CC BY
9УДК 630*165:577.21
О.А. Разумова, Л.В. Можаровская, С.В. Пантелеев, О.Ю. Баранов
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ ЦЕЛЛЮЛОЗОСИНТАЗ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ
Институт леса НАН Беларуси Республика Беларусь, 246050, г. Гомель, ул. Пролетарская, 71 e-mail: o-kovalevicch@mail.ru
С использованием высокопроизводительного секвенирования транскриптомов сосны обыкновенной идентифицировано пять генов, детерминирующих полипептиды с целлюлозосинтазной активностью. На основании полученных результатов проведена аннотация и структурно-функциональный анализ выявленных EST-маркеров. Проведенный сравнительный анализ идентифицированных паралогичных генов выявил высокий уровень сходства их организации.
Ключевые слова: сосна обыкновенная, высокопроизводительное секвенирование, целлюлозосинтаза, генетический полиморфизм.
Введение
Целлюлоза является одним из основных компонентов клеточной стенки большинства тканей растительных организмов. По химической структуре представляет собой биополимер — полисахарид, образованный остатками D-глюкозы, соединенными Р(1—^4)-гликозидной связью, что отличает ее от крахмала и гликогена, для которых характерно наличие соединений а(1—4)-типа. Данная особенность и определяет вытянутую стержневую конформацию макромолекулы целлюлозы, в отличие от спиралевидных структур, отмечаемых для амилозы крахмала [1-2].
Целлюлоза имеет важное экономическое значение, представляя собой исходное сырье для последующей химической модификации, синтеза или гидролиза, а также являющееся составным компонентом различных видов волокнистых материалов. В настоящее время основными источниками для промышленного получения целлюлозы являются хлопок и древесная масса. При этом, по отношению к древесным растениям, важное технологическое значение (как для процесса получения, так и технических свойств целлюлозы) имеет видовая принадлежность источника сырья. Так, различные древесные породы отличаются не только по содержанию целлюлозы в древесине, но и по степени ее полимеризации, длине и структуре полимерных фибрилл [2].
Биогенез целлюлозных волокон основан на формировании высокоупорядоченных структур (кристаллитов), представляющих собой совокупность плотноупакованных параллельно расположенных полимерных цепей. В образовании кристаллитов главная роль отводится ферментам — целлюлозосинтазам, осуществляющим формирование микрофибрилл целлюлозы. Как правило, целлюлозосинтазы собраны в единый синтезирующий комплекс (розетку), состоящий по современным представлениям из 18-36 отдельных ферментных единиц и производящий одновременную полимеризацию 18-36 глю-кановых цепей [3]. В то же время для разных древесных пород состав и структура синтезирующего комплекса может варьировать в определенной степени, что в свою очередь выражается в видоспецифичности строения целлюлозного волокна. Кроме того, для большинства древесных растений выявлены и онтогенетические особенности образования структуры целлюлозных фибрилл, что обусловлено дифференциальной экспрессией генов, кодирующих целлюлозосинтазы на разных стадиях формирования тканей и органов индивидов. Наиболее типичным примером являются различия в организации целлюлозных волокон при биогенезе первичной и вторичной клеточной стенки.
Сложный полигенный характер наследственной детерминации процессов биосинтеза целлюлозы является результатом эволюционных
преобразований, обеспечивающих более высокий уровень морфофизиологической организации растительных организмов и направленных на повышение адаптационного потенциала биологических видов [1, 4].
Таким образом, совокупность локусов, детерминирующих процессы биосинтеза целлюлозы, особенности их первичной структуры и характер экспрессии являются одним из ключевых факторов, определяющих физико-химические свойства и техническое качество целлюлозного волокна. К настоящему времени гены, кодирующие целлюлозосинтазы (CesA), описаны более чем для 170 видов растений, среди которых наибольшую изученность получил Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., геном которого содержит 10 генов целлюлозосинтаз (CesA) и 30 целлюло-зосинтаза-подобных генов (Csl). Для древесных растений наследственные аспекты биосинтеза целлюлозы детально рассмотрены у различных видов тополей, сосны ладанной, ели сизой. Что касается сосны обыкновенной, то исследования в данной области проведены лишь частично, а полученные результаты являются разноплановыми и фрагментарными [4].
Исходя из вышесказанного, цель данной работы — идентификация генов целлюлозосин-тазы в транскриптоме сосны обыкновенной и проведение их сравнительного анализа.
Материалы и методы
Объектом для проведения исследований являлись как взрослые деревья (фрагменты одревесневших вегетирующих побегов), так и ювенильные растения (проростки) сосны обыкновенной. Общее число образцов тканей взрослых растений составило шесть шт., проростков — восемь шт. Выделение тотальной РНК из растительных тканей проводили с применением набора GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, США) по методике фирмы-производителя. Очистку РНК от примесей геномной ДНК выполняли набором DNase I, RNase-free (Thermo Fisher Scientific, США), а для ингибирования рибо-нуклеаз использовали RNase Inhibitor (Thermo Fisher Scientific, США). Для реакции обратной транскрипции матричной РНК с получением двухцепочечной кДНК использовали набор Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, США).
Создание библиотек кДНК (размер фрагмента ~ 200 п. н.) проводили с использованием набора Ion Plus Fragment Library Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Эмульсионную ПЦР выполняли с применением набора Ion PGM Template OT2 200 Kit (Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции компании-производителя в планшетном амплификаторе Ion One Touch 2 System (Thermo Fisher Scientific, США). Этап обогащения микросфер производился с использованием автоматической про-боподготовки Ion One Touch ES с применением наборов Ion PGM Template OT2 Solutions 200 Kit и Ion PGM Enrichment Beads (Thermo Fisher Scientific, США). Реакцию секвенирования выполняли на базе геномного анализатора Ion PGM System (Thermo Fisher Scientific, США) с применением набора Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 и полупроводникового микрочипа Ion 314 Chip v2 (Thermo Fisher Scientific, США). Первоначальную обработку данных, поступающих от геномного анализатора, осуществляли в автоматическом режиме при помощи программного обеспечения IonTorrent Suite v. 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Окончательную обработку информации и сборку транс-криптов генов производили с использованием программного обеспечения SeqMan NGen v. 11 (DNASTAR, Израиль).
Для идентификации кодирующих последовательностей целлюлозосинтаз использовали референсные последовательности CesA- и Csl-локусов Pinus taeda L., размещенных в базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank NCBI. Трансляцию нуклео-тидных последовательностей с последующим множественным выравниванием проводили в программном пакете CLC Sequence Viewer 6.3 (Qiagen, США). Вторичная структура белковых молекул устанавливалась с использованием программы Phyre2 (http://www.sbg. bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index), 3 D-моделирование проводилось на сервере программы SWISS-MODEL (https:// swissmodel.expasy.org/).
Результаты и обсуждение
На основе сборки нуклеотидных последовательностей, полученных в ходе секве-нирования транскриптома P. sylvestris были идентифицированы транскрипты трех генов
CesA-суперсемейства: CesAl — ген, кодирующий целлюлозосинтазу 1 (99% сходство с депонентом GenBank AY789650.1 (CesAl P. taeda); CesA2 — ген, кодирующий целлюлозосинтазу 2 (99% сходство с депонентом GenBank AY789651.1 (CesA2 P. taeda); CesA3 — ген, кодирующий целлюлозосинтазу 3 (99% сходство с депонентом GenBank AY789652.1 (CesA3 P. taeda).
С использованием онлайн-сервиса поиска консервативных функциональных доменов CD-Search NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi), в транслируемых последовательностях идентифицированных транскриптов было изучено расположение функциональных доменов. На основании результатов сравнительного анализа установлено, что структурно-функциональная организация CESA1, CESA2 и CESA3 сосны обыкновенной является сходной и совпадает с описанными аналогами для других растительных организмов.
В N-концевой области полипептида идентифицирован цинк-связывающий консервативный домен RING («цинковый палец») подкласса HC. Детальное описание RING-домена приведено в работе П. Косарева с соавторами на примере целлюлозосинтазы A (CESA) Arabidopsis thaliana [5]. Согласно литературным данным, данный домен участвует в процессе сборки и стабилизации каталитического комплекса («розетки») целлюлозосинтаз [5-7]. Проведенное изучение домена RING показало, что среди идентифицированных целлюлозо-синтаз (CESA1, CESA2, CESA3) сосны обыкновенной основные отличия были связаны с наличием, а также количественным содержанием аминокислотных остатков цистеина (С) и гистидина (Н), необходимых для связывания ионов цинка и определяющих формирование третичной структуры. Так, для цинк-связывающего домена пептида CESA1 была
установлена следующая С/Н конфигурация — 3(С)Н5(С)НС, для CESA2 и CESA3 — 2(С) Н7(С) и 8(С) соответственно.
Для цинк-связывающего консервативного домена RING CesA сосны обыкновенной (in silico) была установлена вторичная структура (рис. 1) и проведено 3D-моделирование (рис. 2). Как видно из рис. 1, вторичная структура домена RING характеризовалась наличием одной a-спирали и двух в-цепей.
Построение 3D-модели проводилось на основе структурного шаблона домена RING каталитической субъединицы IRX3 целлюлозосинтазы Arabidopsis thaliana (SMTL ID: 1weo.1), полученной методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса Н. Тейлором с соавторами (рис. 2) [8-9].
На рис. 2 темным цветом выделены остатки цистеина, отмечены a-спирали (a), в-цепи (в-1, в-2), а также Zn-связывающий сайт (Zn). Также указано направление аминокислотной последовательности домена от N- к C-концу. Как следует из результатов анализа полученных трехмерных моделей доменов RING, наблюдается относительное сходство структуры пространственной конформации и расположения a-спиралей, в-цепей и аминокислотных остатков цистеина. В то же время в ходе моделирования in silico для CESA1 не был выявлен Zn-связывающий сайт, идентифицированный у CESA2 и CESA3, что, по всей видимости, связано c ограниченными возможностями алгоритмов поиска функциональных центров в случае полиморфных последовательностей.
Дальнейший анализ структурно-функциональной организации CESA сосны обыкновенной позволил идентифицировать основной каталитической домен, примыкающий к RING-области. Детальное изучение каталитического региона показало, что он состоит из нескольких субдоменов, порядок расположения которых для изученных CESA1,
Рис. 1. Схема вторичной структуры домена RING CesA сосны обыкновенной
Рис. 2. 3D-модель доменов RING CesAl (А), CesA2 (Б), CesA3 (В) сосны обыкновенной
CESA2 и CESA3 сосны обыкновенной был идентичным. Так, в начале каталитического домена был расположен гипервариабельный регион (HVR1), обозначаемый также как класс-специфический регион (CSR1). Согласно литературным данным, первичная структура CSRl-региона является сходной среди ортологичных целлюлозосинтаз, относящихся к определенному классу (типу), но существенно отличается среди паралогич-ных локусов CESA, даже в пределах одного вида растений [4, 10-14]. Как и ожидалось, проведенное сопоставление аминокислотных последовательностей CSRl-региона CESA1, CESA2 и CESA3 сосны обыкновенной показало высокий уровень различий: выявлено более 95% полиморфных сайтов аминокислотных остатков (рис 3).
Кроме CSRl-субдомена в каталитическом домене CESA был идентифицирован второй гипервариабельный регион HVR2 (CSR2), фланкированный высококонсервативными A и B субдоменами, обозначаемыми как CR1 и CR2. Данная особенность структурной организации каталитического домена позволяет разработать универсальные праймеры для ПЦР-амплификации и анализа HVR2 региона
CesA различных растений [15]. Выявленный уровень различий между первичными структурами Н^-региона CESA1, CESA2 и CESA3 сосны обыкновенной был ниже (порядка 70% полиморфных сайтов) по сравнению с HVR1. Такое различие в данном регионе может быть объяснено его функциональной значимостью — наличием в HVR2-регионе каталитического центра, определяющего взаимодействие с N-концевым доменом CR1 или RING-регионом, необходимым для формирования специфичной структуры активной молекулы фермента [16]. Так, в участке протяженностью от 9 (CESA3) до 14 (CESA1, CESA2) аминокислотных остатков CSR2-региона, исследуемых целлюлозосинтаз сосны, было выявлено высокое содержание ци-стеиновых оснований (четыре для CESA3, семь для CESA2 и девять для CESA1), определяющих специфичность конформации третичной структуры белковой молекулы.
В ряде исследований, кроме описанного выше CSR2-региона, функциональная активность целлюлозосинтазы также ассоциирована с четырьмя консервативными мотивами, содержащими аминокислотные остатки D...D...D... и (Q / R) XRW [13, 16-18]. У сосны обыкновенной для CESA1, CESA2 и
CESA3 также было выявлено наличие указанных консервативных мотивов: DD и DCD в CRl-регионе, TED и QVLRW в регионе CR2.
Согласно литературным данным, субдомен CR2 является заключительным регионом макромолекулы целлюлозосинтазы, обращенным в цитозоль клеток растений. Последующая
за ним С-концевая область, содержащая 6-8 а-спиралей, локализована в трансмембранном пространстве и не принимает участие в биосинтезе целлюлозы [16-17].
В результате моделирования общей структуры макромолекул CESA1, CESA2 и CESA3 сосны обыкновенной установлено (рис. 4),
160 I
ДЮ I
СезАЗ
CesA?
CesAl
Consensus ноя Conservation
СезАЗ CesA:? CesAl Consensus
1ÜH
Conservation
DI EHEFNVETÜL RMRQQI TEAM LHGRMSYGRG l>DDEN£QI AHNPELPPQ I PV LANG
II BaPlNMl--- lllasl........IsHiGN aBdatpraahs......... |an-
P N FEKVEA..................................-.............
D X EXEFNXE--- RXROXX........XSXXXX XXDXX XX ХАН X......... XAN -
In I hi II - Irl I Ч Г ~Г1---1- I—mJ
1ПППП -ad. 1П1--\ГГ\ I 1ПППГПППГПП
Z33 t№
I I I
HSllSG l|PTS||A|N all AN PA«| - ------JHlRS 5| PG 5||m|pn|||g S
........-BSMNCCM |A|S|PP|M| GpSlSVQiBPHAAT^lGNG- -ИрР^КЁ- ■
.........TDYEGEG 5CRV...... DEFNDSttHNyETKDGNSk ........-
........-TSrXODN YXLXXPXXX- •DSXXXXXXXHXXTXXGNGX >-HDP*XX-. -
хдШг
пппппп nnni II II Ini tni I Uni Innf Innnn nl II 1пплппппПппПпп1 1ППп пппППг.пппп г
СеаАЗ СегАг CesAl Consensus
IHK
Conservation
оч ППП1
» xu a
I I I
|G|GN|9W| l|G|G||3|- |N|SGQHMT|G||QBH<3G| G-PN|P||H DPDMPHT
- NIGSAAWI 1I|INW|a|H dkksüsII-.......1G(V □ - pDEAQ||M -----мт
----GflAWK IIHisvtlBHI SKKKTAASKTVN----PCIE üIpeotHdpe аееамы.
-XXGXVAWK ERVEXWKSKX XKKSGXXXXTXXi т > - КЙЯК G•PXEXXDXX XXXXXMT
jQ
in nl
mnnl Inrmnnnl
_
пп ППППП
Рис. 3. Сопоставление аминокислотных последовательностей HVRl-региона CesAl, CesA2 и CesA3 сосны
обыкновенной
Рис. 4. 3Б-модель пространственной структуры CESA1 (А), CESA2 (Б), CESA3 сосны обыкновенной
что они являются в определенной степени консервативными и характеризуются наличием 14-16 a-спиралей (14-а для CESA1; 15-а для CESA2; 16-а для CESA3) и 7 (CESA2)-8 (CESA1, CESA3) в-цепей. Восемь a-спиралей расположены в С-концевой трансмембранной области, что является сходным для большого числа изученных растений. Для семи в-цепей целлюлозосинтаз характерно формирование в-листа смешанной структуры, состоящего из параллельных и антипараллельных цепей. В целом описанная трехмерная модель идентифицированных нами целлюлозосинтаз сосны обыкновенной гомологична модели, полученной in silico Л. Сетхафонга с соавторами для CESA1 хлопчатника обыкновенного [12].
Наряду с генами CesA-семейства, в транс-криптоме сосны обыкновенной идентифицированы два целлюлозосинтаза-подобных гена (CslAl и CslA2). Проведенный структурно-функциональный анализ CSLA1 и CSLA2 показал, что в отличие от CESA-семейства в составе целлюлозосинтаза-подобных полипептидов отсутствует Zn-связывающий домен. В то же время в аминокислотной последовательности всех CSLA полипептидов, как и в случае CESA идентифицированы D...D...D... и QXXRW-мотивы.
Проведенный сравнительный анализ CesA и CslA генов среди различных видов хвойных растений показал, что в целом степень генетической дифференциации соответствовала существующей систематике родов Pinus и Picea (таблица).
Таблица
Степень генетической дифференциации CesA и CslA генов
№ п/п Вид Гены
CesAl CesA2 CesA3 CslAl CslA2
1 Pinus taeda 99 % 99 % 95 % 98 % 95 %
2 Pinus radiata 95 % - 98 % - -
3 Pinus pinaster 94 % - - - 95 %
4 Pinus chapensis 97 % 87 % - - -
5 Pinus auacahuite 98 % - - - -
6 Pinus moiieda 96 % - - - -
7 Pinus strobes 96 % - - - -
9 Picea glauca 92 % 99 % 88 % 93 % 92 %
Заключение
В результате проведенных исследований в транскриптоме сосны обыкновенной идентифицировано пять генов, ассоциированных с биогенезом целлюлолозы: CesA1, CesA2, CesA3, CslА1 и CslА2. Установлено, что гены семейства CesA являются паралогами, характеризуются сходной структурно-функциональной организацией, несмотря на высокий уровень различий первичной структуры, выявляемый между некоторыми доменами. Основные отличительные особенности от-
мечались в регионах HVR1 и HVR2. В каталитическом центре CESA1, CESA2 и CESA3 идентифицированы сходные аминокислотные мотивы: DD и DCD (для CR1), TED и QVLRW (для CR2). Различия в структурно-функциональной организации генов CslA от CesA связаны с отсутствием области, кодирующей Zn-связывающий домен. При этом первичная структура каталитического центра полипептидов CSLA и CESA является сходной, что также указывает на общность их происхождения.
Список использованных источников
1. Титок, ВВ., Леонтьев, ВН., Федо-ренко, И.В., Кубрак, С.В., Юренкова, С.И., Грушецкая, З.Е. Биосинтез целлюлозы: современный взгляд и концепции // Труды БГТУ — 2007. — Т. 2, № 1. — С. 54-64.
2. Галиновский, Д.В., Леонтьев, В.Н., Никитинская, Т.В., Райский, А.П., Хотылева, Л.В., Титок, В.В. Идентификация CesA-генов, экспрессирующихся в стеблях растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) // Доклады НАН Беларуси. —2010. — Т. 54, № 3. — С. 92-97.
3. Fernandes, A.N., Thomas, L.H., Altaner, C.M., Callow, P., Forsyth, V.T., Apperley, D.C., Kennedy, C.J., Jarvis, M.C. Nanostructure of cellulose microfibrils in spruce wood // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2011 — Vol.108(47): E1195-203. — P. 1-9.
4. Галиновский, Д.В., Леонтьев, В.Н., Никитинская, Т.В., Райский, А.П., Хотылева, Л.В., Титок, В.В. Молекулярно-генетический анализ целлюлозосинтаз, экспрессирующихся в различных органах растения льна-долгунца // Труды БГТУ. Серия 4: Химия, технология органических веществ и биотехнология. — 2009. — Т. 1, № 4. — С. 178-182.
5. Kosarev, P., Mayer, K.F.X., Hardtke, C.S. Evaluation and classification of RING-finger domains encoded by the Arabidopsis genome // Genome biology. — 2002. — Vol. 3, № 4. — Research0016.
6. Kurek, I., Kawagoe, Y., Jacob-Wilk, D., Doblin, M., Delmer, D. Dimerization of cotton fiber cellulose synthase catalytic subunits occurs via oxidation of the zinc-binding domains // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2002. — Vol. 99, № 17. — P. 11109-11114.
7. Ma, K., Xiao, J., Li, X., Zhang, Q., Lian, X. Sequence and expression analysis of the C3HC4-type RING finger gene family in rice // Gene. — 2009. — Vol. 444, № 1. — P. 33-45.
8. Taylor, N.G., Laurie, S., Turner, S.R. Multiple cellulose synthase catalytic subunits are required for cellulose synthesis in Arabidopsis // The plant cell. — 2000. — Vol. 12, № 12. — P. 2529-2539.
9. Taylor, N.G. Identification of cellulose synthase AtCesA7 (IRX3) in vivo phosphoryla-
tion sites — a potential role in regulating protein degradation // Plant molecular biology. — 2007. — Vol. 64, № 1-2. — P. 161-171.
10. Liang, X., Joshi, C.P. Molecular cloning of ten distinct hypervariable regions from the cellulose synthase gene superfamily in aspen trees // Tree physiology. — 2004. — Vol. 24, № 5. — P. 543-550.
11. Ranik, M., Myburg, A.A. Six new cellulose synthase genes from Eucalyptus are associated with primary and secondary cell wall biosynthesis // Tree physiology. — 2006. — Vol. 26, № 5. — P. 545-556.
12. Sethaphong, L., Haigler, C.H., Ku-bicki, J.D., Zimmer, J., Bonetta, D., DeBolt, S., Yingling, Y. G. Tertiary model of a plant cellulose synthase // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2013. — Vol. 110, № 18. — P. 7512-7517.
13. Pear, J.R., Kawagoe, Y., Schreckengost, W.E., Delmer, D.P., Stalker, D M. Higher plants contain homologs of the bacterial CelA genes encoding the catalytic subunit of cellulose synthase // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 1996. — Vol. 93, № 22. — P. 12637-12642.
14. Doblin, M.S., Kurek, I., Jacob-Wilk, D., Delmer, D.P. Cellulose biosynthesis in plants: from genes to rosettes // Plant and cell physiology. — 2002. — Vol. 43, № 12. — P. 1407-1420.
15. Грушецкая, З.Е., Титок, В.В., Леонтьев, В.Н., Галиновский, Д.В., Лемеш,
B.А. Молекулярно-генетическая структура генов их роль в формировании клеточных стенок растений // Труды БГТУ Серия 4: Химия, технология органических веществ и биотехнология. — 2008. — Т. 1, № 4. —
C.158-160.
16. Scavuzzo-Duggan, T. Functional analysis of the cellulose synthase class specific region in Physcomitrella patens. — 2014. — 50 p.
17. Morgan, J.L. W., Strumillo, J., Zimmer, J. Crystallographic snapshot of cellulose synthesis and membrane translocation // Nature. — 2013. —Vol. 493, № 7431. — P. 181.
18. Krauskopf, E., Harris, P.J., Putterill, J. The cellulose synthase gene PrCESA10 is involved in cellulose biosynthesis in developing tracheids of the gymnosperm Pinusradiata // Gene. — 2005. — Vol. 350, № 2. — P. 107-116.
O.A. Razumova, L.V. Mozharovskaya, S.V. Panteleev, O.Yu. Baranov
IDENTIFICATION AND COMPARATIVE ANALYSIS OF THE CELLULOSE SYNTHASE GENES OF SCOTS PINE
Institute of Forest of NASB Gomel, 246050, the Republic of Belarus
Using high-throughput sequencing of Scots pine transcriptomes, five genes that determine polypeptides with the cellulose synthase activity were identified. Based on the obtained results, an annotation and structural-functional analysis of identified EST markers was performed. A comparative analysis of identified paralogic genes revealed a high level of similarity in their organization.
Key words: Scotch pine, next-generation sequencing, cellulose synthase, genetic polymorphism.
Дата поступления статьи: 1 февраля 2019 г.
