CC BY
3УДК 630*165:630*44
Л. В. Можаровская, С. В. Пантелеев, О. Ю. Баранов, В. Е. Падутов
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АННОТАЦИЯ ПАТОГЕН-ИНДУЦИРОВАННЫХ ГЕНОВ ПРОРОСТКОВ СОСНЫ
ОБЫКНОВЕННОЙ
Институт леса НАН Беларуси Республика Беларусь, 246050, г. Гомель, ул. Пролетарская, 71 e-mail: milamozh@yandex.by
На основе данных высокопроизводительного секвенирования транскриптомов проростков сосны обыкновенной в условиях заражения микромицетом Fusarium sp идентифицированы патоген-индуцибельные гены, характеризующиеся наибольшим уровнем экспрессионной активности, кодирующие белки, ассоциированные с патогенезом, PR-4 и PR-10, тауматин и противогрибковые тауматин-подобные белки, лейцин-насыщенные рецепторподобные протеинкиназы, глицин-насыщенные РНК-связывающие белки, а также белок-шаперон HSP40S. Полученные данные относительно структуры и спектра генов, вовлеченных в защитные механизмы, позволяют в дальнейшем использовать их в качестве маркеров для генотипирования растений на признак индуцированной устойчивости к инфекционным заболеваниям.
Ключевые слова: сосна обыкновенная, высокопроизводительное секвенирование, транскриптом, гены устойчивости, антимикробные пептиды, фитопатогенные организмы.
Введение
Инфекционные болезни растений представляют собой сложные патологические комплексы и рассматриваются в настоящее время как совокупность биотических элементов, находящихся в топических и трофических отношениях и формирующих определенную экологическую систему. Как правило, основой формирования большинства патосистем является взаимодействие двух диаметрально противоположных экологических стратегий, степень реализации каждой из которых определяет итоговый результат сосуществования хозяина и патогена. В то же время, как отмечает ряд исследователей, в патосистемах зачастую выявляется и определенная взаимная координация физиологических процессов, что обеспечивает пролонгированность во времени существования системы организмов в рамках их онтогенетического развития [1]. Наряду с диагностируемыми морфолого-анатомически-ми изменениями тканей и органов инфицированных растений, значительные изменения могут затрагивать и метаболомы индивидов, что, как правило, обусловлено физиологической интеграцией организмов, представленных в патосистемах. Особенности формирования
метаболома патологического типа зачастую обусловлены таксономической принадлежностью видов (как хозяев, так и паразитов), представленных в патосистемах, характером паразитической специализации (облигатные, факультативные), физиологическим статусом и стадией онтогенеза растения-хозяина, генетическими детерминантами биотических элементов патокомплекса [2].
Среди молекулярно-генетических подходов, позволяющих выполнять сравнительную оценку метаболически различающихся пато-систем, транскриптомный анализ в настоящее время характеризуется наибольшей информативностью и прогностической ценностью. С одной стороны, данный подход позволяет охарактеризовать полный перечень генов, ассоциированных с патогенезом (как растений-хозяев, так и паразитов), а с другой — дает возможность проводить молекулярно-генети-ческую «паспортизацию» физиологического статуса каждого элемента, представленного в патосистеме [3].
Гены, определяющие защитные реакции растительных организмов, можно разделить на несколько групп по типам детерминируемых факторов резистентности: формирование
механического (биосинтез элементов клеточной стенки, покровных тканей и структур, и др.) и химического (выработка веществ био-цидного действия) барьеров, физиологических реакций (реакция сверхчувствительности). Кроме того, не менее важным аспектом является учет косвенных, по отношению к признаку резистентности, детерминант, определяющих анаболическую и катаболическую устойчивость, морфолого-анатомические особенности и способных в значительной степени определять формирование и проявление защитных свойств организмов [4, 5].
Последние достижения в области секве-нирования генома привели к значительному прогрессу в исследованиях различных количественных и качественных признаков древесных растений, ассоциированных с устойчивостью к негативным биотическим факторам [6]. Проведенный анализ структурно-функциональной организации генома лесных древесных растений позволил выявить широкий спектр генетических механизмов, формирующих индуцированный ответ у растений-хозяев на проникновение патогенной микрофлоры и более сложный характер взаимодействия на молекулярном уровне в патосистемах по сравнению с традиционной моделью «ген на ген», предложенной Гарольдом Флором.
На текущий момент генетическая детерминация факторов резистентности была установлена для различных патосистем древесных растений: Pinus sp. — Cronartium sp., Eucalyptus — Puccinia (Junghans et al. 2004), Populus sp. — Melampsora sp. (Newcombe et al. 1996) и др. [7-9]. Так, например, транскрип-томный анализ патосистемы Populus sp. — Melampsora sp. показал, что защитные механизмы растения-хозяина, как правило, инициируются специфическими для тополя сигнальными системами и выражаются в накоплении мРНК, кодирующих PR-белки, глутатион^-трансферазу (GST) и белок RISP, индуцируемый патогеном Melampsora sp. [10]. Исследования по картированию PR-генов ле-сообразующих пород позволили установить существенный вклад как аддитивной, так и неаддитивной генетической изменчивости в формировании устойчивости древесных видов к возбудителям заболеваний, что является подтверждением гипотезы о комплексной природе
взаимодействия локусов, ассоциированных с резистентностью, и тем самым предопределяет высокий потенциальный эффект от проведения клоновой селекции, в ходе которой может быть отобрано значительное число хозяйственно-значимых генетических комбинаций [11, 12].
Следует подчеркнуть, что особую актуальность направление генетического анализа патосистем приобрело в последнее время, в связи с наблюдающимися негативными процессами, протекающими в лесных экосистемах в различных странах мира, обусловленных вспышками насекомых-вредителей и фито-патогенных микроорганизмов. При этом, как отмечает ряд исследователей, прогнозируемые климатические изменения в ближайшем будущем могут привести к еще большему снижению устойчивости лесных ценозов и, как следствие, увеличению числа и площади очагов болезней и вредителей.
Исходя из всего вышесказанного видно, что проведение мероприятий по отбору устойчивых к заболеваниям форм и генотипов деревьев является одним из приоритетных направлений лесной селекции. Среди генетических маркеров наиболее ценными в селекционном плане являются локусы с индуцированным (на биотическое воздействие) характером экспрессии, поскольку конститутивные гены, как правило, находятся под прямым действием отбора и зачастую характеризуются низким уровнем полиморфизма. В то же время реализация наследственной информации патоген-индуцированных генов в большинстве случаев зависит от степени воздействия комплекса внешних факторов.
Исследования, проведенные нами ранее, позволили идентифицировать перечень конститутивных генов, ассоциированных с факторами резистентности по отношению фито-патогенным организмам, а также провести анализ уровня их экспрессии при различных температурных условиях [14, 15].
Целью текущей работы являлось выявление и описание патоген-индуцированных генов сосны обыкновенной, детерминирующих защитные механизмы на стадии проростков, на примере фузариоза (инфекционного полегания сеянцев) — заболевания, вызываемого различными видами некротрофных микромицетов рода Fusarium.
Материалы и методы
План проведения эксперимента включал в себя посев и выращивание семян сосны обыкновенной в контролируемых условиях (фитотроне) c последующим заражением возбудителем фузариоза (Fusarium sp.). Условия культивирования растений: торфо-песчаный субстрат, T = 22 °C, относительная влажность субстрата 60%. Создание избыточного инфекционного фона достигалось поэтапным внесением инокулюма гриба в субстрат (5 мг мицелия на 100 см2 площади субстрата): перед посадкой семян, на 7 и 14 день после появления всходов. В качестве инокулюма использовали культуру Fusarium sp., идентифицированного и выделенного из сеянцев с признаками инфекционного полегания (лесной питомник ГЛХУ «Брестский лесхоз»). В условиях опыта сеянцы (n = 15) с симптомами инфекционного полегания (увядание, наличие воздушного налета мицелия вокруг стволика) изымали из почвы, очищали и использовали в качестве экспериментального материала (ткани корня и гипокотиля) для получения препаратов мРНК. Высокопроизводительное секвенирование и анализ транскриптомов выполняли на базе Ion PGM Torrent (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколам, изложенным в предыдущих исследованиях [14, 15]. Нормализацию уровней экспрессии генов исследуемых транс-криптомов проводили относительно одного миллиона прочтений — рассчитывали величину RPM (от англ. reads per million, RPM — прочтений на миллион) [16].
Результаты и обсуждение
В ходе аннотации в базе данных консервативных доменов (CDD) GeneBank NCBI кодирующих последовательностей, полученных на основании процессинга и анализа результатов секвенирования транскриптомов сеянцев сосны обыкновенной, было идентифицировано 2209 типов функциональных и структурных полипептидов. Для поиска и идентификации индуцибельных генов, ассоциированных с устойчивостью, было отобрано 150 EST-локусов, характеризующихся наибольшим уровнем экспрессии и, соответственно, наивысшими значениями показателя количества прочтений на транскрипт. Структурно-функциональная принадлежность и оценка дифферен-
циальной экспрессии изученных EST-локусов проростков сосны обыкновенной относительно одного миллиона прочтений RPM приведена в электронном ресурсе https://mega.nz [16].
Проведенный анализ экспрессируемых последовательностей, представленных в транс-криптомах инфицированных сеянцев сосны обыкновенной, показал, что наряду с описанными нами ранее конститутивными генами, кодирующими защитные белки SS/AF, AMP, DEF, GH19, LEA, DHN, CBP, PSACRE, HSP70, HSP90, выявлен обширный спектр локусов, детерминирующих структурные и функциональные полипептиды, вовлеченные в индуцированные механизмы защиты растений [13, 14, 17]. Описание выявленных патоген-индуцирован-ных генов, ассоциированных с защитными реакциями, приводится ниже.
Одними из наиболее представленных транс-криптов в анализируемых патосистемах явились последовательности (10 локусов), кодирующие белки семейства PR-10. Наибольший уровень генетического сходства (90-97%) идентифицированных локусов был выявлен с депонентами GenBank HM210088.1 и AY064202.1, относящимися к генам семейства PR-10 Pinus pinaster и P monticola соответственно. Согласно литературным данным, белки семейства PR-10 идентифицированы у значительного числа видов растений, включая также и хвойные породы [18-20]. Защитные свойства PR-10-белков, как правило, ассоциированы с их рибонукле-азной активностью и, как следствие, способностью подавлять рост патогенов [21, 22]. Индуцибельный характер экспрессии генов семейства PR-10 был продемонстрирован на примере формирования защитных реакций, вызванных воздействием различных негативных биотических и абиотических факторов, таких как фитопатогенная инфекция [23, 24], ультрафиолетовое излучение [25], холодовый стресс [24, 26, 27] и др. Так, в работе Аб. Экра-моддулы и Р. Ханта на модельных объектах продемонстрован эффект интенсивного накопления PR-10-белков в инфицированных тканях древесных растений [28].
Также в исследуемых нами транскриптомах диагностировано 16 последовательностей, содержащих функциональный домен pfam00314 белков семейства тауматинов и cd09217 подсемейства противогрибковых тауматин-подобных
белков TLP-P, относящихся к суперсемейству 64 гликозидгидролаз и тауматин-подобных белков GH64-TLP-SF. Анализ сходства нуклеотид-ных последовательностей для транскриптов, отнесенных к семейству тауматинов, показал высокий уровень их консервативности. Так, например, сходство с последовательностями из базы данных нуклеотидных последовательностей GeneBank NCBI для контигов № 355, 702, 957 составило 91-95% с последовательностями генов таутамин-подобных белков L4 (TLP-L4) P monticola (депонент GenBank GQ329662.1); контигов № 697 и 776 — 84% и 92% с генами таутамин-подобных белков L2 (TLP-L2) P monticola (депонент GenBank GQ329660.1); контига № 1814 — 96% с последовательностью гена, кодирующего таута-мин-подобный белок L3 P. monticola (депонент GenBank GQ329661.1); контига № 1547 — 98% с трансрибируемой последовательностью P taeda (депонент GenBank JQ015853.1). Проведенный сравнительный анализ выявленных генов тауматин-подобных белков сосны обыкновенной также показал высокий уровень их консервативности в пределах рода Pinus — степень сходства с аналогичным локусом TLP P massoniana (депонент GenBank KM063439.1) составила 97-99 %.
В соответствии с существующей международной классификацией, тауматин-по-добные белки растений (TLP) относятся к семейству PR-5-белков и широко представлены в протеомах растений, подверженных воздействию стрессовым факторам абиотической (пониженные температуры, засуха, засоление) и биотической природы [29]. Так, например, при исследовании патосистемы Populus sp. — Melampsora sp., в листьях тополя выявлено значительное накопление транс-криптов TLP в местах локализации инфекции Melampsora sp. — возбудителя обыкновенной ржавчины [30]. Для хвойных видов на примере P. monticola также был продемонстрирован индуцированный защитный ответ, основанный на гиперэкспрессии тауматин-подобных белков в ответ на заражение фитопатогенным грибом Cronartium ribicola [31]. Кроме того, различными авторами описана антигрибковая активность TLP по отношению к патогенным грибам рода Fusarium [32-34]. Согласно современным биохимическим данным, основой
фунгицидных свойств TLP-белков является их гидролитическая активность, направленная на разрушение полисахаридных компонентов клеточной стенки грибов [35, 36].
Высокий уровень экспрессии у изученных транскриптомов сеянцев сосны обыкновенной был выявлен и для гена, детерминирующего белок семейства глутатион^-трансфераз (GST), подсемейства класса Tau. Ферменты с глутатион^-трансферазной активностью (ЕС 2.5.1.18) являются многофункциональными белками и кодируются значительным числом семейств генов, классифицируемых на основе идентичности нуклеотидных последовательностей. В настоящее время выделяют пять основных групп — phi, tau, theta, zeta и lambda, которые главным образом детерминируют реакции каталитической конъюгации внутриклеточного глутатиона (GSH) с широким спектром электрофильных, цитотоксических и генотоксических молекул эндогенного или экзогенного происхождения [37]. Семейства генов phi и tau присутствуют только у растений, и их основными физиологическими функциями являются формирование механизмов де-токсикация ксенобиотиков и защиты клеток от различных биотических и абиотических стрессовых факторов, таких как фитопатогены, токсины тяжелых металлов, окислительные агенты и ультрафиолетовое излучение [38-41]. Вследствие высокого разнообразия потенциальных ксенобиотиков и стрессовых факторов функциональная дивергенция семейств генов GST имеет большое адаптивное значение [42]. Так, в исследовании Тинг Лана с соавторами показаны направления филогенетической дивергенции семейств генов GST по сайтам связывания субстрата и формированию новых каталитических функций, что играет немаловажную роль в повышении системной устойчивости растений к абиотическому и биотическому стрессу [43-45]. Среди хвойных видов рода Pinus структурно-функциональная организация пептидов глутатион^-трансфераз детально исследована для сосны красной китайской P tabulaeformis.
Среди индуцибельных PR-генов нами были идентифицированы локусы семейства белков PR-4, содержащих консервативный С-концевой домен Barwin (pfam00967), состоящий из шести остатков цистеина, объединенных тремя
внутримолекулярными дисульфидными связями. Как и в случае PR-10-белков, семейство PR-4 характеризуется рибонуклеазной активностью, определяющей ее фунгицидные свойства [46-51]. В качестве примера работ по изучению защитных свойств PR-4-белков можно привести статью М. А. Ислама с соавторами, посвященную изучению устойчивости сеянцев Pseudotsuga menziesii к корневой гнили (Phellinus sulphurascens). В данном исследовании продемонстрирован повышенный уровень экспрессии PR-4-генов у резистентных растений, что указывает на важную роль PR-4-белков как фактора резистентности по отношению к некротрофным грибам [51].
Еще одной идентифицированной группой наследственных факторов устойчивости явились локусы, детерминирующие белки с лейцин-насыщенными повторами (LRR), большая часть из которых относилась к рецептор-подобным протеинкиназам с лейцин-насыщенным доменом LRR-RLK (cl33413). Кроме того, нами были идентифицированы последовательности, содержащие домен, аннотированный как PLN03210, определяющий устойчивость растений к Pseudomonas syringae (в частности, характерный для рецепторов класса TIR-NBS-LRR Arabidopsis thaliana) [52]. LRR-RLK представляют собой самую разнообразную группу рецептороподобных киназ у растений, играют важную роль в индуцировании ответных реакций на стресс, опосредуя сигнальные трансдукции в клетках [53]. Согласно литературным данным, LRR-RLK являются многофункциональными — кроме выполнения защитных функций, они участвуют во многих других физиологических процессах, включая рост и развитие растений [54-58].
Кроме генов лейцин-насыщенных белков, в транскриптомах зараженных сеянцев сосны обыкновенной были диагностированы мРНК семейства глицин-насыщенных белков (pfam07172), а также глицин-насыщенных РНК-связывающих белков GRP (PLN03134). РНК-связывающие белки регулируют экспрессию генов главным образом на посттранскрипционном уровне, который включает сплайсинг пре-мРНК, нуклеоцитоплазмати-ческий транспорт мРНК, стабильность и распад мРНК и трансляцию [59]. Глицин-насыщенные РНК-связывающие белки содержат
мотив узнавания РНК (RRM) на N-конце и глицин-богатую область на С-конце [60, 61]. Присутствие GRP у различных видов растений и их ключевая роль в адаптации организмов к биотическим и абиотическим стрессам, включая те, которые возникают в результате патогенеза, изменений в осмотической, физиологической и окислительной среде и изменений температуры, подробно описана в ряде исследований [61-65]. Предположительно РНК-связывающие глицин-насыщенные белки являются основными молекулярными компонентами посттранскрипционной регуляции генов, изменяя их экспрессию путем модификации альтернативного сплайсинга, экспорта мРНК, трансляции мРНК и деградации мРНК, при этом их функционирование регулируется растительными гормонами [61].
Интересно отметить, что среди белков-шапе-ронов наибольшим уровнем экспрессии характеризовались транскрипты, содержащие домен DnaJ (pfam00226), идентифицированные также как белки-шапероны HSP40S. HSP40S является ко-шапероном системы HSP70, опосредуя его взаимодействие с измененным белком. Согласно литературным данным, HSP40 и HSP70 участвуют в механизмах защиты растения при микробном или вирусном патогенезе. Несмотря на то, что повышенная экспрессия HSP усиливает устойчивость растений к фито-патогенам, большинство механизмов данного ответа остаются невыясненными [66].
Для всех идентифицированных индуцибель-ных генов, ассоциированных с защитными реакциями растений к биотическому фактору Fusarium spp., нами были разработаны алгоритмы их анализа, включая оценку уровня экспрессии методом количественной ПЦР и типирования генетического полиморфизма.
Заключение
Использование наследственно-обусловленного устойчивого к фитопатогенным микроорганизмам посадочного материала является приоритетной задачей современного лесо-восстановления, когда в силу наблюдающихся глобальных климатических изменений и широкого распространения различных патогенных организмов вопросы устойчивости насаждений стоят наиболее остро. В данном аспекте центральным звеном является
проведение селекционных мероприятий, направленных на поиск генотипов, характеризующихся пластичными индуцибельными механизмами устойчивости. В результате проведенного исследования для транскриптома проростков сосны обыкновенной идентифицированы гены, участвующие в индуцированном защитном ответе, которые кодируют белки, ассоциированные с патогенезом, PR-4 и PR-10, тауматин и противогрибковые тау-матин-подобные белки, лейцин-насыщенные рецепторподобные протеинкиназы, глицин-насыщенные РНК-связывающие белки, а также белок-шаперон HSP40S. Полученные данные, относительно структуры и спектра генов, вовлеченных в защитные механизмы, позволяют в дальнейшем их использовать в качестве маркеров для генотипирования растений на признак индуцированной устойчивости к инфекционным заболеваниям.
Список использованных источников
1. Фундаментальная фитопатология: [монография] / [С. Ф. Багирова и др.] под ред. Ю. Т. Дьякова // Москва : КРАСАНД. - 2011. -508 с.
2. Tugizimana, F. Metabolomic analysis of defence-related reprogramming in Sorghum bicolor in response to Colletotrichum sublineolum infection reveals a functional metabolic web of phenylpropanoid and flavonoid pathways / F. Tugizimana [et al.] // Frontiers in plant science. -2018. - Vol. 9. - P. 1840.
3. Vogel, C. The Arabidopsis leaf transcriptome reveals distinct but also overlapping responses to colonization by phyllosphere commensals and pathogen infection with impact on plant health / C. Vogel, N. Bodenhausen, W. Gruissem, J. A. Vorholt // New Phytologist. - 2016. - Vol. 212, № 1. - P. 192-207.
4. Rasul, I. Genetic Basis for Biotic Stress Resistance in Plants from Solanaceae Family: A Review / I. Rasul [et al.] // International Journal Of Agriculture And Biology. - 2019. - Vol. 22, № 1. - P. 178-194.
5. Krattinger, S. G. Molecular genetics and evolution of disease resistance in cereals / S. G. Krattinger, B. Keller // New Phytologist. - 2016. - Vol. 212, № 2. - P. 320-332.
6. Plomion, C. Forest tree genomics: 10 achievements from the past 10 years and future
prospects / C. Plomion [et al.] // Annals of Forest Science. - 2016. - Vol. 73, № 1. - P. 77-103.
7. Wilcox, P. L. Detection of a major gene for resistance to fusiform rust disease in loblolly pine by genomic mapping / P. L. Wilcox [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. - 1996. - Vol. 93. - P. 3859-3864.
8. Junghans, D. T. Resistance to rust Puccinia psidii winter in Eucalyptus: mode of inheritance and mapping of a major gene with RAPD markers / D. T. Junghans [et al.] // Theoretical and Applied Genetics Theor Appl Genet. - 2004. - Vol. 108. - P. 175-180.
9. Newcombe, G. A major gene for resistance to Melampsora medusa f. sp. deltoidae in a hybrid poplar pedigree / G. Newcombe, H. D. Bradshaw, G. A. Chastagner, R. F. Stettler // Phytopathology. - 1996. - Vol. 86. - P. 87-94
10. Duplessis, S. Poplar and pathogen interactions: insights from Populus genome-wide analyses of resistance and defense gene families and gene expression profiling / S. Duplessis, I. Major, F. Martin, Seguin // Critical Reviews in Plant Sciences. - 2009. - Vol. 28. - P. 309-334.
11. Jorge, V. Genetic architecture of qualitative and quantitative Melampsora larici-populina leaf rust resistance in hybrid poplar: genetic mapping and QTL detection / V. Jorge, A. Dowkiw, P. Faivre-Rampant, C. Bastien // New Phytologist. - 2005. - Vol. 167. - P. 113-127.
12. Alves, A. A. Genetic mapping provides evidence for the role of additive and non-additive QTLs in the response of inter-specific hybrids of Eucalyptus to Puccinia psidii rust infection / A. A. Alves // Euphytica. - 2012. - Vol. 183. - P. 27-38.
13. Можаровская, Л. В. Функциональная аннотация генов Pinus sylvestris, ассоциированных с устойчивостью к фитопатогенным микромицетам / Л. В. Можаровская // Журнал Белорусского государственного университета. -Биология. - 2018. - № 2. - С. 78 -84.
14. Можаровская, Л. В. Сравнительный анализ транскрипционных профилей проростков сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) различающихся температурными условиями выращивания / Л. В. Можаровская // Проблемы лесоведения и лесоводства: Сб. науч. Трудов ИЛ НАН Беларуси. - Вып. 78. - Гомель: ИЛ НАН Беларуси, 2018. - С. 70-78.
15. Aanes, H. Normalization of RNA-sequenc-ing data from samples with varying mRNA lev-
els / H. Aanes [et al.] // PloS one. - 2014. - Vol. 9, № 2. - P. e89158.
16. Приложение [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://mega.nz/#!a90knIpC!wKp A8q0Ees3LMisDe4qjr1s0coLwNW_H0bMnT5-bIH0. - Дата доступа: 16.08.2019.
17. Можаровская, Л. В. Структурно-функциональный анализ локусов, кодирующих антимикробные пептиды сосны обыкновенной / Л. В. Можаровская // Сборник научных трудов. Молекулярная и прикладная генетика. -2018. - Т. 25. - С. 84-91
18. Ekramoddoullah, A. K. M. Challenges and opportunities in studies of host-pathogen interactions in forest tree species / A. K. M. Ekramoddoullah, R. S. Hunt // Canadian Journal of Plant Pathology. - 2002. - Vol. 24. - P. 408-415.
19. Dubos, C. Drought differentially affects expression of a PR-10 protein, in needles of maritime pine (Pinus pinaster Ait.) seedlings / C. Dubos, C. Plomion // Journal of Experimental Botany. -2001. - Vol. 52, № 358. - P. 1143-1144.
20. Liu, J. J.Characterization, expression and evolution of two novel subfamilies of Pinus monticola cDNAs encoding pathogenesis-related (PR)-10 proteins / J. J. Liu, A. K. M. Ekramoddoullah // Tree physiology. - 2004. - Vol. 24, № 12. - P. 1377-1385.
21. Bantignies, B. Direct evidence for ribonu-cleolytic activity of a PR-10-like protein from white lupin roots / B. Bantignies [et al.] // Plant molecular biology. - 2000. - Vol. 42, № 6. -P. 871-881.
22. Филипенко, Е. А. PR-белки с рибонукле-азной активностью и устойчивость растений к патогенным грибам / Е. А. Филипенко [и др.] // Вавиловский журнал генетики и селекции. -2014. - Т. 17, № 2. - С. 326-334.
23. McGee, J. D. Characterization of a PR-10 pathogenesis-related gene family induced in rice during infection with Magnaporthe grisea / J. D. McGee, J. E. Hamer, T. K. Hodges // Molecular Plant Microbe Interactions. - 2001. - Vol. 14. - P. 877-886.
24. Liu, J. J. Differential expression of multiple PR10 proteins in western white pine following wounding, fungal infection and cold-hardening / J. J. Liu, A. K. M. Ekramoddoullah, X. Yu // Plant Physiology. - 2003. - Vol. 119. - P. 544-553.
25. Pinto, M. P. Lupinus albus L. pathogene-sis-related proteins that show similarity to PR-
10 proteins / M. P. Pinto, C. P. Ricardo // Plant Physiology. - 1995. - Vol. 109. - P. 1345-1351.
26. Ekramoddoullah, A. K. M. Characterization of a fall protein of sugar pine and detection of its homologue associated with frost hardiness of western white pine needles / A. K. M. Ekramoddoullah, D. Taylor, B. J. Hawkins // Canadian Journal of Forest Research. - 1995. - Vol. 25. - P. 1137-1147.
27. Ekramoddoullah, A. K. M. Detection and seasonal expression pattern of a pathogenesis-re-lated protein (PR-10) in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) tissues / A. K. M. Ekramoddoullah, X. Yu, R. Sturrock, A. Zamani, D. Taylor // Plant Physiology. - 2000. -Vol. 110. - P. 240-247.
28. Ekramoddoullah, A. K. M. Challenges and opportunities in studies of host-pathogen interactions in forest tree species / A. K. M. Ekramoddoullah, R. S. Hunt // Canadian Journal of Plant Pathology. - 2002. - Vol. 24, № 4. - P. 408-415.
29. Liu, J. J. The superfamily of thaumatin-like proteins: its origin, evolution, and expression towards biological function / J. J. Liu, R. Sturrock, A. K. M. Ekramoddoullah // Plant cell reports. -2010. - Vol, № 5. - P. 419-436.
30. Petre, B. Genome-wide analysis of eukar-yote thaumatin-like proteins (TLPs) with an emphasis on poplar / B. Petre [et al.] // BMC plant biology. - 2011. - Vol. 11, № 1. - P. 33.
31. Liu, J. J. Expression profiling of a complex thaumatin-like protein family in western white pine / J. J. Liu, A. Zamani, A. K. M. Ekramoddoullah // Planta. - 2010. - Vol. 231, № 3. -P. 637-651.
32. Garcia-Casado, G. Characterization of an apoplastic basic thaumatin-like protein from recalcitrant chestnut seeds / G. Garcia-Casado [et al.] // Physiologia Plantarum. - 2000. - Vol. 110, № 2. - P. 172-180.
33. Chu, K. T. Isolation of a large thaumatin-like antifungal protein from seeds of the Kweilin chestnut Castanopsis chinensis / K. T. Chu, T. B. Ng // Biochemical and biophysical research communications. - 2003. - Vol. 301, № 2. - P. 364-370.
34. Campos, M. A. Expression in Escherichia coli, purification, refolding and antifungal activity of an osmotin from Solanum nigrum / M. A. Campos [et al.] // Microbial cell factories. - 2008. -Vol. 7, № 1. - P. 7.
35. Trudel, J. Several thaumatin-like proteins bind to ß-1, 3-glucans / J. Trudel [et al.] // Plant physiology. - 1998. - Vol. 118, № 4. - P. 1431-1438.
36. Grenier, J. Some thaumatin-like proteins hydrolyse polymeric b-1, 3-glucans / J. Grenier, C. Potvin, J. Trudel, A. Asselin // Plant J. - 1999. -Vol. 19. - P. 473-480.
37. Nutricati, E. Characterization of two Arabi-dopsis thaliana glutathione S-transferases / E. Nutricati [et al.] // Plant cell reports. - 2006. - Vol. 25, № 9. - P. 997-1005.
38. Loyall, L. Glutathione and a UV light-induced glutathione S-transferase are involved in signaling to chalcone synthase in cell cultures / L. Loyall [et al.] // Plant Cell. - 2000. - Vol. 12. -P. 1939-1950.
39. Kampranis, S. C. A novel plant glutathione S-transferase/ peroxidase suppresses Bax lethality in yeast / S. C. Kampranis [et al.] // Journal of Biological Chemistry. - 2000. - Vol. 275. -P. 29207-29216.
40. Mueller, L. A. AN9, a petunia glutathione S-transferase required for anthocyanin sequestration, is a flavonoid-binding protein / L. A. Mueller, C. D. Goodman, R. A. Silady, V. Walbot // Plant Physiol.- 2000. - Vol. 123. - P. 1561-1570.
41. Agrawal, G. K. A pathogen-induced novel rice (Oryza sativa L.) gene encodes a putative protein homologous to type II glutathione S-transferases / G. K. Agrawal, N. S. Jwa, R. Rakwal // Plant Science. - 2002. - Vol. 163. -P. 1153-1160.
42. Lan, T. Structural and functional evolution of positively selected sites in pine glutathione S-transferase enzyme family / T. Lan, X. R. Wang, Q. Y. Zeng // Journal of Biological Chemistry. -2013. - Vol. 288, № 34. - P. 24441-24451.
43. Zeng, Q. Y. Molecular characterization of a glutathione transferase from Pinus tabulae formis (Pinaceae) / Q. Y. Zeng, H. Lu, X. R. Wang // Biochimie. - 2005. - Vol. 87, № 5. - P. 445-455.
44. Lan, T. Structural and functional evolution of positively selected sites in pine glutathione S-transferase enzyme family/ T. Lan, X. R. Wang, Q. Y. Zeng // Journal of Biological Chemistry. -2013. - Vol. 288, № 34. - P. 24441-24451.
45. Zeng, Q. Y. Catalytic properties of glu-tathione-binding residues in a t class glutathione transferase (PtGSTU1) from Pinus tabulaeformis / Q. Y. Zeng, X. R. Wang // FEBS letters. - 2005. -Vol. 579, № 12. - P. 2657-2662.
46. Chung, S. Y. Molecular characterization of a PR4 gene in Chinese cabbage / Chung S. Y. [et
al.] // Integrative Biosciences. - 2005. - Vol. 9, № 4. - P. 239-244.
47. Agrawal, G. K. Isolation of a novel rice PR4 type gene whose mRNA expression is modulated by blast pathogen attack and signaling components / G. K. Agrawal [et al.] // Plant Physiology and Biochemistry. - 2003. - Vol. 41, № 1. -P. 81-90.
48. Zhu, T. Molecular characterization of the rice pathogenesis-related protein, OsPR-4b, and its antifungal activity against Rhizoctonia solani / T. Zhu, F. Song, Z. Zheng //Journal of Phytopathology. - 2006. - Vol. 154, № 6. - P. 378-384.
49. Li, X. A new pathogenesis-related protein, LrPR4, from Lycoris radiata, and its antifungal activity against Magnaporthe grisea / X. Li [et al.] // Molecular biology reports. - 2010. -Vol. 37, № 2. - P. 995.
50. Caporale, C. Wheat pathogenesis-related proteins of class 4 have ribonuclease activity / C. Caporale [et al.] // Febs Letters. - 2004. - Vol. 575, № 1-3. - P. 71-76.
51. Islam, M. A. Molecular cloning and gene transcription analyses of barwin-type PR-4 genes from Phellinus sulphurascens-infected Douglas-fir seedlings / M. A. Islam, R. N. Sturrock, A. K. M. Ekramoddoullah // Forest Pathology. -2012. - Vol. 42, № 4. - P. 279-288.
52. Kim, S. Resistance to the Pseudomonas syrin-gae effector HopA1 is governed by the TIR-NBS-LRR protein RPS6 and is enhanced by mutations in SRFR1 / S. H. Kim [et al.] // Plant physiology. -2009. - Vol. 150, № 4. - P. 1723-1732.
53. Shiu, S. H. Receptor-like kinases from Arabi-dopsis form a monophyletic gene family related to animal receptor kinases / S. H. Shiu, A. B. Bleeck-er // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. - Vol. 98, № 19. - P. 10763-10768.
54. Schoof, H. The stem cell population of Arabidopsis shoot meristems is maintained by a regulatory loop between the CLAVATA and WUS-CHEL genes / H. Schoof [et al.] // Cell. - 2000. -Vol. 100, № 6. - P. 635-644.
55. Agusti, J. Characterization of transcriptome remodeling during cambium formation identifies MOL1 and RUL1 as opposing regulators of secondary growth / J. Agusti, R. Lichtenberger, M. Schwarz, L. Nehlin, T. Greb // PLoS Genetics. - 2011. - Vol. 7, № 2. - P. e1001312.
56. Albrecht, C. The Arabidopsis thaliana somatic embryogenesis receptor-like kinases! and 2
control male sporogenesis / C. Albrecht [et al.] // Plant Cell. - 2005. - Vol.17, № 12. - P. 37-49.
57. Gomez-Gomez, L. FLS2: an LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis / L. Gomez-Gomez, T. Boller // Mol Cell. - 2000. -Vol. 5, № 6. - P. 1003-1011. - doi: 10.1016/ S1097-2765(00)80265-8.
58. Zipfel, C. Perception of the bacterial PAMP EF-Tu by the receptor EFR restricts Agrobacteri-um-mediated transformation / C. Zipfel [et al.] // Cell. - 2006. - Vol. 125, № 4. - P. 749-760.
59. Simpson, G. G. Splicing of precursors to mRNA in higher plants: mechanism, regulation and sub-nuclear organization of the spliceoso-mal machinery / G. G. Simpson, W. Filipow-icz // Plant Molecular Biology. - 1996. - Vol. 32. - P. 1-41.
60. Burd, C. G. Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins / C. G. Burd, G. Dreyfuss // Science. - 1994. - Vol. 265. - P. 615-621.
61. Ciuzan, O. The evolutionarily conserved multifunctional glycine-rich RNA-binding proteins play key roles in development and stress adaptation / O. Ciuzan [et al.] // Physiologia plan-tarum. - 2015. - Vol. 153, № 1. - P. 1-11.
62. Simon, A. E. Genes encoding gly-cine-rich Arabidopsis thaliana proteins with RNA-binding motifs are influenced by cold treatment and an endogenous circadian rhythm / A. E. Simon // Plant Physiology. - 1994. - Vol. 104. - P. 1015-1025.
63. Ferullo, J-M. Differential accumulation of two glycine-rich proteins during cold-acclimation alfalfa / J-M. Ferullo [et al.] // Plant Molecular Biology. - 1997. - Vol. 33. - P. 625-633.
64. Aneeta, N. S.-M. Salinity- and ABA-induced up-regulation and light-mediated modulation of mRNA encoding glycine-rich RNA-binding protein from Sorghum bicolor / N. S.-M. Aneeta, N. Tuteja, S. K. Sopory // Biochemical and Biophysical Research Communication. - 2002. - Vol. 296. - P. 1063-1068.
65. Naqvi, S. M. S. A glycine-rich RNA-binding protein gene is differentially expressed during acute hypersensitive response following Tobacco Mosaic Virus infection in tobacco / S. M. S. Naqvi [et al.] // Plant molecular biology. - 1998. - Vol. 37, № 3. - P. 571-576.
66. Park, C. J. Heat shock proteins: a review of the molecular chaperones for plant immunity / C. J. Park, Y. S. Seo // The plant pathology journal. - 2015. - Vol. 31, № 4. - P. 323.
L. V. Mozharovskaya, S. V. Panteleev, O. Yu. Baranov, V. E. Padutov
IDENTIFICATION AND FUNCTIONAL ANNOTATION OF PATHOGEN-INDUCED GENES OF SCOTS PINE SEEDLINGS
Forest Research Institute of NASB Gomel, 246050, the Republic of Belarus
Based on the data of high-throughput sequencing of Scots pine seedling transcriptomes under the conditions of Fusarium sp micromycete infection, pathogen-induced genes characterized by the highest level of their expression activity, coding proteins associated with pathogenesis, PR-4 and PR-10, thaumatin and antifungal thaumatin-like proteins, leucine-saturated receptor-like protein kinases, glycine-saturated RNA-binding proteins, as well as the chaperone protein HSP40S were identified. The data obtained regarding the structure and a spectrum of genes involved in defense mechanisms allow to use them as markers in plant genotyping for induced resistance traits to infectious diseases.
Key words: Scotcs pine, high-throughput sequencing, transcriptome, resistance genes, phytopathogenic organisms.
Дата поступления статьи: 31 августа 2019 г.
