CC BY
0
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ УДК 543
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ГИДРОФИЛЬНЫХ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ПОРИСТОМ ГРАФИТИРОВАННОМ УГЛЕРОДНОМ СОРБЕНТЕ ИУРЕЯСАЯБ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВОДНОГО РАСТВОРА МУРАВЬИНОЙ КИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ
Кирилл Сергеевич Гутенев, Михаил Александрович Статкус, Григорий Ильич Цизин
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра аналитической химии
Автор, ответственный за переписку: Григорий Ильич Цизин, [email protected]
Аннотация. Изучена возможность элюирования гидрофильных фосфороргани-ческих веществ с использованием градиента концентрации муравьиной кислоты в водной подвижной фазе на пористом графитированном углеродном сорбенте НурегсагЬ. Аналиты детектировали с помощью моноквадрупольного масс-спектрометра. Удерживание аналитов изучали, варьируя состав подвижной фазы перед инжекцией раствора образца. Показано, что влияние ступенчатого градиентного элюирования на удерживание аналитов в первую очередь обусловлено состоянием поверхности сорбента, а не элюирующей способностью фаз. Наиболее вероятным является вытеснительный «квазиионообменный» механизм удерживания аналитов.
Ключевые слова: жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, пористый графитированный углеродный сорбент НурегсагЬ, алкилфосфоновые кислоты, фосфорорганические пестициды
Б01: 10.55959/М8Ш579-9384-2-2024-65-5-388-396
Финансирование. Статья выполнена в рамках работ по теме госзадания № АААА-А21-121011990021-7 «Создание функциональных материалов, высокоэффективных способов и средств химического анализа для мониторинга и прогнозирования состояния окружающей среды, перехода к высокопродуктивному и экологически чистому агро- и аквахозяйству, персонализированной медицине, технологиям здоровьесбережения, создания безопасных и качественных продуктов питания, лекарственных препаратов».
Для цитирования: Гутенев К.С., Статкус М.А., Цизин Г.И. Хроматографическое разделение гидрофильных фосфорорганических веществ на пористом графитированном углеродном сорбенте НурегсагЬ с использованием водного раствора муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2024. Т. 65. № 5. С. 388-396.
© Гутенев К.С., Статкус М.А., Цизин Г.И., 2024
ORIGINAL ARTICLE
CHROMATOGRAPHIC SEPARATION OF HYDROPHILIC ORGANOPHOSPHATES ON A POROUS GRAPHITIZED CARBON SORBENT HYPERCARB USING AN AQUEOUS SOLUTION OF FORMIC ACID AS A MOBILE PHASE
Kirill S. Gutenev, Michail A. Statkus, Grigory I. Tsizin
Lomonosov Moscow State University, Faculty of Chemistry, Department of Analytical Chemistry
Corresponding author: Grigory I. Tsizin, [email protected]
Abstract. The possibility of elution of hydrophilic organophosphorus substances using the concentration gradient of formic acid in an aqueous mobile phase on a porous graphitized carbon sorbent Hypercarb has been studied. The analytes were detected using a mono quadrupole mass spectrometer. To study the retention of analytes, the composition of the mobile phase was varied before injection of the sample solution. It is shown that the effect of stepwise gradient elution on the retention of analytes is primarily due to the state of the sorbent surface, rather than the elution ability of the phases, and that the displacing "quasi-ion exchange" mechanism of retention of analytes is the most likely.
Keywords: liquid chromatography, mass spectrometry, porous graphitized carbon sorbent Hypercarb, alkylphosphonic acids, organophosphate pesticides
Financial Support. The article was carried out as part of the work on the topic of state task No. AAAAA21-121011990021-7 "Creation of functional materials, highly effective methods and means of chemical analysis for monitoring and forecasting the state of the environment, transition to highly productive and environmentally friendly agro- and aquatic farming, personalized medicine, health-saving technologies, creation of safe and high-quality food, medicinal drugs".
For citation: Gutenev K.S., Statkus M.A., Tsizin G.I. Chromatographic Separation оf Hydrophilic Organophosphates оn а Porous Graphitized Carbon Sorbent Hypercarb Using аn Aqueous Solution оf Formic Acid аs а Mobile Phase // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. 2024. T. 65. № 5. S. 388-396.
Гидрофильные фосфорорганические соединения представляют собой обширную группу веществ, многие из которых встречаются в повседневной жизни. Фосфорорганические гербициды и инсектициды, такие как глифо-сат (Gly) и глюфосинат (Glu), ацефат (ACE) и ометоат (Ome), могут проявлять себя как канцерогены, а метамидофос (Meth) и монокрото-фос (Mon) токсичны и запрещены во многих странах. К гидрофильным фосфорорганическим соединениям относятся также продукты трансформации нервно-паралитических отравляющих веществ (ОВ) - алкилфосфоновые (АФК) и О-алкилалкилфосфоновые кислоты (О-ААФК). Метилфосфоновая кислота (MPA) и ее гомологи этил- (EPA) и пропилфосфоновые (PPA) кислоты, а также этил- (EtMPA), изопрпил- (iPrMPA) и изобутилметилфосфоновые (iBuMPA) кисло-
ты служат маркерами применения химического оружия. Из-за высокой опасности и токсичности указанных выше пестицидов и ОВ, продуктами разложения которых являются АФК и О-ААФК, необходима разработка простых, эффективных и надежных методов их определения в объектах окружающей среды, пищевых продуктах, биомедицинских и других объектах.
Часто встречающийся метод определения указанных аналитов - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которую применяют в обращенно-фазовом (ОФ), ионном и Ы1Е1С вариантах [1-3]. Следует отметить, что эти вещества имеют низкое поглощение в УФ и видимой области, они также не способны к флуоресценции, поэтому их селективное определение можно осуществлять исключительно с использованием масс-спектрометра.
Несмотря на то, что при определении этим методом не требуется дериватизации аналитов, большие проблемы возникают из-за их высокой полярности - эти вещества слабо удерживаются на большинстве коммерчески доступных фаз. Кроме того, в ионной хроматографии определение с МС-детектированием возможно только после трудоемкой процедуры по уменьшению влияния сопутствующих ионов. Для определения указанных аналитов также часто применяют метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) [4]. Однако из-за низкой летучести АФК, О-ААФК и некоторых пестицидов перед ГХ-анализом необходимо провести трудоемкую и длительную стадию дериватизации.
Известно, что сорбент Hypercarb удерживает полярные соединения значительно лучше, чем силикагель С18 в ОФ ВЭЖХ, поэтому в предыдущих работах нашей группы [5-8] предложено использовать Hypercarb в качестве неподвижной фазы для ВЭЖХ разделения / определения гидрофильных органических соединений. Представленный в работах [5, 7, 8] способ увеличения времени удерживания гидрофильных фосфорорганических аналитов с применением промывки колонки Hypercarb водой до инжек-ции образца использовали и в настоящей работе, при этом расширен круг определяемых веществ и проведено более детальное изучение механизма удерживания гидрофильных фосфороргани-ческих соединений на пористом графитирован-ном углеродном сорбенте Hypercarb с помощью указанного способа промывки колонки водой. Использование этого приема в будущем может быть крайне полезным и позволит добиться лучшего разделения сложных смесей гидрофильных аналитов.
Экспериментальная часть
Реагенты. Для приготовления растворов и элюентов использовали деионизованную воду (18,2 МОмсм), полученную на установке «Millipore Simplicity» («Millipore», США), а также раствор муравьиной кислоты в воде (50 мас.%) чистоты «for HPLC» («Sigma-Aldrich», США).
Использовали исходные растворы MPA, EPA, PPA, EtMPA, iPrMPA, iBuMPA, Gly, Glu, Ace, Meth, Ome и Mon с концентрацией 1 мг/мл. Структуры и характеристики аналитов приведены в табл. 1. Все вещества были произведены фирмой «Sigma-Aldrich» (США). Рабочие растворы смеси анали-тов с концентрацией 70 мкг/мл готовили путем по-
следовательного разбавления исходных растворов. Исходные и рабочие растворы хранили в темноте при +4 °С.
Аппаратура. Использовали жидкостной хромато-масс-спектрометр фирмы «Shimadzu», состоящий из следующих модулей: квадруполь-ный масс-спектрометр «LCMS-2020» с ионизацией аналитов электрораспылением (ESI), два ВЭЖХ-насоса «LC-20AD», дегазатор «DGU-20A», контроллер «CBM-20A», автосамплер «SIL-20AC» и термостат «CT0-20AC». Для детектирования аналитов использовали параметры МС-детектора и интерфейса «Shimadzu LCMS-2020», рекомендованные производителем оборудования: время регистрации интенсивности на заданном m/z (SIM event time) 0,2 с, напряжение на детекторе (detector voltage) 1,55 кВ; напряжение на интерфейсе (interface voltage) 4,5 кВ; напряжение линии десольвата-ции (DL voltage) 0 В; температура линии де-сольватации (DL temperature) +250 °C; поток газа-распылителя (nebulizing gas flow) 1,5 л/мин; температура блока нагревателя (heat block) +400 °C; поток газа-осушителя (drying gas flow) 15 л/мин. Аналиты определяли в режиме регистрации отрицательных положительных ионов. Параметры m/z регистрации ионов аналитов для масс-спектрометра представлены в табл. 1. Хроматографические параметры рассчитывали в программе LabSolutions. Для ВЭЖХ-разделения использовали колонку с сорбентом Hypercarb («Thermo Scientific», США) (3,2x2,1 мм, 5 мкм). Водородный показатель измеряли на рН-метре «Эконикс Эксперт рН».
Условия хроматографического определения. В качестве элюента (фаза В) использовали 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты, а в качестве промывочного раствора (фаза А) - де-ионизованную воду, а также воду, насыщенную СО2, и 0,5 мМ водный раствор NH3, насыщенный СО2. Скорость потока элюента 0,2 мл/мин, температура колонки 30 °С.
Результаты и обсуждение
Предложенный ранее в нашей группе прием предварительного уравновешивания колонки водой с последующим ступенчатым градиентом концентрации муравьиной кислоты при разделении аналитов на пористом графитированном углеродном сорбенте позволяет добиться улучшения формы пиков аналитов: уменьшения ширины пиков и, соответственно, увеличения высоты пиков. Основываясь на предыдущих
Т а б л и ц а 1
Структуры аналитов, их параметры липофильности (Log P) и выбранные для масс-спектрометрической
регистрации ионов аналитов величины m/z
Аналит
Структура с обозначением рК функциональных групп
m/z
MPA
-95
EPA
-109
PPA
-123
EtMPA
-123
iPrMPA
-137
iBuMPA
-151
Gly
-168
Окончание табл. 1
Аналит Структура с обозначением рКа функциональных групп m/z Log P
в1и -180 -5,0
Асе +184 -0,8
МеШ +143 -0,9
Оте +214 -0,9
Моп +224 -0,2
результатах [8], где ступенчатый градиент показал лучшее разделение карбоновых кислот по сравнению с изократическим режимом и линейным градиентом, выбраны два режима элюи-рования: изократический режим (для сравнения) и режим ступенчатого градиента. В изо-кратическом режиме элюирующей фазой была 100%-я фаза В. В свою очередь, ступенчатый градиент состоял из двух участков: до инжек-ции аналитов пропускали 100% фазы А, после инжекции - 100% фазы В, где момент времени с инжекцией образца и одновременной сменой подвижной фазы принимали за 0-ю минуту. Пример условий изократического и ступенчатого градиентных хроматографических разделений с
промывкой колонки до инжекции в течение 5 мин описан в табл. 2. Установлено, что в случае ступенчатого градиента важную роль играет продолжительность промывки фазой А колонки до инжекции. По нашему мнению, при промывке колонки до инжекции чистой водой (фаза А) аналитов в течение менее 5 мин на поверхности сорбента остается некоторое количество формиат-ионов и удерживание аналитов близко к изократическому режиму, в котором промывку не проводили вовсе. Поэтому минимально необходимое время уравновешивания колонки до инжекции образца составило 5 мин (рис. 1). Дальнейшее увеличение длительности этой стадии мало влияло на время удерживания аналитов.
Т а б л и ц а 2
Условия изократического и ступенчатого градиентного хроматографического разделения с промывкой
колонки до инжекции
Стадия Промывка колонки, 5-я - 0-я минута Инжекция образца, 0-я минута Окончание анализа, 25-я минута
Изократический режим 100% фазы В 100% фазы В 100% фазы В
Ступенчатый градиент 100% фазы А 100% фазы В 100% фазы В
Т а б л и ц а 3
Разрешение некоторых пар карбоновых кислот в зависимости от выбранного режима элюирования
Пара аналитов Разрешение (Rs)
состав промывочного раствора
без промывки Н2О* насыщенный CO2* насыщенный CO2, NH3 * водный
MPA/EPA 0,82 1,09 0,54 0,43
PPA/EtMPA 1,32 1,24 0,84 1,00
Gly/Glu 0,50 0,34 0,33 0,32
*Длительность промывки составляла 6 мин.
Для модельной смеси аналитов при элюиро-вании в изократическом режиме 0,1%-й муравьиной кислотой не удалось добиться полного разделения следующих пар веществ: МРА/ЕРА и Асе/01у/01и. Более того, оказалось, что ступенчатый градиент муравьиной кислоты при промывке чистой водой до инжекции оказывает влияние на удерживание фосфоновых кислот, глифосата и глюфосината в одинаковой мере.
Из-за этого время удерживания аналитов изменяется в большую сторону с улучшением разделения пары МРА/ЕРА по сравнению с изократи-ческим режимом (табл. 3). При этом на примере фосфорорганических пестицидов было показано, что градиентное элюирование муравьиной кислотой в значительной мере влияет на характер удерживания аналитов кислотной природы, которые в нейтральной среде находятся в форме анионов,
Рис. 1 Зависимость фактора удерживания аналитов (к') от длительности уравновешивания колонки (tw) водой. Разделяли кислоты: а - MPA (1), EPA (2), PPA (3), EtMPA (4), iPrMPA (5); б - пестициды: Gly (7), Glu (8), Ace (9), Meth (10), Ome (11 ), Mon (12). Саналит = 70 мкг/мл, инжектировали 3 мкл
раствора
что можно объяснить слабыми анионообмен-ными свойствами сорбента ИурегсагЬ. В свою очередь, у фосфорсодержащих гидрофильных аналитов (ацефата, метамидофоса, омеоата и монокротофоса) отсутствуют гидроксильные группы (табл. 1), и в условиях наших экспериментов они находятся в виде катионов из-за содержащихся аминогрупп в составе молекул. На значение их времени удерживания градиент муравьиной кислоты оказал незначительное влияние и время удерживания для этих пестицидов не зависело ни от длительности промывки, ни от состава промывочной фазы А. Это может свидетельствовать о том, что указанные катионы не удерживаются на поверхности сорбента за счет ионных сил, а их разделение происходит по ОФ-механизму. При этом хроматографические пики метами-дофоса и монокротофоса имели крайне низкую интенсивность относительно остальных аналитов, наблюдали значительное искажение симметрии как в изократическом режиме, так и ступенчатом градиенте, поэтому они не приведены на рис. 2.
Предполагается, что особенности удерживания аналитов кислотной природы на сорбенте ИурегсагЬ в этих условиях можно объяснить гипотетическим вытеснительным «квазиионообменным» механизмом элюирова-ния аналитов и влиянием состава подвижной фазы на состояние поверхности сорбента. Так, по нашему мнению, при использовании растворов муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы формиат-ионы частично остаются на поверхности сорбента из-за его слабых анионообменных свойств. В процессе промывки водой происходит вымывание формиат-ио-нов с поверхности ИурегсагЬ, а элюирующая способность чистой воды оказывается значительно хуже, что приводит к увеличению удерживания аналитов кислотной природы. Поэтому для изучения влияния состава промывочной подвижной фазы на значение времени выхода гидрофильных фосфорорганических веществ были выбраны анионы (гидрокарбонат- и гидроксид-ион), способные заместить формиат ионы на поверхности сорбента. Гидрокарбонат-ионы получали растворением в воде углекислого газа. Эксперименты включали следующие подвижные фазы для промывки колонки: Н2О (рН 6,2), Н2О, насыщенная СО2 (рН 3,9), Н2О, насыщенная СО2 с последующим добавлением водного раствора НИ3 (рН 8,3). Следует отметить, что в ступенчатом гра-
диентном режиме все аналиты с кислотными группами изначально находятся в ионной форме за счет того, что значение рИ фазы А близко к нейтральному. По мере увеличения кон -центрации муравьиной кислоты и уменьшения рН подвижной фазы до 2,7 происходит переход аналитов в молекулярную форму, а глифосата и глюфосината - в цвиттер-ионную форму. Поэтому при применении ступенчатого градиента механизм удерживания аналитов на начальном этапе разделения в основном ионный, а по мере перехода аналитов в молекулярную форму происходит переход к ОФ-механизму. Из-за этого влияние ступенчатого градиента на удерживание аналитов осуществляется в разной степени, за счет чего происходит улучшение разрешения исследуемых веществ. Кроме того, при использовании ступенчатого градиента ширина большинства пиков уменьшалась, увеличивалась их интенсивность, что также влияло на разрешение хроматографических пиков.
Для промывочных фаз «вода без добавок» и «вода, насыщенная СО2», наблюдали схожие закономерности в изменении времени удерживания для кислотных аналитов. Типичные зависимости факторов удерживания этих аналитов от времени промывки колонки до инжекции представлены на рис. 3. В случае промывки колонки водой, насыщенной СО2 (рН 3,9), подавляющая часть добавки находится в молекулярной форме (И2СО3) и слабо взаимодействует с положительно заряженной поверхностью сорбента. Поэтому в этих двух вариантах промывок муравьиная кислота, оставшаяся с предыдущего эксперимента, вымывается с колонки и при последующем разделении органических кислот ана-литы сильнее удерживаются на поверхности. Добавление в промывочную подвижную фазу модификатора в виде гидрокарбоната (ИСО3~) при рН 8,3 приводило к тому, что время удерживания аналитов не изменялось по сравнению с изократическим режимом. Вероятно, в случае промывки раствором с гидрокарбонатом в щелочной среде происходит замещение остатков формиата с поверхности сорбента на гидрокарбонат, а промывочная фаза имеет схожую элюи-рующую силу с 0,1%-й муравьиной кислотой, за счет чего значения времени удерживания аналитов остаются практически одинаковыми.
Таким образом, показано, что сорбция гидрофильных фосфорорганических веществ с кислотными группами вероятнее всего происходит по вытеснительному «квази-ионообмен-ному механизму».
29 ООО
У 25 000
в
S s
Sá 21 ООО H
17 000
1, 2,7,8
5 10
t. мин
200
12 ООО
t, мин
Рис. 2. Хроматограмма, полученная при разделении карбоновых кислот на колонке с пористым гра-фитированным углеродом. Разделяли кислоты: MPA (1), EPA (2), PPA (3), EtMPA (4), iPrMPA (5) и iBuMPA (6); пестициды: Gly (7), Glu (8), Ace (9), Ome (10); а - хроматограмма по полному ионному току аналитов 1-8; б - наложение хроматограмм аналитов 1, 2, 7, 8; в - наложение хрома-тограмм аналитов 9, 10. Саналит = 70 мкг/мл, инжектировали 3 мкл раствора
Рис. 3 Зависимости фактора удерживания MPA (а) и Glu (б) от длительности «уравновешивания» колонки водой без
добавок (1), водой, насыщенной СО2 (2), водой, насыщенной СО2 и 5 мМ NH3 водный раствор (3)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Desoubries C., Chapuis-Hugon F., Bossee A., Pichon V. // J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2012. Vol. 900. asani D., Kumar R., Srivastava R.K.,
2. Gupta A.K., Dubey D.K. // J. Chromatogr. A. 2007. Vol. 1161. P. 198.
3. Hamelin E.I., Schulze N.D., Shaner R.L. // Anal. Bioanal. Chem. 2014. Vol. 406. P. 5195.
4. Riches J., Morton I., Read R.W., Black R.M. // J. Chromatogr. B. 2005. Vol. 816. P. 251.
5. Гончарова Е.Н., Статкус М.А., Цизин Г.И., Зо-лотов Ю.А. // Журн. аналит. химии. 2020. Т. 75. № 4. С. 291 [Goncharova E.N., Statkus M.A., Tsizin G.I., Zolotov Yu.A. // J. Anal. Chem. 2020. Vol. 75.
№ 4. P. 423] (DOI: 10.1134/S1061934820040036).
6. Goncharova E.N., Statkus M.A., Nesterenko P.N., Tsysin G.I., Zolotov Yu.A. // J. Chromatogr. A. 2021. Vol. 1653. P. 462420 (DOI: 10.1016/j.chro-ma.2021.462420).
7. Гончарова Е.Н., Семенова И.П., Статкус М.А., Цизин Г.И. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2: Химия. 2017. Т. 58. № 6. С. 275 [Goncharova E.N., Semenova I.P., Statkus M.A., Tsysin G.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2017. Vol. 72. № 6. P. 255] (DOI: 10.3103/S0027131417060050).
8. Гутенев К.С., Статкус М.А., Цизин Г.И. // Журн. аналит. химии. 2022. Т. 77. № 10. С. 923.
Информация об авторах
Кирилл Сергеевич Гутенев - аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]);
Михаил Александрович Статкус - вед. науч. сотр. химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук ([email protected]);
Григорий Ильич Цизин - ст. науч. сотр. химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук, профессор ([email protected]).
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Соблюдение этических стандартов
В данной работе отсутствуют исследования человека и животных.
Статья поступила в редакцию 08.09.2023 Одобрена после рецензирования 10.10.2023 Принята к публикации 21.02.2024
