CC BY
40
УДК 635.15: 633.15: 631.523: 581.192
идентификация стародавних местных сортов и селекционных линий восковидной кукурузы по спектрам зеина*
Г.В. МАТВЕЕВА, кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник
В.В. СИДОРОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Ю.А. КЕРВ, кандидат биологических наук, научный сотрудник
А.В. КОНАРЕВ, доктор биологических наук, зав. отделом
Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова, ул. Большая Морская, 42-44, Санкт-Петербург, 190000, Россия
Е-mail: [email protected]
Резюме. Методом электрофореза зеина впервые изучены стародавние местные сорта и селекционные линии восковидной кукурузы, состоящие из 100% амилопектинового крахмала, контролируемого геном waxy (символ wx1), что отличает их от других подвидов культуры. Электрофорез зеина проводили в вертикальных пластинах 10%-ного по-лиакриламидного геля, содержащего 8 М мочевину. В раствор для экстракции зеина входила 6 М мочевина и 0, 01 М дитио-трейтол. Задачи исследований заключались в проведении скрининга местных сортов и самоопыленных линий подвида восковидной кукурузы по электрофоретическим спектрам зеина (белковым маркерам) с целью их идентификации и паспортизации; определении биотипного состава стародавних местных сортов восковидного подвида, их полиморфизма и степени родства; демонстрации возможности сопровождения зеиновыми маркерами процесса создания новых инбредных линий восковидного подвида кукурузы, путем насыщения (беккросса - BC) исходной линии зубовидного подвида геном wx1. По электрофоретическим спектрам зеина установлена уникальность каждого образца подвида восковидной кукурузы. Изученные образцы можно идентифицировать по специфичным для них маркерным компонентам. Даже после четырехкратного насыщения геном wx1 не гарантирована полная чистота вновь созданной восковидной линии. Значит, насыщение необходимо продолжить. У всех местных сортов подвида восковидной кукурузы выявлено несколько биотипов (от двух до пяти). Низкополиморфный сорт к-20871 (Китай) и высокополиморфный сорт к-9991 (Приморский край, корейский поселок) близки по биотипному составу. Оба биотипа сорта к-20871 встречаются среди биотипов сорта к-9991, хотя они имеют разное происхождение. Несмотря на внутрисор-товой полиморфизм, каждый сорт имеет специфичные типы спектра, по которым его можно идентифицировать. Ключевые слова: восковидная кукуруза, электрофоретиче-ские спектры зеина, биотипный состав. Для цитирования: Идентификация стародавних местных сортов и селекционных линий восковидной кукурузы по спектрам зеина/Г.В. Матвеева, В.В. Сидорова, Ю.А. Керв, А.В. Конарев// Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 7. С. 27-30.
Среди образцов коллекции кукурузы ВИР еще в 1927 г. особое внимание вызывали местные сорта, доставленные из вторичного центра происхождения этой культуры (Китай, Бирма, Индия, Приморский край) и имеющие непрозрачные тусклые зерна, преимущественно белого и желтого цвета, которые получили название - восковидная кукуруза. Н.Н. Кулешов в 1928 г.
предложил для них латинское определение - Zea mays L. ssp ceratina Kulesh [1].
Н.И. Вавилов в работе о географических закономерностях распределения генов культурных растений в книге «Происхождение и география культурных растений» отмечал, что: «Основные центры формообразования, очаги разнообразия ... характеризуются не только наличием большого числа форм, но, что не менее важно, наличием большого числа доминирующих признаков. Наоборот, вторичные центры формообразования характеризуются разнообразием преимущественно рецессивных признаков...» [2], что подтверждено не только на восковидной кукурузе, но и на других культурах - рисе, просе, сорго, подвиды которых отличаются наличием одного гена wx1. Результат действия этого гена - иное строение молекулы восковидного крахмала, сильно разветвленного и состоящего на 100% из амилопектина [3]. Крахмал других подвидов кукурузы представлен двумя физико-химическими формами: 72% амилопектина и 28% амилозы [4]. В середине ХХ века американские исследователи обнаружили отличия в желатинизации крахмала у разных подвидов кукурузы [5]. Было отмечено, что у обычных сортов она начинает происходить при температуре +4°С и продолжается до +30°С, тогда как у крахмала восковидной кукурузы этот процесс протекает в интервале от +70°С до +80°С. Пасты, полученные из разных крахмалов, ведут себя по-разному. Крахмал из обычной кукурузы непрозрачный, садится в крепкий студенистый осадок. В то время как, паста восковидного крахмала даже в 20%-ной концентрации не затвердевает и остается клейкой и вязкой несколько дней, что привлекает производителей пищевой и кондитерской продукции. Еще одно важнейшее направление использования амилопектинового крахмала - медицина, где его включают в качестве противошокового компонента в кровезаменитель «Волекам», который еще в конце 60-х гг. ХХ века разработали ученые ВНИИ крахмалопродуктов, ВНИИ кровезаменителей и Центра хирургии. Гидролизованный амилопектиновый крахмал из восковидной кукурузы можно использовать как плазмозаменяющее средство [6].
В последние годы коллекция образцов восковидной кукурузы ВИР увеличилась, благодаря целенаправленной многолетней селекционной работе Г.В. Матвеевой в условиях Майкопской опытной станции ВИР. На основе лучших инбредных линий подвидов кремнистой и зубовидной кукурузы созданы их аналоги восковидной кукурузы [7].
Достоинства восковидного зерна и интерес к нему пищевой промышленности позволяют рассматривать генетические ресурсы коллекции ВИР в качестве потенциально ценного исходного материала для селекции соответствующих сортов. Эффективность использования коллекции во многом зависит от ее изученности, а возможность надежно (в частности с помощью молекулярных маркеров) идентифицировать исходный материал - это один из важнейших элементов такого
*Данной публикацией авторы хотели бы отдать дань памяти и уважения академику РАСХН В.Г. Конареву - основоположнику исследований в ВИРе генетических ресурсов растений с использованием белковых маркеров, 100 лет со дня рождения, которого исполняется 23.12.2015 г.
процесса. Молекулярное сопровождение позволяет не только контролировать ход селекции, но и в последствие осуществлять контроль генетической целостности (подлинности) самоопыленных линий, сортов и гибридов в ходе семеноводства и промышленного производства.
В связи с изложенным мы решали следующие задачи: по электрофоретическим спектрам зеина (белковым маркерам) провести скрининг местных сортов и самоопыленных линий подвида восковидной кукурузы с целью их идентификации и паспортизации; выявить био-типный состав стародавних местных сортов, установить их полиморфизм и степень родства; показать возможность сопровождения зеиновыми маркерами процесса селекции новых инбредных линий путем насыщения исходных линий других подвидов геном wx1 .
Условия, материалы и методы. Работу проводили в отделе биохимии и молекулярной биологии ВИР им Н.И. Вавилова. Материалом для исследования послужили образцы пяти самоопыленных линий
подвида восковидной кукурузы селекции ВИР (АД96, АД117, АД17, АД1 и АД8А) и семи стародавних местных сортов из Китая (к-5088, к-20871), Южной Кореи (к-5103) и Приморского края России (к-5093, к-5106, к-9991, к-2328). Кроме того, были изучены исходные линии подвида зубовидной кукурузы и созданные на их основе аналоги восковидной кукурузы с разным количеством насыщений: Н84 (самоопыленная линия подвида зубовидной кукурузы) и ее аналог Н84 ВС3wx (после трехкратного насыщения пыльцой восковидной кукурузы, контролируемой геном wx1); линия зубовидной кукурузы СН593-9, эта же линия после однократного насыщения пыльцой wx1 (СН593-9 ВС^х) с последующим визуальным отбором зубовидных и восковидных зерен, а также линия СН593-9 ВС4wx (после четырехкратного насыщения пыльцой восковидной кукурузы, контролируемой геном wx1).
Электрофорез зеина (запасного белка кукурузы) проводили в вертикальных пластинах ПААГ по стандартной методике ^ТА для зеина кукурузы, разработанной с участием отдела биохимии и молекулярной биологии ВИР [8-11]. Гелевая пластина содержала 10% акриламид и 8 М мочевины. Зеин выделяли из еди-
ничных зерен раствором, содержащим 6 М мочевины и 0,01 М дитиотрейтол. Электрофорез осуществляли без охлаждения в течение 4,5-5 ч при напряжении 500580 В. Окрашенные и высушенные пластины с электро-форетическими спектрами сканировали. Регистрацию электрофоретических спектров зеина проводили по стандарту. В качестве стандарта использовали самоопыленную линию F2. Номера белковых компонентов соответствуют величинам их электрофоретической подвижности [12].
результаты и обсуждение. По данным электро-форетического анализа три новые линии подвида восковидной кукурузы АД17, АД8А и АД1 представлены одним биотипом, две линии АД96 и АД117 - двумя биотипами, причем один из них основной, второй встречается редко (рис. 1). Изученные линии надежно различаются между собой по спектрам зеина. Разные типы спектра формировались благодаря наличию или отсутствию отдельных компонентов, а также разному их сочетанию.
В спектрах зеина селекционных линий АД17, АД8А и АД96 нет маркерной комбинации компонентов 38-57. Однако для линии АД17 специфичен компонент 66, которого нет в спектрах двух других линий. Для линии АД8А характерен компонент 64. В спектре линии АД96 присутствуют два специфичных компонента 65 и 90. Линия АД1 отличается по спектру зеина от трех линий, представленных ранее, наличием маркерной комбинации 38-57. Для спектра линии АД117 характерна комбинация компонентов 39-58, которой нет у других селекционных линий и сортов подвида восковидной кукурузы.
Линия восковидной кукурузы АД96 создана на основе линии подвида зубовидной кукурузы А96. В спектре зеина новой линии, в отличие от исходной, отсутствует комбинация компонентов 38-57, но присутствует компонент 55 слабой интенсивности (рис. 2). Линия Н84 ВС3 создана на основе линии подвида зубовидной кукурузы Н84. В спектре зеина новой линии, в отличие от исходной, вместо интенсивного компонента 46, присутствует интенсивный компонент 47, а все остальные отличаются меньшей интенсивностью. Сравнительный анализ спектров зубовидной линии СН593-9 и ее аналога после однократного насыщения геном wx1 показал, что компонента 46, специфичного для подвида зубовидной
рис. 1. Электрофоретические спектры зеина из отдельных зерен новых селекционных линий подвида восковидной кукурузы (ст - спектр зеина линии F2, используемой в качестве стандарта на каждой гелевой пластине).
Рис. 2. Электрофоретические спектры зеина исходных и селекционных линий в зависимости от числа беккроссов геном wx1 (ст - стандарт, спектр зеина линии F2).
кукурузы, в спектре линии, контролируемой геном нет, но при этом присутствует интенсивный компонент 47, который в исходной линии отсутствует или очень слабый. Интенсивность всех остальных компонентов (особенно 54 и 72) в спектре новой восковидной линии ослаблена. Тот же тип спектра сохраняется для линии СН593-9 ВС4 т после четырехкратного насыщения геном \мх1 (выборка восковид-ных зерен из двух початков). Среди довольно однородных электрофоретических спектров, выделяется единичный спектр зеина, который явно отличается от остальных и имеет сходство со спектром исходной линии зубовидного подвида (на рис. 2 обозначен *). Следовательно, даже четыре беккросса геном wx1 не гарантируют полной чистоты созданной восковидной линии.
Все сорта стародавних местных сортов восковид-ного подвида кукурузы представлены несколькими биотипам - от двух до пяти (рис. 3).
По два типа спектра имеют местные образцы к-5088, к-20871 из Китая и к-23283 из России. Несмотря на вну-
трисортовой полиморфизм, они обладают узнаваемыми типами спектров, у каждого из них присутствуют специфические компоненты или комбинации, по которым можно провести идентификацию. Для сортов к-20871 и к-23283 характерно присутствие компонентов 64-69, однако для первого также специфична комбинация компонентов 38-57, а в спектрах второго ее нет. Комбинация компонентов 64-69, характерна для сортов к-20871 и к-23283, но отсутствует в спектрах сорта к-5088, однако для него специфичны комбинация 38-57, компонент 40 и отсутствие либо очень слабая интенсивность компонентов в зоне от 63 до 85. Спектры без компонента 40 встречаются редко.
Три биотипа имеет местный стародавний сорт восковидной кукурузы к-5093 из Приморского края. Характерная его особенность - наличие в спектрах специфических компонентов 56, 65, 66, 72 и 92, а также комбинации компонентов 38-57, по которым его можно идентифицировать. Спектры с компонентами 59 и 69 встречаются редко. Полиморфизм белковых
и-2ОЙ71 к-г^еэ к-нмз . ст
и-5106
и-аюа
. сг ..
к-3991 . £ и £
е 5® 5-яв в
■ 1 - *
—
ф-т í
9 i*
1 - —
<*« -ш
— — ^
ЩЩ
1 _ №
-в
■72
и
-0-1
И-
Шёл 9 Ф
* V z • Ш
?
А 9 •
ш | ё
К
Л »
1-й
Рис. 3. Электрофоретические спектры зеина стародавних местных сортов восковидной кукурузы (ст - стандарт, спектр зеина линии F2).
спектров касается только наличия или отсутствия компонентов 46,48 и 61.
Пять типов спектра отмечено у местного сорта восковидной кукурузы Липкая корейская к-5106 (Приморский край). Характерная особенность этого образца -полное отсутствие комбинации компонентов 38-57, или ее наличие в слабой интенсивности (в редких случаях). Специфические для сорта компоненты 46, 47, 55, 60 и 92. Полиморфизм белковых спектров обеспечивает наличие или отсутствие компонентов 40, 63, 64 и 69.
Местный сорт к-5103 (Ю. Корея) характеризуется значительным внутрисортовым полиморфизмом по спектрам зеина. Для него стабильны компоненты 49, 55, 60 (в редких спектрах отсутствует), 63, 85 и 92. Комбинация компонентов 38-57 присутствует в большей части спектров. Полиморфизм белковых спектров этого сорта создают компоненты 40, 46, 51, 64, 65 и 69 в разных сочетаниях.
Местный сорт к-9991 (Приморский край, корейский поселок), как и к-5103, отличается значительным внутрисортовым полиморфизмом белковых спектров. Его характерная особенность - наличие специфических компонентов 38, 48, 51, 55, 57 (в редких спектрах отсутствует), 60, 63, 68, 69 (в редких спектрах отсутствует) и 85, по которым сорт может быть идентифицирован. Полиморфизм белковых спектров обеспечивает на-
личие или отсутствие компонентов 37, 40, 46, 47 и 64, а также их интенсивность.
При сравнении местных сортов восковидного подвида кукурузы мы установили близость по компонентному составу белковых спектров самого низкополиморфного сорта к-20871 (Китай) и высокополиморфного сорта к-9991 (Приморский край, корейский поселок). Оба биотипа сорта к-20871 встречаются среди биотипов полиморфного сорта к-9991.
выводы. Изученные линии подвида восковидной кукурузы надежно различаются между собой по спектрам зеина, вследствие чего могут быть идентифицированы по специфичным для них маркерным компонентам. Показана возможность сопровождения зеиновыми маркерами процесса создания новых линий восковидного подвида кукурузы из исходной линии зубовидного подвида путем насыщения ее геном wx1. По спектрам зеина у всех местных сортов подвида восковидной кукурузы выявлено несколько биотипов (от двух до пяти). Несмотря на внутрисортовой полиморфизм, каждый местный сорт имеет специфичные типы спектра, по которым его можно идентифицировать. Выявлена близость по биотипному составу низкополиморфного сорта к-20871 (Китай) и высокополиморфного сорта к-9991 (Приморский край, корейский поселок). Оба биотипа сорта к-20871 встречаются среди биотипов сорта к-9991, хотя они имеют разное происхождение.
Литература.
1. Кулешов Н.Н. Некоторые особенности кукурузы Азии // Тр. По прикладной ботанике, генетике и селекции. Л., 1928. т. X1X. вып. 2. с. 325-374.
2. Вавилов Н.И. Происхождение и география культурных растений. Л.: «Наука» Ленинградское отделение, 1987. 440 с.
3. Подольская А.П. Список генов // Генетика кукурузы. Глава 3. Л.: Агропромиздат. Ленинградское отделение. 1988. с. 66.
4. Югенхеймер Р.У. Кукуруза: улучшение сортов, производство семян, использование. М.: «Колос». 1979. с. 187-188.
5. Abegg F.A. Effects of waxy and sugary genes on reserves with special reference to modification of the waxy ratio maize. USA. Genetics 1929. V 14, p. 270-285.
6. Белоцерковская В. Кукуруза для искусственной крови // Наука и жизнь. 2010. №1. с. 30-31.
7. Матвеева Г.В. Перспективы использования зерна восковидной кукурузы. Сб.: 1VМеждународный конгресс ЗЕРНО и ХЛЕБ РОССИИ. 11-13 ноября 2008. СПб.: FarEXPO. с. 54-55.
8. Конарев В.Г., Сидорова В.В., Тимофеева Г.И. Электрофорез зеина как метод идентификации, регистрации и анализа сортов, линий и гибридов кукурузы//С.-х. биология. 1990. № 3. c. 16-177.
9. Сидорова В.В., Матвеева Г.В., Тимофеева Г. И. Идентификация, анализ и регистрация сортов, линий и гибридов кукурузы электрофорезом и изоэлектрофокусированием зеина / в сб. «Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян» под ред. В.Г. Конарева. /СПб.: РАСХН. ВИР, 2000. Гп.2. с. 73-89.
10. Сидорова В.В., Матвеева Г.В., Тимофеева Г.И. Анализ и регистрация линий, сортов и гибридов кукурузы по зеину методом электрофореза: Методические указания и каталог белковых формул/под ред. В. Г. Конарева. СПб: РАСХН. ВИР, 1998. 50 с.
11. В.В. Сидорова, Г.В. Матвеева, А.В. Конарев, Ю.А. Керв, А.М. Кудрявцев, В.П. Упелниек, Н.К. Янковский. Зеиновые маркеры в анализе генофонда кукурузы и повышении эффективности селекционно-генетических программ //Аграрная Россия. 2012. №7. с. 5-11.
12. В.В. Сидорова, Г.В. Матвеева, Ю.А. Керв, А.В. Конарев. Возможности использования зеиновых маркеров в повышении эффективности гетерозисной селекции кукурузы.// Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 2012. т. 170. С. 147-157.
IDENTIFICATION OF OLD LOCAL VARIETIES AND BREEDING LINES OF wAxY CORN
FOR SPECTRA OF ZEIN
G.V. Matveeva, V.V. Sidorova, Yu.A. Kerv, A.V. Konarev
N.I.Vavilov All-Russian Research Institute of Plant Industry RAAS, Bolshaya Morskaya str., 42-44, Saint-Petersburg, 190000, Russia. Summary. For the first time zein electrophoresis was used to analyze old local varieties and breeding lines of waxy corn, differing from other corn subspecies by 100 % amylopectin starch controlled by waxy (wx1) gene. Zein electrophoresis carried out in vertical 10% PAA gels with 8 M urea. The solution for zein extraction contained 6 M urea and 0.01 M dithiothreitol. The present research pursued the following aims: to use zein elecrophoretic patterns (protein markers) in screening local varieties and self-pollinated lines of the waxy corn subspecies for their identification and fingerprinting; to determine the biotype composition of old local varieties of the waxy corn subspecies and their polymorphism and degree of relationship; to demonstrate the possibility of applying zein markers in the development of new inbred lines of the waxy corn subspecies by backcrossing the wx1 gene into the initial line of the dent corn subspecies. Zein electrophoretic patterns showed the uniqueness of each sample of the waxy corn subspecies. Studied samples can be identified using specific marker components. The complete purity of a newly developed waxy line cannot be guaranteed even after the wx1 gene fourfold backcrossing. Therefore, the saturating crosses should be continued. All cultivars were found to be composed of several biotypes, their number ranging from two to five. Low-polymorphous variety K-20871 (China) and highly-polymorphous variety K-9991 (Primorsky Krai, Korean settlement) are close in biotype composition. Both biotypes of K-20871 are among the biotypes of K-9991, although they have different origin. Regardless of the intra-cultivar polymorphism, every variety possesses cultivar-specific patterns that allow its identification. Keywords: waxy corn, electrophoretic spectra of zein, biotype composition.
Author Details: G.V. Matveeva, Cand. Sc. (Agr.), Leading Researcher; V.V. Sidorova, Cand. Sc. (Biol.), Senior Researcher (e-mail: [email protected]); Yu.A. Kerv, Cand. Sc. (Biol.), Researcher; A.V. Konarev, Dr. Sc. (Biol.), Head of Division.
For citation: Sidorova V.V., Matveeva G.V., Kerv Yu.A., Konarev A.V. Identification of old local varieties and breeding lines of waxy corn for spectra of Zein. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. V. 29. № 7. pp. 27-30 (In Russ).
