CC BY
487
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА___________
УДК 615.07(07.07)
Ю. Ю. Беляева, И. Я. Моисеева, А. В. Кузнецова
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОДНОСТАДИЙНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ ПРЕПАРАТА «РЕВИТ» МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Аннотация. Разработан анализ мультивитаминного препарата «Ревит» методом тонкослойной хроматографии. Определен состав подвижной фазы для разделения четырех витаминов препарата «Ревит» - н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:1). Показана возможность качественного обнаружения четырех витаминов в препарате «Ревит». Выявлено, что витамины С и В2 в растворе не совместимы друг с другом.
Ключевые слова: витамины, «Ревит», тонкослойная хроматография, разделение.
Abstract. A novel thin layer chromatographic method for identification of four vitamins from dragee “Revit” has been developed. A mobile phase constituting a butan-1-ol, water and glacial acetic acid was identified as the most favorable mixture. The resolved spots were identified by chemical reactions and visualization at 254 and 365 nm in a closed UV cabinet. Incompatibility of thiamine hydrochloride and ascorbic acid in one solution is pointed out.
Keywords: vitamins, “Revitum”, thin layer chromatography, separation.
Введение
Витамины - это биологически активные органические соединения, необходимые для протекания обменных процессов в организме. Биохимическая роль витаминов состоит в том, что они являются коферментами или их составной частью. Большинство витаминов не синтезируется в организме человека и поступает с пищей. При недостаточном содержании витаминов в пище развивается гиповитаминоз или авитаминоз. В этих случаях назначают витаминные препараты [1].
Появление на фармацевтическом рынке многокомпонентных витаминных препаратов ставит задачу определения их состава и содержания различных витаминов, количество которых может сильно варьировать.
Определение витаминов проводят различными методами. Наиболее известны из них титриметрические, колориметрические, флуориметрические. Данные методики являются, как правило, трудоемкими, требуют больших затрат времени и реактивов [2-4].
Целью нашей работы была разработка экспрессного метода определения витаминов в комплексном поливитаминном препарате «Ревит».
Были поставлены следующие задачи:
1) разработать способ подготовки драже к анализу;
2) исследовать реакции качественного обнаружения витаминов;
3) подобрать оптимальный состав подвижной фазы для разделения четырех витаминов препарата «Ревит» методом тонкослойной хроматографии;
4) исследовать условия детекции и идентификации четырех витаминов оптическими и химическими методами.
1 Материал и методы исследования
Подготовка драже «Ревит» к анализу
Для анализа использовали драже «Ревит» (Dragee “Revitum”) ОАО «Мар-биофарм» (Россия, г. Йошкар-Ола). Две таблетки препарата истирали в ступке до порошкообразного состояния. Добавляли 2 мл смеси тетрахлорметан СС14 - эфир (4:1), затем 2 мл воды. Экстракцию проводили при энергичном встряхивании раствора. При этом жирорастворимый витамин (А) экстрагировался в органическую фазу.
Элюирующие системы
Элюирующие системы готовили путем смешивания растворов в указанном соотношении непосредственно перед использованием. Задействовали две системы: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:1) и (60:15:25), а также систему вода - этанол (20:120). Время насыщения хроматографической камеры парами элюента - 20 мин.
Тонкослойная хроматография
Для проведения тонкослойной хроматографии фракций препарата «Ре-вит» использовали пластины марки «Сорбфил» (ТУ 26-11-17-89, ЗАО «Сорб-полимер, г. Краснодар) с полимерной подложкой размером 10x10 см. Пластины перед проведением анализа активировали в 10 % растворе аммиака. На хроматограмму наносили хлороформное и водное извлечения из драже. Использовали камеры для хроматографирования 150x120x80 мм. Время элюирования - 1,5 ч.
Обнаружение витаминов
Для определения тиамин-хлорида (витамина В1) хроматографическую пластину опрыскивали следующим раствором: 1,5 мл 1 % водного раствора гексацианоферрата (Ш) калия, 20 мл дист. H2O, 10 мл 15 % раствора NaOH. Высушенные пластины помещали в хроматографический облучатель УФС-254-365 (ТУ 42154-004-16943778-99) и просматривали в длинноволновом ультрафиолетовом свете (365 нм). Наблюдали ярко-голубую флуоресценцию.
Детектирование рибофлавина (витамина В2) и ретинола пальмитата (витамина А) проводили по собственной флуоресценции в УФ-свете (яркожелтое пятно при длине волны 365 нм).
Обнаружение аскорбиновой кислоты (витамина С) проводили, инкубируя пластину в камере с I2.
В качестве стандартов для определения витаминов использовали: аскорбиновую кислоту (ООО «Полисинтез», Россия), раствор препарата «Ае-
вит» (одна капсула содержит ретинола пальмитата 100 000 МЕ и альфа-токоферола ацетата 100 МЕ, ее содержимое разбавили до 1 мл системой тет-рахлорметан СС14 - эфир), тиамин-хлорид для инъекций.
2 Результаты исследования и их обсуждение
В качестве объекта анализа использовали поливитаминный препарат «Ревит» (“ЯеугШт”), представляющий собой драже оранжевого цвета, сферической формы. Это поливитаминное лекарственное средство повышает общую неспецифическую сопротивляемость организма.
Подготовка лекарственной формы «Ревит» к анализу и реакции идентификации компонентов препарата
Комплексный препарат «Ревит» содержит четыре витамина (А - ретинола пальмитат, В1 - тиамин-хлорид, В2 - рибофлавин, С - аскорбиновая кислота) (рис. 1) и вспомогательные вещества. Витамин А - жирорастворимый витамин, витамины группы В и С - водорастворимые. Для анализа драже растирали в ступке и растворяли в гидрофобной системе растворителей СС14 -эфир (4:1), при этом переходил в раствор витамин А. Затем водорастворимые витамины экстрагировали дистиллированной водой. После разделения водную и органическую фазы отделяли друг от друга и использовали для дальнейших исследований.
НО
Н,С N ЫН,
НС С-СНгСНгОН
\ / 22 К
в)
г)
Рис. 1 Химические формулы витаминов, входящих в состав препарата «Ревит»: а - витамин В2; б - витамин С; в - витамин В1; г - витамин А
Химический контроль препарата «Ревит» проводили методом качественного анализа [5]. Водорастворимую фракцию исследовали на присутствие витаминов В1, В2 и аскорбиновой кислоты.
Для обнаружения витамина В1 прибавляли раствор красной кровяной соли, раствор едкого натра и бутилового спирта. В верхнем слое наблюдали синюю флуоресценцию, которая исчезала при подкислении (добавлении НС1) и вновь появлялась при подщелачивании.
Реакция обусловлена образованием тиохрома, который, переходя в органический слой, вызывает его синюю флюоресценцию.
Для обнаружения витамина В2 (рибофлавина) водную фазу просматривали в длинноволновом УФ-свете. Наблюдали интенсивную зеленую флуоресценцию, которая исчезала при добавлении хлористоводородной кислоты. Этот эффект обусловлен отщеплением рибозы в кислой среде с образованием люмихрома, имеющего желтое окрашивание, но не флуоресцирующего.
Аскорбиновую кислоту обнаруживали по появлению серого осадка серебра при реакции с раствором серебра нитрата (реактив Толленса).
Доказательство химической несовместимости витаминов В2 и аскорбиновой кислоты в растворе
Нами была обнаружена химическая нестабильность витаминов В2 и С в растворе при совместном присутствии. Так характерной особенностью рибофлавина (витамина В2) является светочувствительность [6, 7]. Под воздействием света происходит изменение в структуре молекулы рибофлавина -отщепление остатка рибозы (рис. 1). Этот процесс ускоряется в кислой среде аскорбиновой кислоты (витамин С). Мы отмечали разное поведение рибофлавина при хроматографировании непосредственно после приготовления водной вытяжки препарата «Ревит» и через 1 ч после инкубирования при комнатной температуре. Таким образом, витамины В2 и С в растворе не совместимы.
При анализе водной и органической фракций препарата «Ревит» методом тонкослойной хроматографии все определения проводили сразу же после растворения драже в затемненном месте.
Разработка одновременного определения компонентов препарата «Ревит» методом тонкослойной хроматографии
В настоящее время тонкослойная хроматография занимает одно из ведущих мест в качественном и полуколичественном анализе фармацевтических объектов.
Классическая, наиболее простая и широко используемая методика тонкослойной хроматографии включает проведение следующих основных операций:
1) нанесение анализируемой пробы на слой сорбента;
2) разделение компонентов пробы на отдельные зоны в потоке подвижной фазы;
3) обнаружение зон на слое сорбента (часто с помощью реагента, образующего с разделенными веществами окрашенные соединения);
4) количественная оценка полученного разделения.
Качественной характеристикой вещества является величина КГ, которая равна отношению расстояния от стартовой линии до центра зоны вещества к расстоянию от стартовой линии до линии фронта. Значение КГ - величина постоянная для данного соединения в данной системе. Она зависит от ряда условий: способа элюирования, качества и активности сорбента, толщины слоя, качества растворителей, количества нанесенного вещества, длины пробега растворителей, положения стартовой линии - и почти не зависит от температуры. По этой величине проводят идентификацию компонентов в смеси.
Количественную оценку соединения проводят, оценивая площадь зоны вещества методом денситометрии.
Тонкослойная хроматография широко используется в анализе индивидуальных витаминов [8, 9]. Мы исследовали методы определения разных витаминов, предлагаемых Фармакопеями США и Британии (табл. 1). Для жирорастворимых витаминов обычно используются неполярные гидрофобные системы, а для водорастворимых - полярные растворители [10, 11]. В Фармакопее Британии предлагается система для анализа детских поливитаминных капель, содержащих витамины А, Б и С. Методик анализа поливитаминных препаратов, сходных по составу с препаратом «Ревит», не приводится.
Таким образом, представлялось интересным разработать методику экспресс-анализа мультивитаминного препарата «Ревит».
При разделении сложных объектов необходимо экспериментально подобрать условия разделения. Наибольшее влияние на это оказывает растворитель, поэтому нами была проведена работа по подбору элюентов для разделения витаминов.
В качестве подвижных фаз для разделения четырех витаминов препарата «Ревит» мы использовали следующие системы:
1) н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (БУВ) (4:1:1);
2) н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (БУВ) (60:15:25);
3) вода - этанол (ВЭ) (20:120).
На хроматограмму наносили органическую и водную фазы экстрактов препарата «Ревит».
Для визуальной оценки пятен использовали детекцию в УФ-свете (254 и 365 нм). Рибофлавин проявлялся в виде яркого флуоресцирующего пятна в длинноволновом УФ-свете (365 нм) (рис. 2). При облучении светом с длиной волны 254 нм флуоресценция оказывалась слабее. Также светящимся пятном проявлялся витамин А.
Аскорбиновая кислота давала темные пятна в видимой области и УФ-свете. Более наглядно для детекции витамина С можно использовать инкубацию пластины в йодной камере. При этом наблюдается желтая окраска зон, соответствующих кислоте аскорбиновой. Для определения тиамина хлорида (витамин В1) использовали реакцию тиамина с гексацианоферратом (Ш) калия в щелочной среде. Продукт реакции дает интенсивную голубую флуоресценцию при УФ-облучении в длинноволновой области УФ-спектра (365 нм).
Для каждой элюирующей системы определены величины КГ - относительные скорости перемещения компонентов (табл. 2).
В системе вода - этанол и БУВ (60:15:25) происходит очень сильное размывание пятна рибофлавина, возможно, из-за его деструкции в кислой среде в присутствии аскорбиновой кислоты. Поэтому величина КГ для этого витамина определена приблизительно.
В системах бутанол - ледяная уксусная кислота - вода одновременно удалось детектировать все четыре витамина препарата «Ревит». Оказалось, что увеличение полярности системы (за счет увеличения содержания воды) приводит усилению сродства системы к тиамин хлориду (В1). В системе БУВ (4:1:1) этот витамин остается на старте (КГ = 0), а в системе БУВ (60:15:25) КГ = 0,03. Практически одинаково в этих двух системах ведет себя ретинола пальмитат.
Таблица 1
Анализ витаминов методом тонкослойной хроматографии
№ п/п Определяемое вещество Растворитель Подвижная фаза Детектирование пятен
1 Биотин (Biotin) Уксусная кислота (лед.) Метанол - уксусная кислота (лед.) - толуол (5:25:75) 4-диметипаминоциннамальдегид
2 Эргокальциферол (.ErgocalciferoT) Этиленхлорид (1,2-дихлорэтан) Циклогексан - эфир (эквивалентное количество) Хлорид сурьмы
3 Рибофлавин (Riboflavin) (impuritiy -%umiflavin) Метиленхлорид Вода УФ(А = 365 нм)
4 Ретинол (Vitamin А) Циклогексан Эфир - циклогексан (20:80) УФ (X = 254 нм)
5 Цианкобаламин (>Cyanocobalamin) Спирт - вода (1:1) Аммиак (ж) - метанол -метжпенхлорид (9:30:45) При дневном свете в сравнении с тест-раствором
6 Эргокальциферол (Ergocaleiferol) Циклогексан Эфир - циклогексан (20:80) УФ (к = 254 нм)
7 Пиридоксин (Pyridoxine Hydrochloride) Вода Аммиак (конц.) -метиленхлорид -ТГФ-ацетон (9:13:13:65) 1,2-дихлорхинон-4-хлоримид
8 Фолиевая кислота (Folic Acid) Аммиак і кона) - метанол (2:9) Аммиак (конц.) - н-пропанол -этанол (20:20:60) УФ (А = 365 им)
Лекарственные формы
9 Детские витаминные капли (Paediatric Vitamins А, С, and D oral drops) Вода Вода - этанол (20:120) УФ (к = 254 нм)
10 Т аблетки тиамина (Thiamine Tablets) Вода н-бутанол - вода - уксусная кис. юга (лед.) (60:25:15) Гексацианоферрат (III) калия -NaOH (1:1), УФ (X =365 нм)
11 Таблетки аскорбиновой кислоты (Ascorbinic Acid Tablets') Вода Вода - этанол (20:120) УФ (к = 254 нм)
Известия высших учебных заведений. Поволжский регион
Витамин А
линия фннпша
Витамин С
1 2 3 4 5
•-----•------•-------•—■—•-
линия старта _____________________________________
Рис. 2 Хроматограмма драже «Аевит» в системе бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:1), детекция в УФ-свете (X = 365 нм): 1 - раствор витамина С (стандарт); 2 - водная фаза, 5 мкл; 3 - водная фаза, 10 мкл;
4 - органическая фаза; 5 - «Аевит» (стандарт)
Таблица 2
Величины КГ компонентов препарата «Ревит» в различных элюирующих системах
Витамин КГ в элюирующих системах
БУВ (4:1:1) БУВ (60:15:25) ВЭ (20:120)
Ретинола пальмитат 0,93 0,93 0,84
Рибофлавин 0,49 = 0,4 = 0,4
Тиамин хлорид 0 0,03 0
Аскорбиновая кислота 0,71 0,54 0,62
Аскорбиновая кислота и рибофлавин имеют близкие значения КГ в системах бутанол - ледяная уксусная кислота - вода, однако лучшего разделения удалось добиться в системе БУВ (4:1:1). Нам представляется целесообразным использовать именно такое соотношение растворителей для анализа препарата «Ревит». КГ компонентов лекарственной формы в этой системе значительно отличаются, что показывает возможность их одновременного определения.
Выводы
Таким образом, в результате наших исследований:
1) разработан способ подготовки драже «Ревит» к анализу;
2) показана возможность качественного обнаружения четырех витаминов в препарате «Ревит»;
3) подобран состав подвижной фазы для разделения четырех витаминов
препарата «Ревит» методом тонкослойной хроматографии;
4) предложен экспресс-метод анализа мультивитаминного комплекса
«Ревит»;
5) витамины С и В2 в растворе не совместимы друг с другом.
Список литературы
1. Аляутдин, Р. Н. Фармакология / Р. Н. Аляутдин. - 3-е изд., испр. - М. : Изд-во ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 592 с.
2. Слепченко, Г. Б. Контроль качества биологически активных добавок методами вольтамперометрии. Определение витаминов В1, В2, С, Е и кверцетина / Г. Б. Слепченко, Л. С. Анисимова, В. Ф. Слипченко [и др.] // Химикофармацевтический журнал. - 2005. - № 4 (39). - С. 54-56.
3. Зрелова, Л. В. Экспрессный анализ микро- и макроэлементов в витаминных лекарственных средствах рентгено-флюоресцентным методом / Л. В. Зрелова, А. П. Арзамасцев, С. Б. Ходжаев, Е. М. Майорова // Фармация. - 2008. - № 6. -С. 32-33.
4. Рыбакова, О. В. Методы контроля качества витаминов группы D (обзор) / О. В. Рыбакова, Е. Ф. Сафонова, А. И. Сливкин // Химико-фармацевтический журнал. - 2008. - № 7 (42). - С. 38-44.
5. Государственная фармакопея СССР. - 10-е изд. - М. : Медицина, 1968.
6. Арзамасцев, А. П. Фармацевтическая химия / А. П. Арзамасцев. - 3-е изд., испр. - М. : Изд-во ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 640 с.
7. Беликов, В. Г. Фармацевтическая химия / В. Г. Беликов. - М. : МЕДпресс-
информ, 2007. - 624 с.
8. Рыбакова, О. В. Определение токоферолов методом хроматографии в тонком
слое сорбента / О. В. Рыбакова, Е. Ф. Сафонова, А. И. Сливкин // Химико-
фармацевтический журнал. - 2008. - № 8(42). - С. 31-34.
9. Китаева, Т. А. Оптимизация условий определения витамина D2 методом хроматографии в тонком слое / Т. А. Китаева, Т. А. Бородина, Е. В. Сафонова, Е. Ф. Селеменев // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. -№ 3 (8). - С. 521-524.
10. British Pharmacopea CD 2007. V. 1, 2. System Simulation Ltd., 2007.
11. United States Pharmacopoea 30-NF25. - 25th еd. - Rockville, 2007.
Беляева Юлия Юрьевна
студентка, Медицинский институт, Пензенский государственный университет
E-mail: uu30589@mail.ru
Моисеева Инесса Яковлевна
доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой общей и клинической фармакологии, Медицинский институт, Пензенский государственный университет
E-mail: moiseeva_pharm@mail.ru
Belyaeva Yuliya Uryaevna Student, Medical Institute, Penza State University
Moiseeva Inessa Yakovlevna Doctor of medical sciences, professor, head of sub-department of general and clinical pharmacology,
Medical Institute, Penza State University
Кузнецова Анна Викторовна
кандидат химических наук, доцент, кафедра общей и клинической фармакологии, Медицинский институт Пензенский государственный университет
E-mail: kuznetanna@hotmail.com
УДК 615.07(07.07)
Беляева, Ю. Ю.
Идентификация и одностадийное определение витаминов препарата «Ревит» методом тонкослойной хроматографии / Ю. Ю. Беляева, И. Я. Моисеева, А. В. Кузнецова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - № 4 (12). - С. 3-11.
Kuznetsova Anna Viktorovna Candidate of chemical sciences, associate professor, sub-department of general and clinical pharmacology,
Medical Institute, Penza State University
