CC BY
88
С. А. Рамазанова,
научный сотрудник С. З. Гучетль,
кандидат биологических наук
Т. А. Челюстникова,
старший научный сотрудник
Т. С. Антонова,
доктор биологических наук ГНУ ВНИИ масличных культур
ИДЕНТИФИКАЦИЯ СОРТОВ СОИ РОССИЙСКОЙ СЕЛЕКЦИИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ (ББИ) ЛОКУСОВ ДНК
УДК 633.853.52:631.522
Введение. В настоящее время для маркирования генома сельскохозяйственных культур разработаны и широко применяются различные типы молекулярных маркеров. Они позволяют провести идентификацию и регистрацию генотипов, определить степень генетической чистоты линий и уровень гибридности партий семян, выявить филогенетические отношения между видами [1].
Наиболее перспективными молекулярными маркерами являются полиморфные фрагменты ДНК и, в частности, её микросателлитные повторы. С их помощью уже идентифицированы и паспортизированы разные сельскохозяйственные культуры. По данным многих авторов, высокий уровень полиморфизма у сои удалось выявить только по микро-сателлитным локусам [3, 4].
Работа по исследованию полиморфизма микро-сателлитных последовательностей ДНК у сортов сои селекции ВНИИМК ранее не проводилась. До настоящего времени сорта идентифицируют только по морфологическим признакам.
Целью наших исследований было выявить полиморфные SSR-локусы ДНК у сортов сои селекции ВНИИМК. И на их основе создать систему микросателлитных маркеров для дифференциации и паспортизации сортов сои отечественной селекции.
Материалы и методы. В работе использованы 34 генотипа сои (G. max), из них 27 сортов и форм сои селекции ВНИИМК и 7 сортов других российских селекцентров. Растения сои выращивали в поле или камере искусственного климата.
Для выделения ДНК использовали небольшие фрагменты зеленых листьев с 5-10 растений. Выделение проводили по модифицированному методу Saghai-Maroof [5]. Концентрацию ДНК в полученном препарате определяли по интенсивности свечения пробы объемом 10 мкл в ультрафиолетовом свете в 1 % агарозном геле с содержанием бромистого этидия.
Полимеразную цепную реакцию в объеме реакционной смеси 25 мкл, содержащей: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мМ сульфата аммония;
1,5-3 мМ MgCl2; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мМ дезок-сирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 единицу рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Москва, ГОС-НИИГЕНЕТИКА). Амплификацию осуществляли в приборе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 96 оС в течение 2 мин, затем 32 цикла при температурно-временном режиме: денатурация при 94 оС - 30 сек, отжиг праймера при 4560 оС в зависимости от праймера - 40 сек, элонгация при 70 оС - 1 мин, заключительный цикл, финальная элонгация при 70 оС - 2 мин.
Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (2 % агароза, 1х ТАЕ-буфер) с использованием камеры для горизонтального электрофореза (SE.1, ДНК-технология, Россия) в течение 1,5-2 часов при силе тока 50 mA и напряжении 90-100 V. Документирование результатов электрофореза обеспечивалось при помощи трансиллюминатора и видеосистемы (ДНК-технология, Россия) с программным обеспечением Gel Imager-2.
Для каждого локуса был вычислен индекс полиморфного информационного содержания (PIC) и эффективное число аллелей [1,6]. Вычисления проводили по формулам: n
PICi = 1- Е j (1),
j=1
где P - частота j паттерна для локуса i и суммирование распространяется на n паттернов.
n
ne = 1/ Е Pji2 (2),
e j=1 ji где ne - эффективное число аллелей.
Результаты и обсуждение. Для исследования были выбраны 9 пар праймеров, фланкирующих микросателлитные повторы ДНК. Их нуклеотидные последовательности приведены в работах зарубежных авторов [3, 4].
Результаты амплификации ДНК 34 исследуемых образцов сои показали, что из 9 изученных 88Я-локусов 8 явились полиаллельными, а один -Soygy2 - оказался мономорфным. Всего было выявлено 26 аллелей. Число аллелей на локус варьировало от 1 до 5. Среднее число аллелей на локус составило 2.9. Среднее эффективное число аллелей на локус составило 2,26 (табл. 1).
Таблица 1 — Характеристика исследованных микросателлитных локусов
Локус Повтор Молекулярный вес (п.н) Коли- чество аллелей Эффек- тивное число аллелей PIC*
Sattl (att)24 141-150 4 3,13 0,68
Satt 2 (aat)18 140-152 2 1,49 0,33
Satt5 (taa)21 157-177 4 2,87 0,65
Satt9 (aat)12 142-221 5 4,18 0,76
Soypr1 (tat)20 163-188 2 2,08 0,52
Soygy2 (at)9(att)6 167-175 1 - 0
Sat 1 (at)17 188-235 4 2,93 0,66
Sat 36 (at)19 115-185 2 1,06 0,06
Soyhsp176 (at)15 118-135 2 1,56 0,36
Среднее - - 2,9 2,26 0,57
• PIC - индекс полиморфного информационного
содержания
Важным показателем информативности микросателлитных локусов является индекс полиморфного информационного содержания (PIC). Это показатель, характеризующий дискриминационную силу локуса не только по количеству выявленных аллелей, но и по относительным частотам их встречаемости. PIC приближается к единице, если локус имеет много аллелей с приблизительно равной частотой встречаемости, и равен 0, если локус моно-морфный [1].
Для изученных нами локусов PIC варьировал от 0 для Soygy2 до 0,76 для Satt9 (см. табл. 1). По ло-кусу Soygy2 в этой выборке сортов не обнаружено полиморфных аллелей, поэтому PIC равен нулю. Очень низкий индекс (0,06) у локуса Sat36 обусловлен тем, что только сорт Фора отличается от остальных (табл. 2). У локусов Satt 2 и Soyhsp176 PIC не очень высокий - 0,33 и 0,36 соответственно, но все же достаточный для использования их в целях идентификации и паспортизации сортов российской селекции. Остальные 5 локусов Sattl, Satt5, Satt9, Soypr 1, Sat 1 имеют PIC более 0,5, что говорит о целесообразности их использования для дифференциации изученной группы генотипов.
Среднее значение индекса полиморфности для использованной в данном исследовании маркерной системы равно 0,57. Это выше, чем в аналогичных исследованиях, выполненных, например, одесскими учеными на кукурузе. В их исследованиях среднее
значение индекса полиморфности маркерной системы варьировало от 0,53 до 0,56 в разных группах генотипов. При этом с помощью такой системы ими были дифференцированы 80 линий и гибридов кукурузы из разных областей Украины [2]. Для микросателлитных локусов ДНК сои подобные данные в литературе не приводятся.
В таблице 2 показаны результаты ПЦР-анализа сортов и форм сои селекции ВНИИМК и других российских селекцентров. Аллели SSR-локусов были представлены на фореграммах фрагментами ДНК разного молекулярного веса (длины пар нуклеотидов). Нумерацию аллелей по каждому локусу проводили следующим образом: фрагмент ДНК с максимальным значением молекулярного веса обозначали цифрой 1 и далее по мере уменьшения молекулярного веса цифрами 2, 3, 4 и 5. Ранее аллели обозначались нами строчными буквами латинского алфавита [7]. У сортов сои Вилана (ВНИИМК), Лада (ВНИИМК), СП 1422-1461 (ВНИИМК), Приморская (Благовещенск) было обнаружено по 2 фракции ДНК разного размера. В таблице 2 они обозначены двумя цифрами через запятую.
Для каждого генотипа сои получен определенный набор аллелей микросателлитных локусов, на основании которого были составлены молекулярногенетические паспорта этих генотипов или так называемые «генетические формулы генотипов». Большими буквами латинского алфавита обозначен код локуса, а цифрой - его аллельное состояние (табл. 3).
Несмотря на достаточный дискриминационный потенциал изученной системы, нам не удалось различить два генотипа селекции ВНИИМК - Вилана RP и Ника. Для них были получены идентичные наборы аллелей, представленные формулой А2Б2С2В1Б201Н21з. Вилана RP - это реплоид (форма с возвратной кратно пониженной плоидностью), полученный из сорта Вилана. Начиная с поколения С2, среди тетраплоидов обнаруживаются диплоидные формы, из которых одни не отличаются от исходного сорта, а другие имеют разные отличия по морфологическим, биохимическим и другим признакам. Это является следствием структурных изменений хромосом, возникших при их мультива-лентной коньюгации и неравном кроссинговере [8]. Сорт Ника и исходный для реплоида сорт Вилана отличаются друг от друга по трем микросателлит-ным локусам и происходят от скрещивания разных генотипов. Вероятно, полученные идентичные наборы аллелей генотипов Вилана RP и Ника свидетельствуют не об их общем происхождении, а о приобретенном сходстве в ходе мутационных событий. При увеличении количества анализируемых микросателлитных локусов, возможно, будут обнаружены различия между ними.
Для остальных 32 образцов сои получены уникальные наборы аллелей. Сорта отличаются между собой по одному и более локусам. К примеру, сорта Лань и Лакта, Валента, Рента и РВБ отличаются
Таблица 2 - Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК сортов и других генотипов сои селекции ВНИИМК
Сорт Локусы
Sattl Satt2 Satt3 Satt9 Soyprl Satl Sat36 Soyhspl76
Лань 2 2 2 l l l 2 3
Лира l l l 3 2 l 2 2
Фора 2 l 2 2 l 4 l 3
Валента 3 2 2 4 l 2 2 3
Дельта 3 2 2 З l l 2 3
Парма 3 l l 4 2 2 2 2
Рента 3 2 2 2 l 2 2 3
РВБ 3 2 2 3 l 2 2 3
РВФ 2 2 2 3 l 2 2 3
Веста 2 l 3 3 l l 2 3
Вилана 3,4 2 2 l l 2 2 3
Вилана тетраплоид* l 2 4 З l 2 2 3
Вилана ИР* 2 2 2 l 2 l 2 3
Лакта 2 2 2 2 l l 2 3
Ника 2 2 2 l 2 l 2 3
Дива 2 2 l З l l 2 3
Диана 2 l 2 2 2 2 2 3
Памела 3 l 2 3 l 4 2 3
Д-6 l 2 l 3 2 l 2 2
Д-4 l 2 l 3 2 2 2 2
Альба 2 2 2 3 2 4 2 3
Трембита 3 2 4 3 2 3 2 2
Лиана 3 2 4 2 2 2 2 2
Лада 3 2 3,2 4 2 2 2 2
Б-2 2 2 3 l l l 2 3
СП-1422-146 Г 2 2 2 2,4 l 4 2 3
Дуар (ВНИИМК, Армавир) 4 2 3 l l 2 2 3
Селекта 301 (Краснодар) 4 2 2 l l l 2 3
Кубанская 4958 (КОС ВИР) 4 2 3 З l 4 2 2
Ланцетная (Орел) 2 2 l 2 2 2 2 3
К-10641 (ВИР) 3 2 l 4 2 3 2 3
Куба (КОС ВИР) 2 2 3 l 2 l 2 3
Сибниисхоз 6 (Омск) l 2 3 l 2 l 2 3
Приморская 56 (Приморский край) l l 4 з,з l 2 2 3
" Тетраплоидная и реплоидные формы Таблица 3 — Формулы сортов сои
Сорт Формула' Сорт Формула
Лань А2B2C2DlElGlH2Із Памела A3BlC2D3ElG4H2I3
Лира AlBlClD3E2GlH2I2 Д-б AlB2ClD3E2GlH2I2
Фора A2BlC2D2ElG4HlI3 Д-4 AlB2ClD3E2G2H2I2
Валента A3B2C2D4ElG2H2I3 Альба A2B2C2D3E2G4H2I3
Дельта AзB2C2DзElGlH2Із Трембита A3B2C4D3E2G3H2I2
Парма A3BlClD4E2G2H2I2 Лиана A3B2C4D2E2G2H2I2
Рента A3B2C2D2ElG2H2I3 Лада A3B2C3C2D4E2G2H2I2
РВБ A3B2C2D3ElG2H2I3 Б-2 A2B2C3DlElGlH2I3
РВФ A2B2C2D2ElG2H2I3 СП-1422-1461 A2B2C2D2D4El G4H2I3
Веста A2BlC3D3ElGlH2I3 Селекта A4B2C2DlElGlH2I3
Вилана A3A4B2C2DlElG2H2I3 Дуар (ВНИИМК, Армавир) A4B2C3DlElG2H2I3
Вилана (тетраплоид) AlB2C4DзElG2H2Із Кубанская (ВНИИМК, Армавир) A4B2CзDзElG4H2І2
Вилана RP (реплоид) A2B2C2DlE2GlH2I3 Ланцетная (Орел) A2B2QD2E2G2H2I3
Лакта A2B2C2D2ElGlH2I3 К-10641 (ВИР) A3B2QD4E2G3H2I3
Ника A2B2C2DlE2GlH2I3 Куба (ВИР) A2B2C3DlE2GlH2I3
Дива A2B2ClDзElGlH2Із Сибниисхоз 6 (Омск) AlB2C3DlE2GlH2I3
Диана A2BlC2D2E3G2H2I3 Приморская 56 (Благовещенск) AlBlC4DзDзElG2H2Із
' код локуса A-Sattl; B-Satt2; C-Satt3; D-Satt9; E-Soyprl; G- Satl; H-Sat36; I-Soyhspl76.
друг от друга по одному локусу 8аИ9. У остальных сортов есть отличия по 2 и более локусам. Линии Д-6 и Д-4, являются сестринскими и поэтому очень похожи, но все же их можно различить по локусу 8ай1 (см. табл.2).
Если сравнивать сорта селекции ВНИИМК и других российских селекцентров, то только два сорта Куба (ВИР) и Б-2 (ВНИИМК) различаются минимум
по двум локусам Soypr1 и Sattl. У остальных обнаружены различия по большему количеству локусов.
Таким образом, в результате проведенных исследований для дифференциации сортов сои отечественной селекции предложена маркерная система из 8 микросател-литных локусов ДНК. На ее основе составлены формулы сортов, созданных в разных селек-центрах.
Показана идентичность двух генотипов - сорта сои Ника селекции ВНИИМК и реплоидной формы Вилана RP -по профилям ДНК. Предложенные формулы рекомендуем использовать при паспортизации и регистрации сортов сои в Российской Федерации.
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края, грант № 06-04-96757 и № 08-04-99058-р_ОФИ.
Литература
1. Использование ПЦР-анализа в генетико-селек-ционных исследованиях // Научнометодическое руководство / Под. ред. Сиволапа Ю. М. - Киев: Аграрна наука, 1998. - 156 с.
2. Кожухова Н. Э. Идентификация и регистрация генотипов кукурузы при помощи молекулярных маркеров / Н. Э. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Генетика. - 2004. - Т. 40. - № 1. - С. 59-66.
3. Maughan P. Microsatellite and amplified sequence length polymorphism in cultivated and wild soybean / P. Maughan, M. Saghai-Maroof, G. Buss // Genome. - 1995. - Vol. 38. - P. 715-723
4. Rongven J. The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype identification / J. Rongven, M. Ak-kaya, A. Bhagwat et al. // Theor. Appl. Genet. -1995. - Vol. 90. - P. 43-48.
5. Saghai-Maroof M. A. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheri-
tance, chromosomal location, and population dynamics / M. A. Saghai-Maroof, K. M. Soliman, R. A. Jorgensen, R. W. Allard // PNAS USA. - 1984. - 81. - P. 8014-8018.
6. Pejic I. Comparative analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs and AFLPs / I. Pejic, P. Ajmorne-Marsan, M. Morgante et al. // Theor. Appl. Genet. -1998. - Vol.97. - P. 1248-1255.
7. Рамазанова С. А. Использование анализа микросателлитных последовательностей ДНК в решении проблем селекции сортов сои / С. А. Рамазанова, С. З. Гучетль, Т. А. Челюстникова // Сборник метериалов 4-й межд. конф. молодых ученых и специалистов, ВНИИМК. - Краснодар, 2007. - С. 233-242.
8. Зеленцов С. В. Использование полиплоидной рекомбинации генома в увеличении полиморфизма у сои / С. В. Зеленцов // Доклады РАСХН. - 2002. -№ 3. - С. 3-5.
