CC BY
57
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ НАУКИ PHARMACEUTICAL SCIENCES
УДК 661.12.011: [615.454.1 : 615.276].074 DOI 10.18413/2075-4728-2018-41-3-473-483
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ КЕТОПРОФЕНА
IDENTIFICATION AND ASSAY OF THE KETOPROFEN ESTERS
Н.А. Ляпунов, И.А. Зинченко, Е.П. Безуглая N.A. Lyapunov, I.A. Zinchenko, E.P. Bezuglaya
Государственное научное учреждение «Научно-технологический комплекс «Институт монокристаллов» Национальной академии наук Украины», Украина, 61072, г. Харьков, проспект Науки, 60
State Scientific Institution «Institute for Single Crystals» of NAS of Ukraine, 60 Nauky Ave., Kharkiv, 61072, Ukraine
E-mail: [email protected]
Аннотация
Приведены результаты исследований, обосновывающие подход к качественному и количественному определению сложных эфиров кетопрофена методом жидкостной хроматографии с использованием диодно-матричного детектора и масс-детектора. Разработана методика их определения и проанализированы растворы кетопрофена и его сложных эфиров в конкретных диапазонах концентраций; определены факторы отклика и коэффициенты пересчёта для определения содержания сложных эфиров по стандартному образцу (СО) кетопрофена. Показано, что с увеличением молекулярной массы сложных эфиров кетопрофена пропорционально уменьшаются их удельные показатели поглощения, а также возрастают коэффициенты пересчёта. При рутинном определении сложных эфиров кетопрофена как посторонних примесей каждую из них можно идентифицировать по УФ-спектру, максимуму поглощения и относительному времени удерживания пика, а количественно определять — по СО кетопрофена с учётом коэффициента пересчёта. При этом показатель чистоты пика примеси характеризует его специфичность. Данный подход актуален при разработке методик одновременного определения нескольких примесей, пики которых могут иметь одинаковые или близкие времена удерживания.
Abstract
The results of studies that justify the approach to the qualitative and quantitative determination of the ketoprofen esters by liquid chromatography with diode array detection and mass spectrometry detection are provided. The analytical procedure for their qualitative and quantitative determination has been developed and solutions of ketoprofen and its esters in specific concentration ranges have been tested; the response factors and correction factors were determined to assay of esters using ketoprofen reference standard (RS). It has been shown that with the increase in the molecular weight of the ketoprofen esters, their specific absorbance values are proportionally reduced as well as the correction factors increased. For the routine determination of ketoprofen esters as related substances (impurities) each of them can be identified by the UV spectrum, the absorption maximum and the relative retention of its peak as well as quantitatively determined using кetoprofen RS taking into account the correction factor. In such case, the
peak purity index characterizes the specificity of this impurity peak. This approach is relevant in the development of procedures for the simultaneous determination of several impurities whose peaks might have the same or similar retention times.
Ключевые слова: кетопрофен, сложный эфир, примесь, хроматограмма, пик, спектр поглощения, максимум поглощения, молекулярная масса (М.м.), чистота пика.
Keywords: ketoprofen, ester, impurity, chromatogram, peak, absorption spectrum, absorption maxima, molecular mass (Mr), peak purity index.
Введение
Номенклатура мягких лекарственных средств (МЛС) с кетопрофеном достаточно обширна [Martindale, 2017]. Кетопрофен перспективен для создания комбинированных препаратов в форме гелей, например таких, как метилсалицилат и ментол [Компендиум, 2016]. МЛС, содержащие хондропротекторы и кетопрофен, необходимы для лечения остеоартритов (ОА), поскольку кетопрофен не оказывает хондротоксического действия [Корж и др., 2007; Herndon, 2012]. При этом необходимо обеспечить трансдермальное проникновение кетопрофена и других лекарственных веществ за счёт усилителей проникновения [Lane, 2013, Muro, 2016]. Как правило, усилители проникновения - это разные гидрофильные растворители, например, этанол, диэтиленгликоля моноэтиловый эфир и др. [Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2012; Alkilani et al., 2015].
Кетопрофен - это (2Ж)-2-(3-бензоилфенил)пропановая кислота [European Pharmacopoeia, 2016]. Поэтому кетопрофен может участвовать в реакции этерификации с гидрофильными растворителями, имеющими в молекулах гидроксильные группы; образование сложных эфиров кетопрофена увеличивается с понижением рН растворов от 7.0 до 3.0 и зависит от природы растворителя и количества гидроксильных групп в его молекуле [Зин-ченко и др., 2017б]. Кетопрофен образует также сложные эфиры с другими веществами, что позволяет усилить или модифицировать его терапевтическое действие [Mekhafi et al., 2015; Ahmet et al., 2016; Theodosis-Nobelos et al., 2017].
Кетопрофен и продукты его этерификации в МЛС следует стандартизовать и определять [Нормативы документи МОЗ Украши, 2016]. Перспективным методом определения кетопрофена и его примесей является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [Зинченко, Ляпунов, 2015; Yadav et al., 2016]. Однако в монографии «Ketoprofen Gel» Британской Фармакопеи нормируется только предельное содержание кетопрофена этилового эфира (КЭЭ) (< 4 %), определяемое методом тонкослойной хроматографии [British Pharmacopoeia, 2016]. Для количественного определения эфиров кетопрофена методом ВЭЖХ требуются соответствующие стандартные образцы (СО), которые могут оказаться недоступными для рутинного анализа серийной продукции.
Цель работы: обосновать подход к идентификации и количественному определению сложных эфиров кетопрофена методом ВЭЖХ с использованием жидкостных хроматографов с диодно-матричным детектором и масс-детектором.
Материалы и методы исследования
Для исследований использовали:
1. СО кетопрофена (ketoprofen BP CRS, кат. № 668; C16H14O3, М.м. 254.28, CAS № [22071-15-4]; содержание основного вещества 99.9 %).
2. СО КЭЭ (ketoprofen ethyl ester LGS RS, кат. № MM0001.19; C18H18O3, М.м. 282.33, CAS № [60658-04-0]; содержание основного вещества 99.6 %).
3. СО кетопрофена пропиленгликолевого эфира (КПГЭ) (смеси изомеров) (ketoprofen propylene glycol ester (mixture of isomers) LGS RS, кат. № MM0001.28; C19H20O4, М.м. 312.36; содержание основного вещества 99.8 %).
4. Диэтиленгликоля моноэтиловый эфир (ДГМЭ) (diethylene glycol monoethyl ether) (Transcutol® P, фирма «Gattefosse», серия № 159588, годен до 06.2019, C6H14O3, М.м. 134.18, CAS № [111-90-0]; содержание основного вещества 99.98 %).
Поскольку СО сложного эфира кетопрофена и ДГМЭ отсутствует, то его получали следующим способом: к 1 г кетопрофена прибавляли 10 г ДГМЭ, 1 мл концентрированной серной кислоты, 90 мл ацетонитрила и перемешивали до растворения кетопрофена; выдерживали раствор в течение 12 ч. Прибавляли 50 мл воды очищенной, помещали смесь в делительную воронку и экстрагировали полученный продукт этилацетатом три раза по 15 мл. Объединённый органический слой промывали один раз 10 мл воды очищенной для удаления остатков серной кислоты, сушили натрия сульфатом безводным; фильтровали от неорганического осадка через фильтр Шотта; фильтрат испаряли в роторном испарителе. Полученную субстанцию эфира кетопрофена и ДГМЭ (ЭКДГМЭ) высушивали до постоянной массы при температуре 90 оС и контролировали методом ВЭЖХ [Зинченко и др., 2017 а; Зинченко и др., 2017 б]. Кроме того, был определён масс-спектр полученного соединения с использованием хроматографа «Agilent 1260» и колонки Inertsil ODS-2 размером 150^4.6 мм (размер частиц 5 мкм) с предколонкой Inertsil ODS-2 размером 10*4.6 мм (размер частиц 5 мкм). Компоненты подвижной фазы: А - раствор кислоты муравьиной c pH=2.7 и В - ацетонитрил для хроматографии (30:70); скорость потока элюента 1 мл/мин; деление потока 1:1; объём инжекции 5 мкл; температура термостата инжектора 8 оС; температура термостата колонки 35 °С. Параметры детектирования: детектор MS/MS «Agilent 6420 Triple Quad»; источник ионизации ESI (электроспрей); температура газа 350 °С; поток газа 8 л/мин; давление 40 psi; напряжение 4000 V; режим сбора данных: сканирование в диапазоне масс 120-600 а.е.м.; время начала сбора данных 0 мин, продолжительность сбора данных 40 мин; MS2 from 120 m/z; MS2 to 600 m/z; scan time 500 msec; fragmentor 120 V; cell accelerator voltage 7 AV; polarity - positive.
Растворы кетопрофена и эфиров кетопрофена готовили массо-объёмным способом. Навески взвешивали на аналитических весах модели AUW-120 D («Shimadzu») и помещали в мерные колбы 1-го класса точности из тёмного стекла («Simax», Чехия), растворяли в части метанола и доводили объем раствора метанолом до метки. Спектры поглощения растворов снимали на спектрофотометре «Shimadzu PharmaSpec UV-1700» с программным обеспечением UVProbe версии 2.21 («Shimadzu»). Растворы хроматографировали на жидкостном хроматографе Shimadzu Prominence-i LC-2030C 3D («Shimadzu», Япония) в следующих условиях: хроматографическая колонка Inertsil ODS-2 размером 250*4.6 мм (размер частиц 5 мкм); подвижная фаза - фосфатный буферный раствор с рН 2.5 и ацетонитрил для хроматографии (50:50); скорость потока - 1.5 мл/мин; температура колонки -40 оС; температура автоинжектора 25 оС; детектор - диодно-матричный в диапазоне от 200 нм до 400 нм, детектирование при длине волны 255 нм; объём вводимой пробы -10 мкл; время хроматографирования - 15 мин. При хроматографировании снимали спектры поглощения пиков и определяли чистоту пиков [Гризодуб, 2016].
Объектом исследований служил также крем-гель, содержащий 2.5 % кетопрофена, 10 % метилсалицилата, 5 % ментола, 5 % Transcutol® P, 10 % пропиленгликоля, эмульгатор 1 рода, карбомер, органический амин и воду до 100 % (состав указан в масс.%).
Результаты и их обсуждение
Для идентификации синтезированного сложного эфира кетопрофена и ДГМЭ были получены хроматограммы на хроматографе с масс-детектором (рис. 3). Как следует из рис. 4, основной ион в масс-спектре пика со временем удерживания (Rt) 4,268 мин имеет значение m/z 371.00, что соответствует молекулярному иону [М+Н]+ примеси кетопрофена С22Н26О5 (М.м. 370.45), ион с соотношением m/z 393.00 является ионным аддуктом данной примеси и натрия [М+№]+, а ион с соотношением m/z 409.00 - ионным аддуктом данной примеси и калия [М+Ka^. Т. е., хроматографический пик с Rt=4.268 мин соответ-
ствует сложному эфиру кетопрофена и ДГМЭ, имеющему эмпирическую формулу С22Н26О5, с М.м. 370.45.
i 5ЙЯ i
-
■
■
t"
-
-
■■
b &
1
- 1 : ■ ■ ■ ■ ■; 16 7 1 is 2 ; : Э 3 : : :: ж
Рис. 1. Хроматограмма раствора сложного эфира кетопрофена и диэтиленгликоля моноэтилового эфира (Rt=4.268 мин), полученная в режиме сканирования масс в диапазоне 120-600 m/z Fig. 1. The сhromatogram of the solution of the ester of ketoprofen with diethylene glycol monoethyl ether (Rt=4.268 min), obtained in a mass scanning mode in the range of 120-600 m/z
409.0000
. 371 0000
iOi лиги
1 53 1С ОС +29 2000
1 205.CCCC . L 242:2000 23 1.0000 32 .20 С i 1 5.0000
: 1: I: : S: : ± ¿: £ : : : -d: L . -1. - : ■ _ '■ _L. _ - 1- J й: i: • : : : -k ; . 1
Рис. 2. Масс-спектр пика с Rt=4.268 мин (см. рис. 1) вещества с М.м.=370 а.е.м. Fig. 2. The mass spectrum of the peak with Rt=4.268 min (see Fig. 1) of the substance with Mr=370 amu
Кетопрофен и его эфиры в растворах метанола имеют идентичные УФ-спектры поглощения с Xmax=255 нм (рис. 3), поскольку содержат в молекулах одинаковый хромофор.
i 55 : ........
--------
3
200,00 2&0.00 3CKJ.OO
Рис. 3. УФ-спектры поглощения растворов кетопрофена (1), КЭЭ (2), КПГЭ (3) и эфира кетопрофена и ДГМЭ. Для всех спектров ^max=255 нм Fig. 3. UV spectra of ketoprofen (1), ketoprofen ethyl ester (2), ketoprofen propylene glycol ester (3) and ester of ketoprofen with DGME. For all spectra ^max=255 nm
Разработана методика количественного определения методом ВЭЖХ кетопрофена и его эфиров в диапазоне концентраций от 25 % до 125 % по отношению к предельному содержанию КЭЭ в МЛС 4% [Зинченко и др., 2017а]. Валидацию методики осуществляли по общепринятой методологии [Державна Фармакопея Украши, 2015; Гризодуб, 2016].
На рис. 4 представлена репрезентативная хроматограмма раствора, содержащего кетопрофен и его эфиры (концентрация веществ составляет~4.0 % от содержания кетопрофена в испытуемом растворе для его количественного определения), а в табл. 1-3 - результаты исследований по определению факторов отклика и коэффициентов пересчёта при количественном определении эфиров кетопрофена по СО кетопрофена.
Рис. 4. Хроматограмма модельного раствора, где пик с Rt=4.202 мин соответствует кетопрофену, пики с Rt=5.124 мин и 5.377 мин - кетопрофена ПГ эфирам, пик с Rt=10.075 мин - эфиру кетопрофена и ДГМЭ, пик с Rt=12.095 мин - КЭЭ. Fig. 4. The chromatogram of the model solution, where the peak with Rt=4.202 min corresponds to keto-profen, the peaks with Rt=5.124 min and 5.377 min - ketoprofen PG esters, the peak with Rt=10.075 min - ester of ketoprofen with DGME, peak with Rt=12.095 min - ketoprofen ethyl ester. The concentration of substances is~4.0 % with respect to the content of ketoprofen in the test solution for its assay
Таблица 1 Table 1
Результаты анализа растворов, содержащих от 1.0 % до 5.0 % кетопрофена (КН) и КЭЭ от номинального содержания кетопрофена в испытуемом растворе The results of the analyses of solutions containing ketoprofen and ketoprofen ethyl ester from 1.0 % to 5.0 % with respect to the nominal content of ketoprofen in the test solution
С КН, мкг/мл Введено КН, мкг S пика КН Фактор отклика, мВ^с/мкг С КЭЭ, мкг/мл Введено КЭЭ, мкг S пика КЭЭ Фактор отклика, мВ^с/мкг К
1.2420 0.01242 34283 2760306 1.0350 0.01035 24641 2380773 1.159
1.7388 0.01739 50286 2891994 1.4490 0.01449 35833 2472947 1.169
2.4840 0.02484 68926 2774799 2.0700 0.02070 50221 2426135 1.144
3.2292 0.03229 91183 2823702 2.6910 0.02691 66080 2455593 1.150
3.7260 0.03726 104929 2816130 3.1050 0.03105 75627 2435652 1.156
4.4712 0.04471 119385 2670089 3.7260 0.03726 85959 2307005 1.157
4.9680 0.04968 136392 2745411 4.1400 0.04140 97934 2365556 1.161
5.7132 0.05713 154080 2696912 4.7610 0.04761 109778 2305776 1.170
6.2100 0.06210 174496 2809919 5.1750 0.05175 124028 2396676 1.172
Среднее 2776585 2394013 1.160
RSD 2.4541 2,5209 0.8210
А, % 4.5633 4.6875 1.5266
Таблица 2 Table 2
Результаты анализа растворов, содержащих от 1.0 % до 5.0 % кетопрофена (КН) и КПГЭ от номинального содержания кетопрофена в испытуемом растворе The results of the analyses of solutions containing ketoprofen and ketoprofen propylene glycol ester from 1.0 % to 5.0 % with respect to the nominal content of ketoprofen in the test solution
С КН, мкг/мл Введено КН, мкг S пика КН Фактор отклика, мВ^с/мкг С КПГЭ, мкг/мл Введено КПГЭ, мкг S пика КПГЭ Фактор отклика, мВ^с/мкг К
1.2420 0.01242 34283 2760306 1.2114 0.01211 27349 2257636 1.223
1.7388 0.01739 50286 2891994 1.6960 0.01696 38906 2294040 1.261
2.4840 0.02484 68926 2774799 2.4228 0.02423 54681 2256934 1.229
3.2292 0.03229 91183 2823702 3.1496 0.03150 71672 2275562 1.241
3.7260 0.03726 104929 2816130 3.6342 0.03634 82058 2257938 1.247
4.4712 0.04471 119385 2670089 4.3610 0.04361 93117 2135202 1.251
4.9680 0.04968 136392 2745411 4.8456 0.04846 106310 2193949 1.251
5.7132 0.05713 154080 2696912 5.5724 0.05572 119594 2146169 1.257
6.2100 0.06210 174496 2809919 6.0570 0.06057 134730 2224368 1.263
Среднее 2776585 2226867 1.247
RSD 2.4541 2.5454 1.1026
А, % 4.5633 4.7332 2.0502
Таблица 3 Table 3
Результаты анализа растворов, содержащих от 1.0 % до 5.0 % кетопрофена (КН) и ЭКДГМЭ от
номинального содержания кетопрофена в испытуемом растворе The results of the analyses of solutions containing ketoprofen and ester of ketoprofen with DGME from 1.0 % to 5.0 % with respect to the nominal content of ketoprofen in the test solution
С КН, мкг/мл Введено КН, мкг S пика КН Фактор отклика, мВ^с/мкг С ЭКДГМЭ, мкг/мл Введено ЭКДГМЭ, мкг S пика ЭКДГМЭ Фактор отклика, мВ^с/мкг К
1.2420 0.01242 34283 2760306 1.28550 0.01286 22228 1729133 1.596
1.7388 0.01739 50286 2891994 1.79970 0.01800 32846 1825082 1.585
2.4840 0.02484 68926 2774799 2.57100 0.02571 45990 1788798 1.551
3.2292 0.03229 91183 2823702 3.34230 0.03342 60304 1804267 1.565
3.7260 0.03726 104929 2816130 3.85650 0.03857 70659 1832205 1.537
4.4712 0.04471 119385 2670089 4.62780 0.04628 79649 1721099 1,551
4.9680 0.04968 136392 2745411 5.14200 0.05142 90611 1762174 1.558
5.7132 0.05713 154080 2696912 5.91330 0.05913 102308 1730134 1.559
6.2100 0.06210 174496 2809919 6.42750 0.06428 116122 1806643 1.555
Среднее 2776585 1777726 1.562
RSD 2.4541 2.4316 1.1594
А, % 4.5633 4.5215 2.1559
Примечания к табл. 1, 2 и 3: С - концентрация; S - площадь; К - коэффициент пересчёта.
Эфиры кетопрофена идентифицируют при хроматографировании на хроматографе с диодно-матричным детектором по характерным для кетопрофена спектрам поглощения с Xmax=255 нм и относительным временем удерживания (RRt) пиков относительно Rt пика кетопрофена. Так, на хроматограмме на рис. 4 для кетопрофена ПГ эфиров RRt составляют 1.219 и 1.280, для эфира кетопрофена и ДГМЭ - 2.398, а для КЭЭ - 2.878.
Определение эфиров кетопрофена можно проводить по СО кетопрофена с учётом коэффициентов пересчёта. Вещество с гидроксильной группой, образующее эфир с кето-профеном, не является хромофором, и соотношение между молекулярными массами кетопрофена и эфира коррелирует с соотношением между удельными показателями их поглощения и коэффициентами пересчёта, полученными по результатам анализа (табл. 4).
Таблица 4 Table 4
Молекулярные массы кетопрофена и его эфиров, удельные показатели поглощения их растворов и коэффициенты пересчёта (см. табл. 1-3), а также соотношения между численными значениями
этих характеристик кетопрофена и каждого из его эфиров Molecular masses of ketoprofen and its esters, specific absorbance of their solutions and correction factors (see Tables 1-3), as well as the ratio between the values of these characteristics
of ketoprofen and each of its esters
№ пп Вещество М.м., а.е.м. М.м. эфира : М.м. К A1% А1см A1% К : А1см К : A1% эфира К (табл. 1-3)
1 Кетопрофен (К) 254.29 661.11
2 КЭЭ 282.33 1.110 595.70 1.110 1.160
3 КПГЭ 312.36 1.228 536.94 1.231 1.247
4 ЭКДГМЭ 370.45 1.457 457.47 1.445 1.562
Идентификация пиков примесей является важной при анализе комбинированных препаратов, где примеси с одинаковыми или очень близкими временами удерживания являются продуктами разложения или модификации разных лекарственных веществ. Например, при аналитическом сопровождении фармацевтической разработки крем-геля, содержащего 2.5 % кетопрофена, 10 % метилсалицилата, 5 % ментола, 5 % Transcutol® P и 10 % пропиленгликоля, для анализа методом ВЭЖХ был использован раствор сравнения, содержащий СО кетопрофена (Rt=3.430 мин), СО кетопрофена ПГ эфиров (1 - Rt=13,100 мин и RRt=3.819; 2 - Rt=13.376 мин и RRt=3.900) и эфир кетопрофена с Transcutol® P (Rt=16.037 мин, RRt=4.676), для идентификации пиков по временам удерживания, поскольку предполагалось образование эфиров кетопрофена с ПГ и Transcutol® P. У пиков кетопрофена и его эфиров были идентичные УФ-спектры с Xmax=255 нм (рис. 5). Хрома-тограмма испытуемого раствора после хранения препарата при температуре 25 оС представлена на рис. 6, а некоторые спектры поглощения пиков - на рис. 7.
Как следует из хроматограммы на рис. 6, в процессе хранения препарата образовались 2 примеси с Rt= 3.195 мин и Rt=13.389 мин, которые при идентификации только по Rt и/или RRt можно было бы ошибочно принять за кетопрофена ПГ эфиры (Rt=13.100 мин и Rt=13.376 мин) (см. рис. 5). Благодаря использованию диодно-матричного детектора, было показано, что указанные 2 пика на хроматограмме испытуемого раствора имели УФ-спектры с Xmax=305 нм, характерные для метилсалицилата, а не кетопрофена (см. рис. 7). При этом низкие значения чистоты этих пиков свидетельствовали об их наложении на пики других веществ, которыми, видимо, были кетопрофена ПГ эфиры в незначительных концентрациях (см. рис. 6). По результатам исследований использованная хроматографи-ческая система была признана непригодной для анализа продуктов разложения лекарственных веществ в препарате, в связи с чем методика анализа была модифицирована.
2J Ulf Н Ul-
li (HHKJ-
HHJIINC]-
iOtmtJ-
s u'. U*.
(- ГЧ
£ С
(-
1- V.
: - J : i 1 4 1 a ■ J 1 L 1 I 1 1 1 1 I 1 1 I В I | | i 1 | l \
10
2(]
4»
id
Рис. 5. Хроматограммараствора сравнения, где пики соответствуют: кетопрофену (Rt=3.430 мин, чистота пика 0.99998, ^max=255 нм); кетопрофена ПГ эфиру (Rt=13.100 мин, чистота пика 0.99995, ^max=255 нм); кетопрофена ПГ эфиру (Rt=13.376 мин, чистота пика 0.99988, ^max=255 нм); кетопрофена ДГМЭ эфиру (Rt=16.037 мин, чистота пика 0.99955, ^max=255 нм) Fig. 5. Chromatogram of the reference solution, where the peaks correspond: ketoprofen (Rt=3.430 min, peak purity index 0.99998, Amax=255 nm); ketoprofen PG ether (Rt=13.100 min, peak purity index 0.99995, Amax=255 nm); ketoprofen PG ether (Rt=13.376 min, peak purity index 0.99988, Amax=255 nm); ester of ketoprofen with DGME (Rt=16.037 min, peak purity index 0.99955, Amax=255 nm)
Рис. 6. Хроматограмма испытуемого раствора крем-геля, где пики соответствуют: кетопрофену (Rt=3.436 мин, чистота пика 0.99991, ^max=255 нм); метилсалицилату (Rt=12.421 мин, чистота пика 0.99996, ^max=305 нм); примеси метилсалицилата (Rt=13.195 мин, чистота пика 0.38514, ^max=305 нм); примеси метилсалицилата (Rt=13.389 мин, чистота пика 0.42154, ^max=305 нм); кетопрофена ДГМЭ эфиру (Rt=16.057 мин, чистота пика 0.99902, ^max=255 нм); кетопрофена ментоловому эфиру (Rt=40.412 мин, чистота пика 0.99911, ^max=255 нм); кетопрофена ментоловому эфиру (Rt=41.418 мин, чистота пика 0.99983, Uax=255 нм) Fig. 6. The chromatogram of the test solution of cream-gel, where the peaks correspond: ketoprofen (Rt=3.436 min, peak purity index 0.99991, ^max=255 nm); methyl salicylate (Rt=12.421 min, peak purity index 0.99996, Amax=305 nm); impurities of methyl salicylate (Rt=13.195 min, peak purity index 0.3854, Amax=305 nm); impurities of methyl salicylate (Rt=13.389 min, peak purity index 0.42154, Amax=305 nm); ester of ketoprofen with DGME (Rt=16.057 min, peak purity index 0.99902, ^max=255 nm); ketoprofen menthol ester (Rt=40.412 min, peak purity index 0.99911, Amax=255 nm); ketoprofen menthol ester (Rt=41.418 min, peak purity index 0.99983, ^max=255 nm)
А
В
С
Рис. 7. УФ-спектры пиков кетопрофена ПГ эфира (рис. 5, Rt=13.100 мин.) (А), метилсалицилата (рис. 6, Rt=12.421 мин.) (В) и примеси метилсалицилата (рис. 6, Rt=13.195 мин.) (С), полученные
при хроматографировании испытуемого раствора крем-геля Fig. 7. UV spectra of peaks of ketoprofen PG ester (Figure 5, Rt=13.100 min.), methyl salicylate (Figure 6, Rt=12.421 min.) and methyl salicylate impurities (Figure 6, Rt=13.195 min.), obtained during chromatography of the test solution of cream-gel
Как следует из хроматограммы на рис. 6, в процессе хранения препарата образовались непредусмотренные примеси, пики которых имели времена удерживания 40.412 мин и 41.418 мин. Учитывая УФ-спектры пиков этих примесей с Xmax=255 нм, они были отнесены к продуктам модификации кетопрофена. Масс-спектры, полученные для обоих пиков, оказались идентичны (рис. 8).
120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
Рис. 8. Масс-спектр пика с Rt=40.412 мин (см. рис. 6) вещества с М.м.=392.54 Fig. 8. The mass spectrum of the peak with Rt=40.412 min (see Fig. 6) of the substance with Mr=392.54
Основной ион в масс-спектре каждого из этих пиков имеет значение m/z 391.20 что соответствует молекулярному иону [М+Н]+ примеси кетопрофена С26Н32О3 (М.м. 392.54), ион с соотношением m/z 410.20 является ионным аддуктом данной примеси и натрия [M+Na]+, а ион с соотношением m/z 431.00 является ионным аддуктом данной примеси и калия [М+Ка]+. Таким образом, хроматографические пики соответствуют двум изомерам кетопрофена ментолового эфира с эмпирической формулой С26Н32О3 и М.м. 392.54.
Чтобы существенно уменьшить образование в препарате кетопрофена ментолового эфира потребовалось изменить производственный процесс под аналитическим контролем с применением модифицированной хроматографической методики определения посторонних примесей. Поскольку СО кетопрофена ментоловых эфиров отсутствует, для количественного определения этих примесей был использован СО кетопрофена с учётом коэффициента пересчёта 1.544, представляющего собой соотношение молекулярных масс кетопрофена ментолового эфира и кетопрофена.
Выводы
1. Научно обоснован подход к качественному и количественному определению сложных эфиров кетопрофена методом жидкостной хроматографии с использованием ди-одно-матричного детектора и масс-детектора. Показано, что данный подход актуален при разработке методик одновременного определения нескольких примесей, пики которых могут иметь одинаковые или близкие времена удерживания.
2. Методом ВЭЖХ определено количественное содержание кетопрофена, кетопрофена этилового эфира, кетопрофена пропиленгликолевых эфиров и эфира кетопрофена с диэтиленгликоля моноэтиловым эфиром в определённых диапазонах их концентраций в растворах. По результатам исследований рассчитаны факторы отклика и коэффициенты пересчёта для количественного определения эфиров кетопрофена по СО кетопрофена. Показано, что с увеличением молекулярной массы сложных эфиров кетопрофена пропорционально возрастают коэффициенты пересчёта, а также уменьшаются их удельные показатели поглощения.
3. При рутинном определении сложных эфиров кетопрофена как посторонних примесей каждую из них можно идентифицировать по относительному времени удерживания пика, УФ-спектру пика и максимуму поглощения пика, а количественно определять - по СО кетопрофена с учётом коэффициента пересчёта. При этом показатель чистоты пика примеси характеризует его специфичность.
Список литературы References
1. Гризодуб А.И. 2016. Стандартизованные процедуры валидации методик контроля качества лекарственных средств. Харьков, Государственное предприятие «Украинский научный фармакопейный центр качества лекарственных средств», 396.
Grizodub A.I. 2016. Standartizovannye protsedury validatsii metodik kontrolya kachestva le-karstvennykh sredstv. [Standardized approaches to validation of procedures for quality control of medicinal products]. Khar'kov, Gosudarstvennoe predpriyatie «Ukrainskiy nauchnyy farmakopeynyy tsentr kachestva lekarstvennykh sredstv», 396. (in Russian)
2. Зинченко И.А., Ляпунов Н.А. 2015. Аналитические методики определения декскето-профена и сопутствующих примесей в геле: валидация и применение на этапе разработки препарата. Фармаком, 3/4, 12-20.
Zinchenko I.A., Lyapunov N.A. 2015. Analiticheskie metodiki opredeleniya deksketoprofena i soputstvuyushchikh primesey v gele: validatsiya i primenenie na etape razrabotki preparata. [Analytical procedures for determination of dexketoprofen and related substances in the gel: validation and application during drug development]. Farmakom, 3/4, 12-20. (in Russian)
3. Зинченко И.А., Ляпунов Н.А., Безуглая Е.П. 2017. Валидация аналитической методики количественного определения примесей кетопрофена методом жидкостной хроматографии. Фармаком, 3: 25-32.
Zinchenko I.A., Lyapunov N.A., Bezuglaya E.P. 2017. Validatsiya analiticheskoy metodiki kolichestvennogo opredeleniya primesey ketoprofena metodom zhidkostnoy khromatografii. [Validation of the analytical procedure for the quantitative determination of ketoprofen impurities by liquid chroma-tography]. Farmakom, 3: 25-32. (in Russian)
4. Зинченко И.А., Ляпунов Н.А., Безуглая Е.П. 2017. Исследование образования примесей кетопрофена в модельных растворах. Фармаком, 4: 16-22.
Zinchenko I.A., Lyapunov N.A., Bezuglaya E.P. 2017. Issledovanie obrazovaniya primesey keto-profena v model'nykh rastvorakh. [Study of the formation of ketoprofen impurities in model solutions]. Farmakom, 4: 16-22. (in Russian)
5. Компендиум 2016 - лекарственные препараты. Под ред. В.Н. Коваленко. 2016. Киев, Морион, 2416.
Kompendium 2016 - lekarstvennye preparaty. [Compendium 2016 - medicinal products]. Pod red. V.N. Kovalenko. 2016. Kiev, Morion, 2416. (in Russian)
6. Корж Н.А., Хвисюк Н.В., Дедух Н.В. 2007. Остеоартроз: консервативная терапия: Монография. Под ред. Н.А. Коржа, Н.В. Дедух, И.А. Зупанца. Харьков, Золотые страницы, 424.
Korzh N.A., Khvisyuk N.V., Dedukh N.V. 2007. Osteoartroz: konservativnaya terapiya. [Osteoarthritis: conservative therapy]: Monografiya. Pod red. N.A. Korzha, N.V. Dedukh, I.A. Zupantsa. Khar'kov, Zolotye stranitsy, 424. (in Russian)
7. Державна Фармакопея Укра!ни: Т. 1. 2-е вид. 2015. Харюв: Державне шдприемство «Украшський науковий центр якост лшарських засобiв», 1128.
Derzhavna Farmakopeja Ukrai'ny [State pharmacopoeia of Ukraine]: T. 1. 2-e vyd. 2015. Harkiv: Derzhavne pidpryjemstvo «Ukrai'ns'kyj naukovyj centr jakosti likars'kyh zasobiv», 1128. (in Ukrainian)
8. Нормативы документи МОЗ Украши. Стандартизащя фармацевтично! продукци: Том 1. 2016. Ки!в: МОЗ Укра!ни, Морiон, 982.
Normatyvni dokumenty MOZ Ukrai'ny. Standartyzacija farmacevtychnoi' produkcii'. [Regulatory documents of the Ministry of Health of Ukraine. Standardization of pharmaceutical products]: Tom 1. 2016. Kyi'v: MOZ Ukrai'ny, Morion, 982. (in Ukrainian)
9. Ahmed M., Azam F., Gbai A. 2016. Ester prodrugs of ketoprofen: synthesis, in vitro stability, in vivo biological evaluation and in silico comparative docking studies against COX-1 and COX-2. Current Drug Discovery Technologies, V. 13, 1, March, 41-57.
10. Alkilani A.Z., McCrudden M.T.C., Donelly R.F. 2015. Transdermal Drug Delivery: Innovative Pharmaceutical Developments Based on Disruption of the Barrier Properties of the Stratum Corneum. Pharmaceutics, 7: 438-470.
11. British Pharmacopoeia. V. III. 2016. London: British Pharmacopoeia Comission, TSO.
12. Muro S. 2016. Drug Delivery Across Physiological Barriers. Pan Stanford Reference, 426 p.
13. European Pharmacopoeia. 9th ed. 2016. Strasbourg: EDQM, Council of Europe, 4016.
14. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 7th Edition. Ed. Rowe R.C., Sheskey P.J., Cook W.G., Fenton M.E. 2012. London : Pharmaceutical Press, 1064.
15. Herndon C.M. 2012. Topical delivery of nonsteroidal anti-inflammatory drugs for osteoarthritis. J. Pain Palliat. Care Pharmacother, 26 (1): 18-23.
16. Lane M.E. 2013. Skin penetration enhancers. Int. J. Pharm., № 447: 12-21.
17. Martindale: The Complete Drug Reference. 39th Edition. Ed. Alison Brayfield. 2017. London: Pharmaceutical Press, 4774.
18. Mekhafi S., Alkadi H., Kotb E.S.M. 2015. Sinthesis and anti-inflammatory activity of novel ketoprofen and ibuprofen derivatives. J. Chem. And Pharm. Research., 7(2), 503-510.
19. Theodosis-Nobelos P., Tziona P., Poptsis A. 2017. Novel polyfunctional esters of ibuprofen and ketoprofen with hypolipidemic, lipoxygenase inhibitory and enhanced anti-inflammatory activity, Med. Chem. Res., 26: 461.
20. Yadav N.K., Raghuvanshi A., Sharma G. 2016. QbD - based development and validation of a stability - indicating HPLC method for estimating ketoprofen in bulk drug and pronisomal vesicular system. J. of Chromatographie Science, V. 54, № 3: 377-389.
