CC BY
1
РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ, ЛЕЧЕБНЫХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВОВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯ / DEVELOPMENT OF MEDICINAL PRODUCTS FOR DIAGNOSIS, TREATMENT, AND PREVENTION OF VIRAL INFECTIONS
УДК 578.223:577.215:606 https://doi.org/10.50895/2221-996X-2024-559
Оригинальная статья | Originalarticle
Щ Check for updates
(cc)
BY 4.0
Идентификация и генотипирование вируса Чикунгунья с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
H.A. Нетесова1, М.А. Абдурашитов2, Т.Г. Самарцева3, О.В. Климович4, A.C. Оксанич3, Е.В. Отрашевская3, Г.М. Игнатьев3,5
1 Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, АБК, к. 12а, Кольцово, Новосибирская область, 630559, Российская Федерация
2 Общество с ограниченной ответственностью «СибЭнзайм», ул. Академика Тимакова, д. 2/12,
г. Новосибирск, 630117, Российская Федерация
3 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова», Малый Казенный пер., д. 5а, Москва, 105064, Российская Федерация
4 Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии», ул. Филимонова, д. 2, г. Минск, 220114, Республика Беларусь
5 Федеральное государственное унитарное предприятие «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» Федерального медико-биологического агентства, ул. Свободы,
д. 52, г. Красное Село, Санкт-Петербург, 198320, Российская Федерация
El Игнатьев Георгий Михайлович; marburgman@imait.ru
РЕЗЮМЕ ВВЕДЕНИЕ. Генотипирование вируса Чикунгунья (ЧИКВ) проводится с помощью секвени-
рования участков генов белков El, Е2, nsPl или всего генома вируса. Имеющиеся наборы реагентов или протокол проведения ПЦР не позволяют генотипировать ЧИКВ, а для се-квенирования нуклеиновых кислот требуются дорогостоящее оборудование и материалы, что не всегда доступно. В связи с этим перспективным представляется применение более простого и экономичного метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), который не использовался ранеедля определения генотипов ЧИКВ. ЦЕЛЬ. Изучение возможности применения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для идентификации и генотипирования вируса Чикунгунья.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В экспериментальном исследовании использовали РНК штаммов ЧИКВ четырех генотипов: Азиатский (Asian), Западно-Африканский (WAf), Восточно-Центральный Южно-Африканский (ECSA) и Восточно-Центральный Южно-Африканский -линия Индийского океана (ECSA-IOL). Проводили полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующей рестрикцией и анализом длин рестрикционных фрагментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ. Установлено, что фрагмент гена nsP2 длиной 648 п.н. между позициями 3806 и 4453 содержит сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции PspEI, Pvull и Dral, наличие или отсутствие которых составляют различные комбинации и специфичны для каждого
© H.A. Нетесова, М.А. Абдурашитов, Т.Г. Самарцева, О.В. Климович, A.C. Оксанич, Е.В. Отрашевская, Г.М. Игнатьев, 2024
из четырех генотипов ЧИВК. Сконструированы праймеры, позволяющие амплифициро-вать выбранный участок гена, проведены ОТ-ПЦР и анализ ПДРФ.
ВЫВОДЫ. Для быстрого подтверждения подлинности вируса Чикунгунья и его генотипи-рования может быть успешно использован метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, который позволяет провести анализ в течение нескольких часов и в отсутствие высокотехнологичного оборудования.
Ключевые слова: вирус Чикунгунья; полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов; генотипирование
Для цитирования: Нетесова H.A., Абдурашитов М.А., Самарцева Т.Г., Климович О.В., Оксанич A.C., Отрашев-ская Е.В., Игнатьев Г.М. Идентификация и генотипирование вируса Чикунгунья с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2024:24(5):270-278. https://doi.org/10.50895/2221-996X-2024-559
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 22-14-00184.
Потенциальный конфликт интересов. Г.М. Игнатьев - заместитель главного редактора журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» (с 2024 г.). Остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Identification and genotyping of Chikungunya virus using reverse transcription polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism methods
Nina A. Netesova1, Murat A. Abdurashitov2, Tatiana G. Samartseva3, Olga V. Klimovich4, Alexey S. Oksanich3, Elena V. Otrashevskaia3, George M. ignatyev3-5 H
1 State Research Centerfor Virology and Biotechnology "Vector", 12/A ABK, Koltsovo, Novosibirsk Region 630559, Russian Federation
2 SibEnzyme Ltd, 2/12 Academician TimakovSt., Novosibirsk 630117, Russian Federation
31. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, 5A Maly Kazenny Ln., Moscow 105064, Russian Federation
4 Republican Research and Practical Centerfor Epidemiology and Microbiology, 23 Filimonov St., Minsk 220114, Republic ofBelarus
5 Saint Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Serums and the Enterprisefor the Production of Bacterial Preparations, 52 Svobody St., Krasnoe Selo, Saint Petersburg 198320, Russian Federation
ИЗ George M. Ignatyev; marburgman@mail.ru
ABSTRACT INTRODUCTION. Chikungunya virus (CHIKV) genotyping involves sequencing fractions of genes encoding El, E2, and nsPl proteins or the entire genome of the virus. Available reagent kits or polymerase chain reaction protocols cannot be used for CHIKV genotyping, and nucleic acid sequencing requires expensive equipment and materials, which are not always available. Therefore, it seems promising to use a simpler and more cost-effective restriction fragment length polymorphism (RFLP) method, which has not previously been used for CHIKV genotyping.
AIM. This study aimed to investigate the possibility of using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and RFLP for CHIKV identification and genotyping.
MATERIALS AND METHODS. The experimental study used RNA from CHIKV strains of four genotypes, including the Asian, West African (WAf), and East/Central/South African (ECSA) genotypes, and the Indian Ocean Lineage of the ECSA genotype (ECSA-IOL). The study used RT-PCR followed by DNA restriction and restriction fragment length analysis. RESULTS. The nsP2 gene fragment of 648 bp in length (positions 3806 to 4453) contains recognition sites for the restriction endonucleases PspEI, Pvull, and Dral. The presence or absence of these sites generates a different combination specific to each of the four CHIKV genotypes. The authors designed primers for amplification of the selected gene region and performed RT-PCRandRFLP.
CONCLUSIONS. The RFLP method can be used for rapid CHIKV identification and genotyping. The method provides results within a few hours and does not require high-tech equipment.
Keywords: Chikungunya virus; reverse transcription polymerase chain reaction; restriction fragment
length polymorphism; genotyping
Forcitation: Netesova N.A., Abdurashitov M.A., Samartseva T.G., Klimovich O.V., Oksanich A.S., Otrashev-
skaia E.V., Ignatyev G.M. Identification and genotyping of Chikungunya virus using reverse transcription polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism methods. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2024;24(3):270-278. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-559
Funding. The study was carried out with the financial support of the Russian Science Foundation under grant No. 22-14-00184.
Disclosure. G.M. Ignatyev has been a Deputy Editor-in-Chief of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment since 2024. The other authors
declare no conflict of interest.
ВВЕДЕНИЕ
Вирус Чикунгунья (ЧИКВ), переносчиком которого являются комары рода Aedes, распространенные в странах с тропическим и субтропическим климатом, вызывает одноименное заболевание - лихорадку Чикунгунья, характеризующуюся острой лихорадочной реакцией, сыпью, миалгией и артралгией с риском возможной хронизации [1, 2].
ЧИКВ относят к роду Alphavirus, семейству Togaviridae. Выделяют четыре генотипа вируса: Азиатский (Asian), Западно-Африканский (West African, WAf), Восточно-Центральный Южно-Африканский (East-Central-South African, ECSA) и Восточно-Центральный Южно-Африканский - линия Индийского океана (East-Central-South African - Indian Ocean Lineage, ECSA-IOL). Однако указанные генотипы не имеют четкой территориальной локализации, то есть на одной территории могут одновременно выявляться разные генотипы ЧИКВ [2-6]. Для детекции вируса в комарах или при лабораторном подтверждении клинического диагноза используют протокол, предложенный Центром по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention, CDC), с использованием праймеров к различным участкам генов структурных белков El, Е2 и неструктурного белка nsPl (non-structural protein 1) или коммерческих наборов реагентов для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени [2-10].
Генотипирование ЧИКВ проводится с помощью секвенирования участков генов, кодирующих белки Е1, Е2, реже пзР1, или секвенирования всего генома вируса [1-3, 6, 8, 9,11,12].
При эпидемиологическом исследовании важно определение генотипа штамма вируса для выявления места источника инфицирования. Имеющиеся наборы реагентов или протокол проведения ПЦР не позволяют генотипиро-вать вирус, а для секвенирования нуклеиновых кислот требуются дорогостоящее оборудование и материалы, что не всегда доступно.
Ранее для парамиксовирусов (вирусы эпидемического паротита и кори) и вируса краснухи было показано применение метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) для генотипирования, вплоть до быстрого определения конкретного штамма вируса [13-15].
В связи с этим вероятно предположить, что ме-тод ПДРФ может быть применен и для генотипирования вируса ЧИКВ, что проводится впервые.
Цель работы - изучение возможности применения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для идентификации и генотипирования вируса Чикунгунья.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для проведения исследования использовали РНК вирусов, относящихся к роду Л/рйамУ^ (ЧИКВ - по 3 штамма каждого из четырех
генотипов, которые были предварительно определены секвенированием: Asian, ECSA, ECSA-IOL, WAf; вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей - 2 штамма; вирус Синдбис - 2 штамма) и семейству Flaviviridae (вирусы желтой лихорадки штамм 17D, денге 1-4 типов, японского энцефалита, Западного Нила, клещевого энцефалита - каждого по одному штамму).
Все работы проводили с соблюдением действующих санитарных норм. Штаммы, которые были использованы для получения РНК, находятся в коллекциях филиала ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России в Республике Никарагуа, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» и ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь.
Выделение РНК из образцов проводили с использованием комплекта реагентов «АмплиСенс® Магно-Сорб» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя. Экстракцию РНК выполняли в 50 мкл элюирующего раствора и хранили образцы при минус 70 °С до дальнейшего использования.
Получение кДНК из препаратов РНК. Реакционная смесь при проведении ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в объеме 60 мкл имела следующий состав: 10-кратный SE буфер M-MuLV - 6 мкл, смесь дНТФ (40 мМ) -0,6 мкл, M-MuLV ревертаза (50 ед/мкл) - 1,4 мкл, специфический обратный праймер (24 пкмоль) -8 мкл, РНК образца - 16 мкл, Н20 - 28 мкл (все использованные реактивы производства ООО «СибЭнзайм», Россия). Реакцию осуществляли в течение 30 мин при 42 °С.
ПЦР-амплификация фрагментов ДНК длиной 648 п.н. проводилась в объеме 125 мкл. Данный объем реакционной смеси состоял из 25 мкл кДНК, специфических праймеров - по 5 мкл каждого (3 пкмоль/мкл), 12,5 мкл SE-буфера Tag ДНК полимеразы, 25 мкл Tag ДНК полимеразы (активность 5000 е.а./мл), смесь дНТФ (40мМ) -1,5 мкл, Н20 - 51 мкл (все использованные реактивы производства ООО «СибЭнзайм», Россия). Термоциклирование проводили в амплифика-торе ДТпрайм 5М1 («ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: предварительный
1 https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/
2 https://www.oligo.net/
5 https://www.ncbi.nlm.nih.gov
прогрев при 95 °С - 90 с, далее 35 циклов амплификации (95 °С - 20 с, 55 °С - 40 с, 72 °С - 40 с), при 72 °С - 10 мин, хранение - 10 °С. При ре-стрикционном анализе гидролиз осуществляли эндонуклеазами рестрикции Dral, Pvull и PspEI (ООО «СибЭнзайм», Россия). К 25 мкл смеси ПЦР после амплификации добавляли 5 мкл буфера для рестрикции ROSE (ООО «СибЭнзайм», Россия) и 20 мкл Н20, затем делили на две алик-воты по 25 мкл и к одной из них добавляли 1 мкл эндонуклеазы рестрикции. Вторую алик-воту использовали в качестве отрицательного контроля рестрикции. После инкубации в течение 1 ч при 37 °С продукты гидролиза разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия и визуализировали на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете.
При проведении ПЦР в качестве положительного контроля использовали рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую последовательность гена nsP2 ЧИКВ (кат. № D-1652 АО БТК «Биосервис», Россия).
Компьютерные программы. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей ЧИКВ осуществляли с использованием программы MAFFT version 71. Конструирование олигонуклеотидных праймеров проводили с помощью программы OLIGO 4.02.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор фрагмента вируса Чикунгунья, пригодного для определения генотипа методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
Для ЧИКВ выбор фрагментов для дальнейшего использования метода ПДРФ осуществляли следующим образом:
- проводили множественное выравнивание 731 последовательности геномов ЧИКВ, для которых указан генотип в базе данных GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information)3;
- анализировали участки РНК, наиболее консервативные для каждого из четырех генотипов ЧИКВ;
- выбирали фрагмент, оптимальный для определения генотипа по наличию/отсутствию сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции;
- подбирали специфичные последовательности прямого и обратного праймеров для амплификации выбранного участка в геномах ЧИКВ.
Таблица 1. Структура олигонуклеотидов для выявления РНК вируса Чикунгунья с помощью ПЦР с обратной транскрипцией Table 1. Structure of oligonucleotides for Chikungunya virus detection using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
Наименование Definition Обозначение Designation Последовательность (5-3') Sequence (5'-3') Координаты в геноме (относительно ре-ференсного генома NC_004162, GenBank) Genomic coordinates (relative to the reference genome NC_004162, GenBank) Размер ПЦР-продукга (п.н.) PCR product size (bp)
Прямой праймер Forward primer CHIC2d GG(G/A)GG(T/A)GACTC(A/C)(T/C) TGAGACTGCTCA (25 н.) (25 b) 3806-3831 648
Обратный праймер Reverse primer CHIC2r-2 GTT(C/T)A(G/A)TGA(C/T)TG(G/A) GT(C/T)AGCCT(G/A)TCTTT (27 H.) (27 b) 4426-4453
Таблица составлена авторами по собственным данным /The table is prepared bythe authors using their own data
Анализ нуклеотидных последовательностей геномов штаммов вируса Чикунгунья, представленных в базе данных GenBank, для дифференциации генотипов
Из базы данных GenBank были выбраны ну-клеотидные последовательности всех генотипов ЧИКВ длиной не менее 10000 н. Всего рассмотрена 731 нуклеотидная последовательность. В результате было установлено, что фрагмент гена неструктурного белка 2 (nsP2) длиной 648 н. между позициями 3806 и 4453 (относительно ре-ференсного генома ЧИКВ, GenBank NC_0041624) содержит сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, наличие или отсутствие которых составляют различные комбинации для каждого из 4-х генотипов ЧИКВ. Из-за вариабельности структур РНК данного фрагмента были подобраны праймеры с вырождением, позволяющие амплифицировать целевой участок генома всех рассмотренных штаммов ЧИКВ путем проведения ОТ-ПЦР (табл. 1).
Анализ нуклеотидных последовательностей с помощью метода множественного выравнивания позволил установить, что в выбранном фрагменте гена nsP2 в зависимости от генотипа вируса могут содержаться сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции PspEI, Pvull и Dral (рис. 1, табл. 2).
Сайты рестрикции PspEI, Pvull и Dral не одинаково представлены у разных генотипов ЧИКВ (табл. 2). В позиции 350 данного фрагмента в случае штаммов генотипов Asian, ECSA и ESCA-IOL находится последовательность GGTTACC, которая расщепляется рестритазой PspEI (сайт узнавания GGTNACC) и отсутствует у штаммов генотипа WAf. При этом у штаммов генотипа ESCA-IOL в позиции 252 обнаружена единичная нуклеотидная замена цитозина (С) на тимин (Т), что привело к образованию второго сайта узнавания рестриктазой PspEI. Таким образом,
расщепление ПЦР-продукта ферментом PspEI в случае штаммов генотипов Asian и ECSA должно привести к образованию двух фрагментов длиной 350 и 298 п.н., а для ESCA-IOL - к образованию трех фрагментов длиной 298, 252 и 98 п.н. В то же время расщепление ПЦР-продукта рестриктазой PspEI для штамма WAf не должно происходить. При анализе штаммов генотипов WAf, ECSA и ESCA-IOL обнаружена замена в положении 527 гуанина (G) на аденин (А), которая приводит к образованию последовательности CAGCTG и сайта узнавания для рестриктазы Pvull. При этом для генотипа WAf в результате замены А в позиции 226 на гуанин G в ДНК-фрагменте появляется еще один сайт узнавания Pvull. Генотип Asian не содержит сайтов узнавания Pvull. Таким образом, в случае штаммов Asian ПЦР-фрагмент гена nsP2 длиной 648 н. не может расщепляться Pvull, а для штаммов ECSA и ESCA-IOL гидролиз Pvull должен привести к образованию двух фрагментов длиной 527 и 121 п.н. В случае штаммов генотипа WAf ожидается образование трех фрагментов длиной 301, 226 и 121 п.н.
В геномах некоторых анализированных штаммов ЧИКВ генотипа ECSA (включая рефе-ренсный NC_004162, GenBank) сайт Pvull в позиции 527 отсутствует. В этом случае различие генотипов ECSA и Asian может быть установлено с помощью расщепления ампликона ферментом Dral. Анализ методом множественного выравнивания позволил установить, что в позиции 403 данного фрагмента генотипа Asian находится сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции Dral, что должно привести к разделению ПЦР-продукта на два фрагмента - длиной 403 и 245 п.н. В случае трех других генотипов ЧИКВ в ДНК-фрагменте в позиции 408 вместо АнаходитсяС,всвязисчем ПЦР-продуктне может расщепляться эндонуклеазой рестрикции Dral.
https://www.ncbi.nlm.nih.goV/nuccore/NC_004162.2
Прямой праймер
Forward primer -►
38QбGGGGGTGЛCTCЛTTGЛGЛCTGCTCЛЛЛCCGGGTGGCTCTCTЛTTGЛTCЛGЛGCЛTЛTG
GTTGCGCЛGЛTЛGЛЛCCЛGTGЛЛCGЛGTCЛTCTGGGTЛTTGGGЛCGCЛЛGTTTЛGЛTCЛTCT
22б
ЛЛTGGCЛGЛЛGGЛЛTTTCЛCЛЛCTCЛTGTCЛTGЛЛCЛЛTCЛ CTGAATGCAGCCTTTGTAGG 252
ACAGGCCACCCGAGCAGGATGTGCACCGTCGTACCGGGTAAAACGCATGGATATCGCGAAG
35Q
TTCGTTGTTGTGTGCGTTGTCTTCGCCGCCTTCCCTCGCGGGTTTCCTGGTGTCGGTGTTT
4Q3
GCAAGGCAGTATACAAAAAATGGCCGGAGTCCTTTAAAACAGTGCAACACCAGTGGGAACC GCAAAAACAGTCATGTGCGGTACGTATCCAGTAATCCACGCCGTTGGACCAAACTTCTCTAA
527
ttattcggagtctgaaggggaccgagaattggC gctGcctatcgagaagtcgcaaaggag
GTAACTAGACTGGGAGTAAATAGTGTAGCTATACCTCTCCTCTCCACAGGTGTATACTCAGG
aggGAaagacaggctgacccagtcactgaac|4453
Обратный праймер Reverse primer
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 1. Расположение сайтов рестрикции в выбранном фрагменте гена nsP2 вируса Чикунгунья (сконструированный участок генома всех штаммов).
Fig. 1. Restriction site location in the selected nsP2 gene fragment of Chikungunya virus (genome segment assembled for all the study strains).
Примечание. Сайты узнавания для рестриктаз: PspEI - GGtNACC; Dral - TTTAAa; Pvull - CAgCTG. Красным цветом отмечена замена нуклеотида в сайте рестрикции.
Note. Recognition sites for the restriction enzymes: PspEI, GGtNACC; Dral, TTTAAa;|Pvul|, CAgCTG. Nucleotide substitutions at the restriction sites are marked in red.
Таблица 2. Расчетная длина фрагментов рестрикции при типировании вируса Чикунгунья (ЧИКВ) методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
Table 2. Estimated restriction fragment lengths in Chikungunya virus (CHIKV) typing by the restriction fragment length polymorphism method
Генотип ЧИКВ CHIKV genotype Количество / ожидаемая длина фрагментов рестрикции (п.н.) Number/estimated length of restrictionfiagments (bp)
PspEI Pvull Dral
WAf Один/648 One/648 Три/301; 226; 121 Three/301; 226; 121 Один/648 One/648
Asian Два/350; 298 Two/350; 298 Один/648 One/648 Два/403; 245 Two/403; 245
ECSA Два/350; 298 Two/350; 298 Два/527; 121" Two/527; 121' Один/648 One/648
ECSA-IOL Три/298; 252; 98 Three/298; 252; 98 Два/527; 121 Two/527; 121 Один/648 One/648
Таблица составлена авторами по собственным данным /The table is prepared bythe authors using their own data
Примечание. Генотипы ЧИКВ: Азиатский (Asian), Западно-Африканский (West African, WAf), Восточно-Центральный ЮжноАфриканский (East-Central-South African, ECSA) и Восточно-Центральный Южно-Африканский - линия Индийского океана (East-Central-SouthAfrican - Indian Ocean Lineage, ECSA-IOL).
* сайт Pvull в позиции 527 в геномах некоторых штаммов генотипа ECSA (включая референсный NC_004162, GenBank) может отсутствовать.
Note. CHIKV genotypes: Asian; WAf, WestAfrican; ECSA, East/Central/South African; ECSA-IOL, ECSA Indian Ocean Lineage.
* There may be no Pvull site at position 527 in the genomes of some ECSA strains (including the reference genome NC_004162, GenBank).
Как следует из представленных в таблице 2 обобщенных данных, эндонуклеазы рестрикции Pvull и PspEI могут быть использованы для ге-нотипирования ЧИКВ методом ПДРФ, а фермент Dral - для дифференциации генотипов ECSA и Asian.
Оценка специфичности праймеров
Для определения специфичности выбранных праймеров проводили ОТ-ПЦР с контрольной рекомбинантной плазмидой, несущей последовательность гена nsP2 вируса Чикунгунья. В ходе реакции был амплифицирован фрагмент длиной, соответствующей расчетной, - 648 п.н. При проведении ОТ-ПЦР с использованием в качестве матрицы РНК гетерологичных вирусов (раздел «Материалы и методы») продукт амплификации выявлен не был. Напротив, при постановке ОТ-ПЦР с РНК ЧИВК всех четырех генотипов амплифицирован фрагмент длиной, соответствующей расчетной, что свидетельствовало о специфичности выбранных праймеров в отношении всех существующих генотипов ЧИКВ.
Результаты ОТ-ПЦР с последующей рестрикцией эндонуклеазами PspEI, PvuII и Dral
Для апробации разработанного способа типи-рования ЧИКВ на основе ОТ-ПЦР и метода ПДРФ была использована РНК штаммов, относящихся к разным генотипам. При проведении гидролиза
12 3
фрагмента гена nsP2 размером 648 п.н. с использованием эндонуклеаз рестрикции PspEI и Pvull в зависимости от генотипа ЧИКВ были получены фрагменты длиной, соответствующей расчетной
(рис. 2).
Результаты рестрикции (рис. 2) четко визуализировались при электрофоретической детекции. При этом в случае штамма ЧИКВ генотипа WAf амплифицируемый фрагмент не расщеплялся рестриктазой PspEI, но при гидролизе рестрик-тазой Pvull образовывал три фрагмента, что соответствует двум сайтам рестрикции. Это позволило дифференцировать генотип WAf от других генотипов. В случае генотипа Asian исследуемый фрагмент не имел сайтов рестрикции Pvull, что в большинстве случаев позволяло отличить его от генотипа ECSA. Анализ ПЦР-продуктов генотипов ECSA и ECSA-IOL показал наличие одинаковых фрагментов при рестрикции ферментом Pvull, но при этом имелись четкие отличия при расщеплении рестриктазой PspEI.
Для дифференциации генотипов ECSA и Asian при проведении гидролиза фрагмента гена nsP2 размером 648 п.н. была использована эн-донуклеаза Dral.
Анализ результатов (рис. 3) свидетельствует о том, что при проведении реакции были получены фрагменты длиной, соответствующей расчетной. В случае генотипов Asian и ECSA ре-стриктаза PspEI расщепляла ампликон на два
4 5 6 7 8 9 10 11
648 527
350
301/298 252
226 121/98
500 ШШ
400 —? ^т ^т
200 ^т mm
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 2. Результаты электрофоретической детекции ПЦР-фрагментов гена nsP2 штаммов вируса Чикунгунья (ЧИКВ) разных генотипов, полученных после гидролиза при использовании рестриктаз PspEI и Pvull. Дорожки на электрофореграм-ме: 1, 2 - маркеры молекулярного веса; 3 - амплифицированный фрагмент гена nsP2 ЧИКВ (расчетная длина 648 п.н.); 4-7 - фрагменты после рестрикции эндонуклеазой PspEI последовательностей штаммов, относящихся к генотипам: Азиатский (Asian) - 4, Восточно-Центральный Южно-Африканский (ECSA) - 5, ECSA линия Индийского океана (ECSA-IOL) - 6, Западно-Африканский (WAf) - 7; 8-11 - фрагменты после рестрикции эндонуклеазой Pvull последовательностей штаммов генотипов: Asian - 8, ECSA - 9, ECSA-IOL - 10,WAf - 11.
Fig. 2. Electrophoretic detection results for PCR fragments of the nsP2 gene of Chikungunya virus (CHIKV) strains of different genotypes, obtained upon hydrolysis with the restriction endonucleases PspEI and Pvull. Electropherogram lanes: 1-2, molecular weight markers; 3, amplified CHIKV nsP2 gene fragment (estimated length: 648 bp); 4-7, fragments of CHIKV genotypes restricted by PspEI (4, Asian; 5, East/Central/South African (ECSA); 6, ESCA Indian Ocean Lineage (ECSA-IOL); 7, West African (WAf)); 8-11, DNA fragments of CHIKV genotypes restricted by Pvull (8, Asian; 9, ECSA; 10, ECSA-IOL; 11, WAf).
M M
100 bp 50 bp 1 2 3 4 5 6
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 3. Результаты электрофоретической детекции ДНК-фрагментов гена nsP2 штаммов вируса Чикунгунья (ЧИКВ) генотипов Азиатский (Asian) и Восточно-Центральный Южно-Африканский (ECSA), полученных после гидролиза при использовании рестриктаз PspEI и Dral. Дорожки на электрофореграмме: 1, 2 - амплифицированный фрагмент гена nsP2 ЧИКВ (расчетная длина 648 п.н.) генотипа Asian (1), генотипа ECSA (2); 3, 4 - ДНК-фрагменты после рестрикции эндонуклеазой PspEI последовательностей штаммов генотипов: Asian (3), ECSA (4); 5,6- ДНК-фрагменты после рестрикции эндонуклеазой Dral последовательностей штаммов генотипов: ECSA (5), Asian (6).
Fig. 3. ELectrophoretic detection results for DNA fragments of the nsP2 gene of Chikungunya virus (CHIKV) strains of Asian and East/Central/South African (ESCA) genotypes, obtained upon hydrolysis with the restriction endonucleases PspEI and Dral. Elec-tropherogram lanes: 1-2, amplified CHIKV nsP2 gene fragments (estimated length: 648 bp) (1, Asian; 2, ECSA); 3-4, DNA fragments of CHIKV strain genotypes restricted by PspEI (3, Asian; 4, ECSA); 5-6, DNA fragments of CHIKV strain genotypes restricted by Dral (5, ECSA; 6, Asian).
фрагмента - 350 и 298 п.н. Втоже время в случае генотипа ECSA амплифицированный фрагмент не гидролизовался эндонуклеазой рестрикции Dral, а при анализе генотипа Asian показано расщепление ПЦР-продукта с образованием двух фрагментов, длины которых соответствовали расчетным - 403 и 245 п.н. Таким образом, метод ПДРФ позволил провести дифференциацию между всеми изученными генотипами ЧИКВ, и результаты рестрикционного анализа совпали сданными, полученными путем секвенирования, которое было осуществлено ранее.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные в работе результаты продемонстрировали, что в гене неструктурного
белка пэР2 ЧИКВ находится фрагмент, имеющий сайты эндонуклеаз рестрикции, комбинация которых специфична для каждого генотипа вируса. Теоретически предсказано и экспериментально подтверждено, что метод ПЦР с обратной транскрипцией и последующий анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов позволяют провести определение генотипа вируса Чикунгунья. Исследование не требует продолжительного времени и использования высокотехнологичного оборудования. Полученные результаты в перспективе могут быть использованы для идентификации и генотипирования при исследовании биологического материала, подозрительного на наличие возбудителя лихорадки Чикунгунья.
^MTepaiypa/References
1. Burt FJ, Chen W, Miner JJ, Lenschow DJ, Merits A, Schnettler E, et al. Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen. Lancet Infect Dis. 2017;17(4):el07-17. https://doi.org/10.1016/sl473-3099(16)30385-l
2. Simo FBN, Burt FJ, Makoah NA. Chikungunya virus diagnosis: a review of current antigen detection methods. Trop Med Infect Dis. 2023;8(7):365. https://doi.org/10.3390/tropicalmed8070365
3. Cunha MS, Costa PAG, Correa IA, de Souza MRM, Calil PT, Duarte da Silva GP, et al. Chikungunya virus: an emergent arbovirus to the South American continent and a continu-ousthreat totheworld. Front Microbiol. 2020;11:1297. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01297
4. Tanabe ELL, Tanabe ISB, Santos ECD, Marques JPDS, Borges AA, Lima MC, et al. Report of East-Central South African Chikungunya virus genotype during
the 2016 outbreak in the Alagoas State, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2018;60:el9. https://doi.org/10.1590/sl678-9946201860Q19
5. Panning M, Grywna K, Van Esbroeck M, Emmerich P, Dro-sten C. Chikungunya fever in travelers returning to Europe from the Indian Ocean region, 2006. Emerg Infect Dis. 2008;14(3):416-22.
https://doi.org/10.3201/eidl403.0709Q6
6. Lessa-Aquino C, Trinta KS, Pestana CP, Ribeiro MO, Su-cupira MVF, Boia MN, et al. Detection of East/Central/ South African genotype Chikungunya virus during an outbreak in a southeastern state of Brazil. Epidemiol Infect. 2018;146(16):2056-58. https://doi.org/10.1017/sQ950268818002467
7. Vega-Rua A, Zouache K, Caro V, Diancourt L, Delaunay P, Grandadam M, et al. High efficiency of temperate Aedes albopictus to transmit Chikungunya and dengue viruses in
the Southeast of France. PLoS One. 2013;8(3):e59716. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059716
8. Mattar S, Miranda J, Pinzon H, Tique V, Bolanos A, Aponte J, et al. Outbreak of Chikungunya virus in the north Caribbean area of Colombia: clinical presentation and phyloge-netic analysis. J Infect Dev Ctries. 2015;9(10):1126-32. https://doi.org/10.3855/jidc.6670
9. Johnson BW, Russell BJ, Goodman CH. Laboratory diagnosis of Chikungunya virus infections and commercial sources for diagnostic assays. JlnfectDis. 2016;214(suppl 5):S471-4. https://doi.org/10.1093/infdis/jiw274
10. Waggoner JJ, Ballesteros G, Gresh L, Mohamed-Hadley A, Tellez Y, Sahoo MK, et al. Clinical evaluation of a single-reaction real-time RT-PCR for pan-dengue and Chikungunya virus detection. JCHn Virol. 2016;78:57-61. https://doi.Org/10.1016/j.jcv.2016.01.007
11. CarLetti F, Bordi L, Chiappini R, Ippolito G, Sciarrone MR, Capobianchi MR, et al. Rapid detection and quantification of Chikungunya virus by a one-step reverse transcription polymerase chain reaction real-time assay. AmJ Trop MedHyg. 2007;77(3):521-4. https://doi.org/10.4269/ajtmh.2007.77.521
12. Cecilia D, Kakade M, Alagarasu K, PatiL J, Salunke A, Parashar D, Shah PS. Development of a multiplex real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of dengue and Chikungunya viruses. Arch Virol. 2015;160(l):323-7. https://doi.org/10.1007/sQ0705-014-2217-x
13. Кулак MB, Белавин ПА, Нетесова НА, Юнасова ТН, Голикова ЛН, Бектемиров ТА, Игнатьев ГМ. Дифференциация вакцинного штамма Л-3 от других штаммов вируса
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: H.A. Нетесова - обоснование концепции исследования, формулирование идеи, обобщение результатов исследования, критический пересмотр текста рукописи; М.А. Абдурашитов - создание модели исследования, анализ и обобщение данных литературы, расчет праймеров, критический пересмотр текста рукописи; Т.Г. Самарцева - подготовка образцов, проведение экспериментов, написание текста рукописи; О.В. Климович - подготовка образцов, проведение экспериментов; A.C. Океании - планирование исследования, редактирование текста рукописи; Е.В. Отрашевская - обобщение результатов исследования, редактирование текста рукописи; Г.М. Игнатьев - обоснование концепции исследования, планирование исследования, проведение экспериментов, написание текста рукописи.
паротита методом ОТ-ПЦР. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2008;(4):7-10. Kulak MV, Belavin PA, Netesova NA, Yunasova TN, Go-likova LN, Bektemirov TA, Ignatyev GM. Differentiation of the vaccine strain L-3 from other strains of the mumps virus by RT-PCR. BiOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2008;(4):7-10 (In Russ.). EDN: SATPMF
14. Игнатьев ГМ, Отрашевская ЕВ, Суханова ЛЛ, Сидоренко ЕС, Нетесова НА. Молекулярно-генетическое исследование штамма RA-27/3, используемого для производства вакцины против краснухи. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019;96(4):38-46. Ignatyev GM, Atrashevskaya EV, Suchanova LL, Sidoren-ko ES, Netesova NA. Molecular-genetic study of the RA-27/3 strain used for the production of rubella vaccine. Journal of Microbiology, Epidemiology and immunobiology. 2019;96(4):38-46 (In Russ.). https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-4-38-46
15. Игнатьев ГМ, Отрашевская ЕВ, Суханова ЛЛ, Сидоренко ЕС, Нетесова НА. Молекулярно-генетическое исследование штамма Ленинград-16, используемого для производства вакцины кори. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020;(2):182-9. Ignatyev GM, Atrasheuskaya AV, Sukhanova LL, Sidoren-ko ES, Netesova NA. Molecular genetic analysis of the strain Leningrad-16 used for the production of measles vaccine. Journal of Microbiology, Epidemiology and immunobiology. 2020;(2):182-9 (In Russ.). https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-2-182-189
Authors' contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. N.A. Netesova substantiated the study concept, formulated the study idea, summarised the study results, and critically revised the manuscript. M.A. Abdurashitov created the research model, analysed and summarised literature data, calculated the primers, and critically revised the manuscript. T.C. Samartseva prepared samples, conducted experiments, and drafted the manuscript. O.V. Klimovich prepared samples and conducted experiments. A.S. Oksa-nich planned the study and edited the manuscript. E.V. Otrashevskaia summarised the study results and edited the manuscript. C.M. Ignatyev substantiated the study concept, planned the study, conducted experiments, and drafted the manuscript.
Об авторах / Authors
Нетесова Нина Александровна, д-р биол. наук / Nina A. Netesova, Dr. Sei. (Biol.) ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9896-54Q5
Абдурашитов МуратАбдурашитович, канд. биол. наук/MuratA.Abdurashitov, Cand. Sei. (Biol.) ORCID: https://orcid.org/0000-0002-94Q2-5254 Самарцева Татьяна Геннадьевна /Tatiana G. Samartseva
ORCID: https://orcid.org/0000-00Q5-5264-6722 Климович Ольга Викторовна / Olga V. Klimovich
ORCID: https://orcid.org/0000-00Q2-7842-2552
Оксанич Алексей Сергеевич, канд. биол. наук/Alexey S. Oksanich, Cand. Sei. (Biol.) ORCID: https://orcid.org/0000-0002-860Q-7547 Отрашевская Елена Викторовна / Elena V. Otrashevskaia
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2491-4Q72
Игнатьев Георгий Михайлович, д-р мед. наук, проф./George M. Ignatyev, Dr. Sei. (Med.), Prof. ORCID: https://orcid.org/0000-00Q2-9751-5681
Поступила 27.12.2023 После доработки 03.04.2024 Принята к публикации 16.05.2024 Onlinefirst 17.05.2024
Received 27 December 2023 Revised 3 April 2024 Accepted 16 May 2024 Online first 17 May 2024
