CC BY
10
Прагина Л.Л., Тушмалова Н.А., Н а -заренко О.А., Штрыгаль С.Ю., Ц е л к о -в а Н . В . 2003. Влияние аллоксановой модели сахарного диабета на поведение крыс // Междунар. междисциплинарный семинар "Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина". 13—25 янв., Высокие Татры, Словакия.
Прагина Л.Л., Тушмалова Н.А. 2000. Регуляция и коррекция условнорефлекторной памяти крыс с помощью препаратов природного происхождения — регуляторов генной активности // XXX Всерос. совещ. по проблемам высшей нервной деятельности. СПб. Т. 2.
Прихожан В.М. 1973. Поражение нервной системы при сахарном диабете. (Клиника, патогенез, лечение). М.
Тушмалова Н.А. 1994. Общебиологическая гипотеза механизмов влияния различных психотропных средств, оптимизирующих память // Журн. высш. нерв. деятельности. 44. № 1. 3—7.
Тушмалова Н.А. 1986. Исследование некоторых механизмов памяти у животных разного уровня филогенеза: Автореф. докт. дис. М.
Тушмалова Н.А., Маракуева И.В. 1986. Сравнительно-физиологическое исследование ультраструктурных аспектов памяти. М.
Поступила в редакцию 23.01.05
THE HYPERGLYCEMIA EFFECT ON RAT'S
OPEN FIELD BEHAVIOR AND THE PASSIVE AVOIDANCE REFLEX
L.L. Pragina, N.A. Tushmalova, O.A. Nazarenko,
C.J. Shtrygal, E.B. Voevodina, N. V. Tselkova
The effect of alloxan hyperglycemia (alloxan diabetic model) on rat's open field behavior and the passive avoidance reflex formation as a memory model was studied. Hyperglycemia decreases the level of horizontal component in spontaneous motion open field behavior in rats. The statistically significant hyperglycemia effect on conditioned reflex memory in rats was found only 60 days later after alloxan administration. To thoroughly analyze the effect of alloxan hyperglycemia the special method of quantitative evaluation was developed to access the depth of memory trace (the consolidation index).
УДК 612.111
ХРОНИЗАЦИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА
И НАРУШЕНИЯ В СИСТЕМАХ ГЕМОСТАЗА У КРЫС
ПОСЛЕ ОПЕРАЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОСКАЛЬПЕЛЕЙ
Л.В. Лютова, М.А. Карабасова, Т.А. Шубина, О.А. Мынбаев, Г.В. Андреенко
(кафедра человека и животных)
Послеоперационные осложнения в виде тромбозов, кровотечений, спайкообразования обусловлены в значительной степени воспалительным процессом и связанным с ним нарушением функций многих систем организма (Савельев, 1999; Rosendall, 1999). В последние годы ведется поиск новых подходов к проведению операций с целью ограничения очага воспаления и уменьшения трав-матизации. Уже разработаны и применяются лазерные, ультразвуковые и электрохирургические скальпели, значительно ее снижающие ^реМет et al., 2002).
Задачей настоящего исследования является изучение характера воспалительного процесса и состояния систем гемостаза у крыс после хирургического вмешательства на маточных рогах с применением электроскальпелей c коагулирующим эффектом.
Материалы и методы
Работа была выполнена на половозрелых самках крыс линии Вистар весом 180—200 г. Всего в работе было использовано 170 животных. Опе-
4 ВМУ, биология, № 2
рации проводили на маточных рогах под гексана-ловым наркозом (100 мг/кг массы животного). В асептических условиях по средней линии живота делали разрез длиной 1,5—2 см, используя одну из энергий — термическую (монополярный и биполярный электрохирургический скальпель) или волновую (гармонический скальпель фирмы Ultra Cisijn Harmonic Scalpel System). Однонаправленные реакции на повреждение позволили объединить их в одну группу. Маточные рога (МР) выводили в рану и одним из скальпелей делали разрез в поперечном направлении, рассекая се-розно-мышечный слой в области дна рогов, не вскрывая их полости. Целостность МР восстанавливали наложением узловых швов через все слои проленом 6/0, а затем послойно непрерывным швом закрывали рану передней брюшной стенки — брюшину, апоневроз и мышцы вместе. Кожу зашивали отдельно проленом 4/0 фирмы Jonson & Jonson.
На 1, 7, 15, 21 и 45-е сутки после операции из v. jugularis брали кровь с 3,8%-м цитратом натрия в соотношении 9:1, после чего животных эв-таназировали. У них брали перитонеальную жидкость (ПЖ) и биоптаты тканей маточных рогов и брюшины из области шва. Для определения локальной фибринолитической активности гистохимическим методом ткани замораживали при —30°, а для проведения макроскопических и гистологических исследований фиксировали в формалине Ван Гизон. В плазме, полученной после центрифугирования образцов крови при 2000 об/мин в течение 10 мин, определяли фибринолитическую активность эуглобулиновой фракции по времени лизиса ее сгустка, активность плазмина и активатора плазминогена, суммарную антиактиватор-ную активность, концентрацию фибриногена (Методы..., 1981), время рекальцификации, показатели тромбоэластограммы, записанной на тромбоэласто-графе "Hellige".
В ПЖ определяли те же показатели, что и в плазме крови. Исследования проводили, добавляя к донорской плазме ПЖ в соотношении 1:1. Клеточный состав ПЖ изучали с использованием светового микроскопа "Leika".
В качестве контроля брали образцы крови, ПЖ, ткани МР и брюшины неоперированных крыс.
Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия "t" Стьюдента.
Результаты и обсуждение
У животных, прооперированных с помощью электроскальпелей с коагулирующим эффектом в ранние сроки (1—7 дней) были отмечены характерные для острой воспалительной реакции изменения клеточного состава ПЖ. На 1—7-е сут-
ки наблюдали увеличение содержания полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), которое сохранялось до конца эксперимента. Пики концентрации эозинофилов отмечали на 1 и 15-е сутки, лимфоциты снижались с 1-го послеоперационного дня. С 21-го по 45-й день клеточный состав свидетельствовал о хронизации процесса.
Максимум моноцитов приходился на 7-й день. Колебания уровня этих клеток в последующие дни статистически недостоверны. Снижение количества макрофагов было максимальным в первый день, сохранилось к 21-му дню. Нормализация отмечалась к 45-му дню (рис. 1).
Макроскопическое исследование операционного поля выявило на 7-е сутки резко выраженную клеточную инфильтрацию. На 15-е сутки маточные рога представляли собой конгломерат из ме-зосальпинкса, сальника, петель кишок. Гистологическое исследование показало наличие сильной воспалительной реакции с захватом всей стенки маточного рога по типу рассеянной нейтрофиль-ной и лимфоцитарной инфильтрации. На 45-е сутки в области операционной раны отмечался выраженный сосудистый рисунок. Вся поверхность маточных рогов покрыта спайками. На отдельных
Рис. 1. Изменение клеточного состава перитонеальной жидкости (ПЖ) при хроническом воспалении. ЭФ — эозинофилы, ПМЯЛ — полиморфно-ядерные лейкоциты, Лц — лимфоциты, Мц — моноциты, МФ — макрофаги; * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** — р < 0,001 по сравнению с исходными значениями
yчacткax мышeчный cлoй пpeдcтaвлeн pyбцoвoй ткaнью c нeбoльшим cкoплeниeм гигaнтcкиx Kne-ток инopoдныx тeл. Гиcтoлoгичecкoe иccлeдoвa-нта oпpeдeлилo xaoтичнoe нaпpaвлeниe мышeчныx вoлoкoн c мнoгoчиcлeнными cocyдaми paзнoгo кя-либpa. Boкpyг инoгдa вcтpeчaлacь гpaнyлoмaтoз-нaя peaкция в видe oчaгoв cкoплeния гиcтиoци-тoв и лимфoцитoв. Ha нapyжнoй пoвepxнocти o6-paзoвaлиcь cпaйки c элeмeнтaми coeдинитeльнoй ткяни.
Пpи изyчeнии нeкoтopыx пoкaзaтeлeй гeмo-кoaгyляции и фибpинoлизa в плaзмe кpoви oœ-pиpoвaнныx живoтныx быто oбнapyжeнo, чтo вpe-мя лизиca эyглoбyлинoвoй фpaкции yвeличилocь нa 7-e cyraM в 4,3 paзa, 21-e — в 3,2 paзa, a к 45-му дню точти cooтвeтcтвoвaлo нopмe. Aê^mc^ aктивaтopa плaзминoгeнa та 1-e cyr-ки вoзpacтaлa в 2 paзa и coxpaнялacь та тя-кoм ypoвнe дo танця экcпepимeнтa (pиc. 2). Ak-тивнocть плaзминa пaдaлa нa 1-e cyra^ пocлe oпepaции в 3 paзa и нe вoccтaнaвливaлacь к 45-м cyra^.
Aнтиaктивaтopнaя aктивнocть дocтoвepнo вoз-pacтaлa ня 1 и 7-e cyrKH и coxpaнялacь нa этом ypoвнe в пocлeдyющиe cpoки нaблюдeния. Уpo-вeнь фибpинoгeнa yвeличивaлcя та 1—7-e cyтки пoчти в 3 paзa, no и к 45-му дню oн был вдвoe вышe нopмы фта. 3). Bpeмя peкaльцификaции та-знaчитeльнo yдлинялocь тoлькo ня 1 cyrKH. Ш-
Pиc. 2. Измeнeниe вpeмeни лизиca эyглoбyлинoвoгo CTycrKa (BЛЭC) и aктивaтopнoй aктивнocти в плaзмe и ПЖ ^и xpoничecкoм вocпaлeнии. ПЖ — пepитoнeaльнaя жидкocть; * — p < 0,05 , ** — p < 0,01, *** — p < 0,001 та cpaвнe-нию c иcxoдными знaчeниями
Pиc. 3. ^j^ere^e coдepжaния фибpинoгeнa в плaзмe и ПЖ ^и xpoничecкoм вocпaлeнии. * — p < 0,05, ** — p < 0,01 та cpaвнeнию c иcxoдными знaчeниями
кaзaтeли тpoмбoэлacтoгpaммы лишь в oтдeльныe cpoKH cвидeтeльcтвoвaли o cлaбoй гипoкoaгyля-ции. B ПЖ тaкжe выявилиcь выpaжeнныe измeнe-ния пoкaзaтeлeй cocтoяния изyчaeмыx cиcтeм. TaK, вpeмя лизиca эyглoбyлинoвoй фpaкции в пepвыe cyтки yдлинилocь в 3 paзa пo cpaвнeнию c ^xoä-ным ypoвнeм. Topмoжeниe фибpинoлизa coxpara-лocь дo 45 cyтoк и быго дocтoвepнo. Пoвышeниe aктивaтopнoй aктивнocти oтмeчaлocь в пepвыe cyr-ки и ocтaвaлocь выcoким дo кoнцa экcпepимeн-тя (pиc. 2). Плaзминoвaя a^mmc^ peзкo падята ня 1-e cyrKH и нe вoccтaнaвливaлacь. ^o^xoä^ ли cинycoидaльныe кoлeбaния aктиaктивaтopнoй aктивнocти. Фибpинoгeн, нe oпpeдeляeмый в ПЖ кoнтpoльныx живoтныx, в 1-e cyтки oбнapyжи-вaлcя y 50% кpыc oпытнoй гpyппы, a ня 7-e — y 2|3 (pиc. 3). К танцу экcпepимeнтa фибpинoгeн нe oпpeдeлялcя в ПЖ ни y oämra œ^orao-гo. Пpи пpoвeдeнии мeтoдoв peкaльцификaции и тpoмбoэлacтoгpaфии c ПЖ иш^кт^и кpыc ciyc-тoк та oбpaзoвывaлcя. У oпытныx живoтныx c 1 m 15-e cyтки moto oпepaции cгycтoк фopмиpo-вaлcя, xoтя вpeмя peкaльцификaции cocтaвлялo oт 180 äo 3б2 ceK.
Aктивaтopнaя aктивнocть ткяни мaтoчныx po-гoв пaдaлa ня 1-e cyтки и coxpaнялacь ня низкoм ypoвнe äo 45 cyTOK. B ткaняx бpюшины, нaпpoтив, oтмeчaлacь тeндeнция к вoзpacтaнию aктивнocти ткaнeвoгo aктивaтopa плaзминoгeнa (pиc. 4).
TaK™ oбpaзoм, oпepaции c иcпoльзoвaниeм cкaльпeлeй, oбecпeчивaющиx кoaгyляцию кpaeв oœ-paциoннoй paны, пpивoдят к xpoничecкoмy вoc-пaлитeльнoмy пpoцeccy, o чeм cвидeтeльcтвyeт ди-нямикя измeнeния клeтoчнoгo cocтaвa ПЖ, дaнныe мaкpocкoпичecкиx и микpocкoпичecкиx нaблюдe-ний, cocтoяниe ^CTe! гeмocтaзa. Б^Iлo oбнapyжeнo зaпaздывaниe пpoцeccoв aдaптивнoй peгeнepaции paны. Извecтнo, что у^итанта нeйтpoфильнoй фязы инфильтpaции мoжeт cпocoбcтвoвaть xpoни-
5 BMУ, биoлoгия, № 2
140 -| 120 -100 -80 -60 -40 20
I
0
I
I
ПМР
■ брюшина
I
а
Рис. 4. Изменение активности тканевого активатора плазмино-гена (ТАП) в ткани МР и брюшины при хроническом воспалении. МР — маточные рога
зации воспаления. Следовательно, в случае, если ПМЯЛ своевременно не будут замещены макрофагами, фибропластический процесс запоздает, усилится распад ткани и возникнет реальная угроза формирования абсцесса (Воспаление..., 1995). Возможно, что в нашем эксперименте хрониза-ции процесса способствовало образование особого струпа, за счет которого развитие хемотаксическо-го ответа было нарушено и нейтрофилы поступали в очаг в количестве, неадекватном повреждению. Результаты наших исследований свидетельствовали о том, что повреждение с коагуляцией краев раны не завершалось ее заживлением в течение 45 дней, а шел длительный хронический воспалительный процесс, который менял состояние как локального, так и общего фибринолиза. Сразу после повреждения ткани из тучных клеток, тромбоцитов, нейтрофилов, макрофагов выделяются вещества, повышающие проницаемость сосудистого эндотелия. Через межклеточное пространство начинается проникновение жидкой части крови, эритроцитов, компонентов сыворотки и фибриногена. Присутствие последнего в ПЖ в большом количестве в течение 2 недель свидетельствует о сильной воспалительной реакции. В нашем эксперименте через неделю после операции этот белок регистрировался в ПЖ 2/3 животных и исчезал после 21 суток. Появление богатого фибриногеном эксудата сразу после проведенной операции играет положительную роль, способствуя ранозаживлению, обеспечивая гемостаз и герметизацию раны (Не11еЬгекеге й а1., 2000). В дальнейшем фибриновые отложения должны лизирова-ться, в противном случае начинается образование фибриновых спаек. У животных опытной группы плотность спаек составила 3,01 балла по шкале Мынбаева (Мынбаев и др., 1998). Наблюдаемая нами тенденция к увеличению активности ТАП в ткани брюшины согласуется с данными других авторов (Баккиш е! а1., 1996), обнаруживших увеличение фибринолитической активности брюшины через 3 мес. после хирургической травмы, которое коррелировало с возрастанием количества продук-
тов деградации фибрина. Резкое снижение активности ТАП в маточных рогах уже с первых суток эксперимента, возможно, связано с механическим разрушением клеток и снижением в них синтеза этого фермента. Кроме того, как известно из литературы (Воспаление..., 1995 ), на синтез и секрецию ТАП клетками брюшины и миомет-рия влияют различные цитокины воспаления. Так, ФНО, ИЛ-1 стимулируют синтез ПАИ-1 и, возможно, именно их высокий уровень и способствует снижению активности ТАП ткани МР при хронизации воспалительного процесса. Изменения в плазме крови начинаются с появления в очаге воспаления тромбина, обладающего как прокоагу-лянтными, так и антикоагулянтными свойствами (Струкова, 1999). Это приводит к выпадению фибрина. Мы отмечали достоверное увеличение уровня фибриногена с 1-го дня и до конца эксперимента. Он является белком острой фазы и его синтез усиливается в печени под действием ИЛ-6 уже в первые часы воспаления. Сохранение высокого уровня этого белка до конца эксперимента свидетельствует о незавершенности этого процесса. С первого дня отмечается нарастание активности ТАП как в плазме, так и в ПЖ. В первые часы это может быть обусловлено выбросом ТАП из эндотелиальных клеток (Бше18 е! а1., 1997, Но1ш-ёаЫ е! а1., 1997). Поддержание в крови высокой активности фермента в течение длительного времени может быть связано со стимуляцией тромбином его секреции, а также с параллельной активацией урокиназного активатора плазминогена (УАП). Рецептор последнего обнаруживается не только на поверхности эндотелия, но и на моноцитах, нейтрофилах и других клетках. Синтез УАП усиливается под влиянием тех же цитоки-нов. УАП катализирует превращение плазмино-гена в плазмин, а последний активирует переход латентного трансформирующего фактора в активный, который, воздействуя на эндотелиальные клетки, вызывает синтез и секрецию ПАИ-1 (Наг-Ьег! е! а1., 1998). Следовательно, высокая актива-торная активность провоцирует рост ингибитор-ной, что и было обнаружено в нашем опыте. При высокой активаторной активности общая фибри-нолитическая была снижена на фоне нарастающей антиактиваторной активности. Кратковременное падение ее на 21-й день эксперимента могло быть связано с белком витронектином, присутствующим в экстрацеллюлярном матриксе, способным связывать ПАИ и стабилизировать его активность. В нашем эксперименте изменения в системах свертывания и фибринолиза происходили параллельно в плазме и ПЖ и свидетельствовали о снижении фибринолитической активности: продолжительное удлинение ВЛЭС в плазме и ПЖ, снижение плазминовой или плазми-ноподобной активностей в ПЖ на 1 сутки, а в
7
45
ДО
сутки
плазме — в течение всего эксперимента. Низкая активность ТАП в ткани МР, его высокая активность в плазме и некоторое возрастание анти-активаторной активности не предотвращали, а возможно, способствовали образованию фиброзных сращений, локализованных в области повреждения. Таким образом, повреждение с коагуляцией краев раны провоцировало развитие хронического воспалительного процесса в организме и депрессию фибринолиза, несмотря на высокую актива-торную активность. Применение обычного скальпеля при аналогичных операциях, проведенных на-
ми, вызывало острую воспалительную реакцию, не переходящую в хронический процесс и завершавшуюся репарацией (Шубина, 2001). В наших экспериментах не использовались какие-либо антибактериальные средства, только соблюдалась стерильность. Учитывая полученные нами результаты, следует рекомендовать при проведении операций применение современных антибактериальных средств, предотвращающих хронизацию естественного послеоперационного процесса воспаления.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Воспаление. 1995 / Под ред. В.В. Серова, В.С. Пау-кова. М. C. 52—57.
Методы исследования фибринолитической системы крови. 1981 / Под ред. Г.В. Андреенко. 132 с.
Мынбаев О.А., Лютова Л.В., Рубль-ова К.И., Карабасова М.А., Андреенко Г.В. 1998. Влияние гиалуронидазы на активность тканевого активатора плазминогена маточных рогов и стенок влагалища и на образование спаек в брюшной полости у крыс // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 4. 11—15.
Савельев В.С. 1999. Послеоперационные венозные тромбоэмболические осложнения: неизбежность или контролируемая опасность? // Хирургия. № 6. 60—63.
Струкова С.М. 1999. Тромбин-регулятор межклеточных взаимодействий при повреждении сосудов // Сб. мат-лов науч. конф. "Атеротромбоз — проблема современности". М. С. 113—114.
Шубина Т.А. 2001. Локальный и общий фиб-ринолиз при воспалительных процессах, индуцированных хирургической травмой: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. C. 135.
Bakkum E.A., Emeis J.J., Dalmeijer R.A., van Blutterswijk С.A., Trimbos J.B., Trim-bos-Kemper T.C.M. 1996. Long-term analysis of peritoneal plasminogen activator activity and adhesion for-
mation after surgical trauma in the rat model // J. Fertil. Steril. 66. 1018-1022.
Emeis J.J., van der Eijnden - Schrau-wen Y., van der Hoogen C.M., de Priester W., Lupu F. 1997. An endothelial storage granule for tissue type plasminogen activator //J. Cell. Biol. 139. 245-256.
Herbert J.M., Carmeliet P. 1998. Urokinase mediates bFGF-induced vascular smooth muscle cell migration under the control of TGFß // Fibrinol. and Prote-ol. 2. (Suppl. 2). 89-96.
Hellebrekers B.W.J., Trimbos - Kemper G.S.M., Bakkum E.A., Trimbos J.B.M.Z., Declerck P. J., Kooistra T., Emeis J.J. 2000. Short-term effect of surgical trauma on rat peritoneal fibrino-lytic activity and its role in adhesion formation // J. Thromb. Haemost. 84. 876-881.
Holmdahl L., Falkenberg M., Ivars-son M., Risberg B. 1997. Plasminogen activators and inhibitors in peritoneal tissue // APM IS. N 105. (Suppl. 1). 25-31.
Rosendaal F.R. 1999. Risk factor venous throm-botic disease // J. Thromb. Haemost. 82. N 2. 610-617.
Siperstein A.E., Berber E., Morkoy-u n E . 2002 The Use of the Harmonic Scalpel us Conventional Knot Tying for Vessel Ligation in Thyroid Surgery // Arch. Surg. Feb. 137. 137-142.
üocTynma B peaaKöHM 12.01.05
CHRONIZATION OF INFLAMMATORY PROCESS AND THE DISTURBANCE IN HEMOSTASIS SYSTEMS AFTER THE SURGICAL OPERATIONS WITH USE OF ELECTROSCALPELS IN RATS
L.V. Lyutova, M.A. Karabasova, T.A. Shubina, O.A. Mynbaev, G.V. Andreenko
Inflammatory reaction, some parameters of the hemostasis system and fibrinolysis in blood plasma, peritoneal fluid (PF) and tissiue of operated organs after operations on rat's uterine horns with electroscalpels posessed coagulated effects was studied. It was shown that in experimental animals acute inflammatory reaction transited in to the chronic form. The high level of fibrino-gen was in plasma during all time of supervision and as distined from control appears in PF. There were seem disturbances in system of hemocoagulation and long depression of fibrinolysis in spite of high activity tissue plasminogen activator.
6 ВМУ, биология, № 2
