2-От 7441 44,150 1,936
2-От 7444 26,750 1,924
2-От 7446 73,800 1,960
ОНурнсиу «Сахар» - 100 лап!
(рис. 3), с помощью которого выявили два типа продуктов — размером 370 и 450 п. н. Для образцов со стерильным типом цитоплазмы (линии 1-МС, 2-МС, 3-МС) был характерен продукт размером 370 п. н., а для линий с нормальным типом цитоплазмы (1-От, 2-От) — 450 п. н. Разница в размере продуктов и обусловливала различие в пиках плавления, которые были детектированы амплификатором.
Использование в исследовании интеркалирующего красителя SYBR Green I, входящего в состав буфера для ПЦР, даёт возможность детектировать ход реакции в реальном времени и исключить ошибки при раскапывании. Последующий анализ кривых плавления позволяет отказаться от разделения и визуализации продукта в агарозном геле, что сокращает время работы практически вдвое. При этом снижается канцерогенная нагрузка на персонал лаборатории ввиду исключения манипуляций с бромистым этидием. Также стоит отметить, что проведение ПЦР в реальном времени является более чувствительным и современным методом. Выявленные два пика плавления, характерные для МС-форм и для О-типов, хорошо визуализируются, что может быть использовано в целях выполнения высокопроизводительного анализа образцов.
Заключение
В ходе исследований было выявлено, что идентифицированный тип цитоплазмы образцов соответствовал ранее заявленной селекционной форме линий сахарной свёклы in vitro компании «СоюзСемСвекла».
Установлено, что для растений со стерильным типом цитоплазмы, размер продукта которых составлял 370 п. н., был характерен пик кривой плавления при 83,5 оС, для растений с нормальным типом цитоплазмы с размером продукта 450 п. н. пик кривой плавления наблюдался при 84,5 оС. Таким образом, была установлена возможность использования технологии ПЦР в реальном времени при выявлении типа цито-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
3000 -2000 -
1200 -900 -
600 -400 -300 -200 -100 -
7405 7416 7420 7452
7395 7398 7444
7403 7406 7419 7451 7453 7397 7441 7476
-3000
-2000
-1200
-900
-600
-400
-300
-200
-100
1-MC 2-MC 3-MC 1-От
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР с маркером стерильности цитоплазмы TR3. 2—16 — исследуемые образцы; 1 и 18 — маркер длин ДНК Биолабмикс Step 100 Long; 17— отрицательный контроль
плазмы у растений сахарной свёклы, что улучшает качество анализа и сокращает время исследования. Это позволяет применять автоматизированные системы пробоподготовки и амплификатора в реальном времени с поддержкой 384 луночных планшетов и тем самым в значительной степени повышает производительность и точность процесса.
Список литературы
1. Biotechnological methods as a tool for efficient sugar beet breeding / T.P. Zhuzhzhalova, E.O. Kolesnikova,
E.N. Vasilchenko, N.N. Cherkasova // Vavilov Journal of Genetics and Breeding. - 2020. - V. 24. - № 1. - P. 40-47.
2. Nishizawa, S. Variable number of tandem repeat loci in the mitochondrial genomes of beets / S. Nishizawa, T. Kubo, T. Mikami // Current Genetics. - 2000. - V. 37. - № 1. -P. 34-38.
3. Owen, F.V. Cytoplasmically inherited male-sterility /
F.V. Owen // Journal of Agricultural Research. - 1945. -V. 71. - P. 423.
4. Ohgami, T. Identification of molecular variants of the nonrestoring restorer-of-fertility 1 allele in sugar beet (Beta vulgaris L.) / T. Ohgami [et al.] // Theoretical and Applied Genetics. - 2016. - V. 129. - № 4. - P. 675-688.
5. Cheng, D. Mitochondrial genome diversity in Beta vulgaris L. ssp. vulgaris (Leaf and Garden Beet Groups) and its implications concerning the dissemination of the crop / D. Cheng [et al.] // Genetic resources and crop evolution. -2011. - V. 58. - № 4. - P. 553-560.
6. McGrath, J.M. Sugar beet breeding / J.M. McGrath, L. Panella // Plant breeding reviews. - 2018. - V. 42. -P. 167-218.
Аннотация. В статье рассмотрен новый подход к выявлению типа цитоплазмы у растений сахарной свёклы, заключающийся в выполнении молекулярно-генетического анализа с маркером TR3 на платформе ПЦР в реальном времени. В отличие от проведения ПЦР с последующей визуализацией продукта в агарозном геле рассматриваемый метод позволяет повысить производительность данного исследования. В результате проделанной работы была выявлена возможность идентификации типа цитоплазмы МС-форм и О-типов на основе ПЦР в реальном времени с последующей оценкой кривых плавления полученного продукта.
Ключевые слова: сахарная свёкла, МС-форма, О-тип, ПЦР, цитоплазматическая мужская стерильность, молекулярный маркер.
Summary. The article discusses a new approach to identifying the type of cytoplasm in sugar beet plants, which consists in conducting molecular genetic analysis with the TR3 marker on the real-time PCR platform. Unlike PCR with subsequent visualization of the product in agarose gel, the method under consideration allows to increase the productivity of this study. As a result of the work carried out, the possibility of identifying the type of cytoplasm of MC-forms and O-types based on realtime PCR was revealed, followed by an assessment of the melting curves of the resulting product.
Keywords: sugar beet, MS-form, O-type, PCR, cytoplasmic male sterility, molecular marker.
№ 5 • 2023 САХАР 31
QtLypnaMj «Сахар» - 100 лап!
