CC BY
129
УДК 636.2.034:636.2.082.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ DUMPS И BC
У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ
*Тюлькин С.В. - к.с.-х.н.; Ахметов Т.М. - д.б.н., доцент; **Вафин Р.Р. - д.б.н., науч.
консультант
* Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория, г. Казань Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана **Казанскйи (Приволжский) федеральный университет тел.: (843) 273-97-75
Ключевые слова: бык-производитель, мутация, DUMPS, BC, ПЦР, ПДРФ.
Keywords: stud bull, mutation, DUMPS, BC, PCR, RFLP.
Широкий обмен генетическим материалом между странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний, а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. В отдельных случаях наблюдается высокая скорость распространения таких мутаций. Огромный экономический ущерб обусловливает необходимость строгого генетического контроля импортируемого генетического материала, а также изучение возможных механизмов распространения мутаций [2, 5, 1].
К таким наследственным заболеваниям относят у крупного рогатого скота дефицит уридин-монофосфат-синтетазы (DUMPS) и дефицит аргининосукцинат-синтазы - цитрулинемия (BC).
Аутосомная рецессивная мутация DUMPS (deficiency of uridine monophosphate synthase) приводит к дефициту активности фермента уридин-монофосфат-синтетазы, является причиной дефектов синтеза нуклеиновых кислот и проявляется мегалобластозами, т.е. увеличением размеров клеток, например, эритроцитов и разрастанием эритробластной системы. Наблюдается также проявление дефектов функционирования нервной системы. Этой мутацией отягощен, главным образом, скот голштинской породы. Гомозиготы мутантного гена DUMPS гибнут на 40 день беременности. Гетерозиготы фенотипически нормальны, но активность фермента в различных тканях у них в 2 раза меньше, чем у нормальных гомозигот. В молоке и моче коров с этим генотипом зарегистрирована увеличенная концентрация оротовой кислоты [2, 3, 6] .
Аутосомная рецессивная мутация BC (bovine citrullinaemia) приводит к дефициту аргининосукцинат-синтазы - цитрулинемии. Цитрулинемия является наследственным нарушением хода цикла синтеза мочевины, причиной которого является дефицит аргининосукцинат-синтазы, ЕС 6.3.4.5. [4]. Этот метаболический недостаток был идентифицирован
первоначально только у человека. В настоящее время известно, что он встречается также у молочного скота Австралии. Это аутосомный рецессивный признак, проявляющийся гипераммониемией, вызванной разрывом в цикле синтеза мочевины [2, 3, 8, 6].
В связи с этим, исследования, посвященные выявлению мутаций в генах, связанных с важными характеристиками продуктивности у крупного рогатого скота, являются актуальными.
Материал и методика исследований. Для проведения исследований было отобрано 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан.
Для проведения ДНК -диагностики у крупного рогатого скота были отобраны пробы крови. Кровь, полученную у быков-производителей, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. ДНК из крови выделяли комбинированным щелочным способом.
Анализ локуса гена UMPS (uridine monophosphate synthase) у крупного рогатого скота. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,25 мМ dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймера DUMPS-F: 5/-GCAAATGGCTGAAGAACATT CTG-3/, 0,5 мкМ праймера DUPMS-R: 5/-GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT-3/,
сконструированных R.D. Shanks & J.L. Robinson (1990) для амплификации специфичного ПЦР-продукта длиной 108 bp, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:
x1: 94 0С - 4 мин; x40: 94 0С - 5 сек, 58 0С - 5 сек, 72 0С - 5 сек; x1: 72 0С - 5 мин; хранение: 4 0С.
Для идентификации DUMPS-мутации 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции AmaS7I в 1xбуфере «W» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.
Анализ локуса гена ASS (arginosuccinate synthetase) у крупного рогатого скота. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,25 мМ dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймера BC-F: 5/-GTGTTCATTGAGGACATC-3/, 0,5 мкМ праймера BC-R: 5/-
CCGTGAGACACATACTTG-3/, сконструированных (J.A. Dennis et al., 1989) для амплификации специфичного ПЦР-продукта длиной 176 bp, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:
x1:94 0С - 4 мин; x40: 94 0С - 10 сек, 60 0С - 10 сек, 72 0С - 10 сек; x1:72 0С - 5 мин; хранение: 4 0С.
Для идентификации BC-мутации 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции BmelSI в ^буфере «О» фирмы СибЭнзим
(Россия) при 37 0С течение ночи.
Детекция. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 4% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в ^ТВЕ буфере.
После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам ПЦР-ПДРФ.
Результаты собственных исследований. Для оценки качества работы ПЦР-протокола по идентификации у крупного рогатого скота мутации в UMPS-гене, были протестированы праймеры DUMPS-F: 5/-GCAAATGGCTG-AAGAACATTCTG-3/ и DUPMS-R: 5/-
GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT-3/, сконструированные R.D. Shanks & J.L. Robinson (1990), по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ-анализа.
Праймеры DUMPS-F+DUPMS-R инициируют амплификацию локуса UMPS-гена крупного рогатого скота длиной 108 bp. AmaSZI-ПДРФ-профиль здоровых животных = 51/36/21 bp (генотип +/+) (рис. 1), больных DUMPS-синдромом животных = 87/21 bp (генотип -/-), а животных-носителей DUMPS-мутации = 87/51/36/21 bp (генотип +/-).
Ml 23 4 567 8 9 10 11
300 bp-^-200 Ьр-*-
100 Ьр-^-
Рис. 1. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ-анализа ПМРБ- гена с праймерами БиМР8-Р+БиРМ8-К и эндонуклеазным расщеплением
Лша871
Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 Ьр (СибЭнзим); 1-10) генотип +/+ (51/36/21 Ьр); 11) ПЦР-продукт локуса ЦМР^-гена (108 Ьр).
При изучение полиморфизма ПМРБ-гена среди чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей не выявлено ни одного животного с генотипами +/- и -/-.
Для оценки качества работы известного протокола генотипирования крупного рогатого скота по Л^-гену были протестированы праймеры
BC-F: 5/-GTGTTCATTGAGGACATC-3/ и BC-R: 5/-
CCGTGAGACACATACTTG-3/, сконструированные J.A. Dennis et al. (1989), по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ-анализа.
Праймеры BC-F+BC-R инициируют амплификацию локуса ASS-гена крупного рогатого скота длиной 176 bp. BmelSI-ПДРФ-профиль здоровых животных = 98/78 bp (генотип +/+) (рис. 2), больных BC-синдромом животных = 176 bp (генотип -/-), а животных-носителей BC-мутации = 176/98/78 bp (генотип +/-).
М 1 2345678
300 Ьр -►
200 Ьр
100 Ьр
Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ-анализа ^SS-гена с праймерами BC-F+BC-R и эндонуклеазным расщеплением Bme18I Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим); 1-7) генотип +/+ (98/78 bp); 8) ПЦР-продукт локуса ^SS-гена (176 bp).
При изучении полиморфизма ^SS-гена среди чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей не выявлено ни одного животного с генотипами +/- и -/-.
Выводы. 1. Для эффективного выявления DUMPS- и BC-мутаций у крупного рогатого скота необходимо использовать методы ДНК-анализа; 2. При скрининге UMPS- и ^SS-генов среди чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей не выявлено в них аутосомных рецессивных мутаций.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Валиуллина, Э.Ф. Генотипирование чёрно-
пёстрого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и BLAD-мутации методами ДНК-технологии : автореф. дисс. канд. биол. наук: 06.02.01 / Валиуллина, Э.Ф. - Казань, 2012. - 22 с. 2. Глазко, В.И. Введение в ДНК-технологии / В.И. Глазко, И.М. Дунин, Г.В. Глазко, Л.А. Калашникова // М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2001. - 436 с. 3. Citek, J. Monitoring of the genetic health of cattle in the Czech Republic / J. Citek, V. Rehout, J. Hajkova, J. Pavkova // Vet. Medicina. - 51. - 2006. - 6: 333-339.
4. Dennis, J.A. Molecular definition of argininocuc-cinate synthetase deficiency // J.A. Dennis, P.J. Healy, A.L. Beaudet, W.E. O7Brien // Proc. of the Nat. Academy of Sci. of the United States of America. - 1989. - 86: 7947-7951.
5. Маріуца, А.Е. Популяційно-генетичні механізми адаптації і
розповсюдження напівлетальних рецесивних мутацій на прикладі BLAD у великої рогатої худоби: автореф. дис... канд. с.-г. наук: 03.00.15 / Маріуца Алла Ергашівна. - Кієв, 2005. - 22 с. 6. Meydan, H. Screening for bovine leukocyte adhesion deficiency, deficiency of uridine monophosphate synthase, complex vertebral malformation, bovine citrullinaemia, and factor XI deficiency in Holstein cows reared in Turkey / H. Meydan, M.A. Yildiz, J.S. Agerholm // Acta Vet. Scanlinavica. - 2010. - 52:56. P. 1-8. 7. Shanks, R.D. Deficiency of uridine monophosphate synthase among Holstein cattle / R.D. Shanks, J.L. Robinson // Cornell. Vet. - 1990. - V. 80. - P. 119-122. 8. Windsor, P. Inherited diseases of Australian Holstein-Friesian cattle / P. Windsor, J. Agerholm, // Aust. Vet. J. - 2009. - V. 87 (5). P. 193-199.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ DUMPS И BC У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ
Тюлькин С.В., Ахметов Т.М., Вафин Р.Р.
Резюме
В данной работе представлены результаты ДНК-анализа по идентификации генетических мутаций в UMPS- и ASS- генах у быков-производителей. У исследованных животных не выявлено аутосомных рецессивных мутаций.
IDENTIFICATION OF DUMPS AND BC GENETIC MUTATIONS IN STUD BULLS
Tjulkin S.V., Ahmetov T.M., Vafin R.R.
Summary
This paper presents the results of DNA analysis to identify genetic mutations in UMPS- and ASS-genes in stud bulls. In the examined animals didn’t were found autosomal recessive mutations.
УДК 591.462:599.32
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЧКИ БЕЛОЙ КРЫСЫ
Тяглова И.Ю. - к.б.н.,ст.преподаватель; Ситдиков Р.И. - д.в.н., профессор, зав.
кафедрой; *Каримова А.З. - к.б.н.
Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана
*АНО ВПО ЦС РУК ККИ (Филиал) тел.: (843) 238-25-79
Ключевые слова: почка, корковая зона, мозговая зона, почечное тельце, проксимальные, извитые и прямые канальцы.
