CC BY
0
НАУЧНАЯ САТЬЯ УДК 582.284; 57.083.1
ХРАНЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР РЕДКИХ ВИДОВ МАКРОМИЦЕТОВ В СВЯЗИ С ПЕРСПЕКТИВАМИ РЕИНТРОДУКЦИИ И ТРАНСЛОКАЦИИ
Никита Сергеевич Комиссаров, Максим Юрьевич Дьяков, Лидия Васильевна Гарибова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет
Автор, ответственный за переписку: Никита Сергеевич Комиссаров, macoloams@gmail.com
Аннотация. В работе обсуждаются проблемы сохранения редких видов макроми-цетов в культуре. Составлена коллекция чистых культур восьми видов этой группы. Проведен сравнительный анализ методов хранения чистых культур. Исследованы как классические, так и модифицированные протоколы хранения. Особое внимание уделяется использованию различных криопротекторных соединений и субстратов-носителей при криохранении чистых культур макромицетов. Показана необходимость индивидуального подбора и оптимизации методов хранения чистых культур для различных видов макромицетов.
Ключевые слова: макромицеты, криохранение, криопротекторы, реинтродук-ция, транслокация
Б01: 10.55959/М8Ш027-1403-ББ-2024-129-2-54-66
Благодарности. Выражаем искреннюю благодарность вед. науч. сотр. БИН РАН, канд. биол. наук Надежде Васильевне Псурцевой за помощь в ознакомлении с основными методами хранения чистых культур макромицетов, доценту кафедры биологии и технологий живых систем Тульского государственного педагогического университета имени Л.Н. Толстого, канд. биол. наук Татьяне Юрьевне Светашевой за ценные комментарии и предложения, а также коллективу НОШ «Космос» за предоставление необходимого оборудования. Работа выполнена с использованием оборудования, приобретенного за счет средств Программы развития Московского университета.
Финансирование. Исследование выполнено в рамках научных проектов государственного задания МГУ № 121032300081-7 и № 121032300079-4.
Для цитирования: Комиссаров Н.С., Дьяков М.Ю., Гарибова Л.В. Хранение чистых культур редких видов макромицетов в связи с перспективами реин-тродукции и транслокации // Бюл. МОИП. Отд. биол. 2024. Т. 129. Вып. 2. С.54-66.
© Комиссаров Н.С., Дьяков М.Ю., Гарибова Л.В., 2024
ORIGINAL ARTICLE
STORAGE OF PURE CULTURES OF RARE MACROMYCETE SPECIES IN CONNECTION WITH THE PROSPECTS OF REINTRODUCTION AND TRANSLOCATION
Nikita S. Komissarov, Maxim Yu. Dyakov, Lydia V. Garibova
Lomonosov Moscow State University, Biology Faculty Corresponding author: Nikita S. Komissarov, macoloams@gmail.com
Abstract. The work discusses the problems of conservaton of rare macromycetes in culture. A collection of pure cultures of 8 representatives of this group has been compiled. A comparative analysis of pure culture storage methods was carried out. Both classic and modified storage protocols have been studied. Particular attention is paid to the use of various cryoprotective compounds and carrier substrates in the cryopreservation of pure cultures of macromycetes. The need for individual selection and optimization of methods for storing pure cultures for various types of macromycetes is shown.
Key words: macromycetes, cryostorage, cryoprotectors, reintroduction, translocation
Acknowledgements. We express our sincere gratitude to Ved. nauch. sotr. BIN RAN kand. Biol. sciences Nadezhda Vasilyevna Psurtseva for help in familiarizing with the basic methods of storing pure cultures of macromycetes, Associate Professor of the Department of Biology and Technologies of Living Systems of the Tula State Pedagogical University named after L.N. Tolstoy, PhD. Biol. sciences Tatyana Yurievna Svetasheva for valuable comments and suggestions, as well as the staff of the NOSH "Cosmos" for providing the necessary equipment. The work was performed using equipment purchased from the funds of the Moscow University Development Program.
Financial Support. The study was carried out as part of state assigned scientific projects of Moscow State University No. 121032300081-7 and No. 121032300079-4.
For citation: Komissarov N.S., Dyakov M.Yu., Garibova L.V. Storage of pure cultures of rare macromycete species in connection with the prospects of reintroduction and translocation // Byul. MOIP. Otd. biol. 2024. T. 129. Vyp. 2. S. 54-66.
Глобальный рост населения Земли, урбанизация и индустриализация развивающихся стран, а также экономически отсталых регионов крупных государств привели к стремительному сокращению площади ненарушенных природных территорий и, как следствие, к снижению видового разнообразия и исчезновению многих видов организмов (Cardinale et al., 2012). Традиционно основное внимание общественности и специалистов по понятным причинам уделялось охране редких видов позвоночных животных и высших растений. Но в последнее время все большее значение придается представителям «менее заметных» таксонов: насекомым, моллюскам, ракообразным, водорослям, а также грибам. В настоящей работе речь пойдет о грибах, формирующих макроскопические (обыч-
но заметные невооруженным глазом) плодовые тела, и поэтому называемых макромицетами.
Макромицеты - нетаксономическая группа организмов, которая включает виды грибов, формирующх макроскопические плодовые тела. К ним относят ряд видов из отделов Basidiomycota и Ascomycota. Именно представители этой группы грибов рассматриваются в качестве возможных объектов охраны и мониторинга состояния популяций.
В последнее десятилетие наблюдается повышенное внимание к проблемам охраны редких макромицетов. Так, в 2009 г. в списке IUCN (The Global Red List) макромицеты были представлены лишь одним видом - Pleurotus nebrodensis (Inzenga) Quel. (Dahlberg et al., 2010). В 2022 г. в этом списке насчитывалось
уже 639 видов грибов, находящихся под угрозой исчезновения (Pasailiuk et al., 2022). Аналогичная ситуация наблюдается и в Российской Федерации. В Красную книгу РФ, изданную в 2008 г. (Красная книга Российской Федерации, 2008), входили 24 вида грибов; в настоящее время в список грибов готовящегося нового издания Красной книги РФ включены 42 вида (Минприроды, 2023). В последнем издании Красной книги Ленинградской области (Красная книга Ленинградской области, 2018), одного из самых изученных регионов РФ насчитывается уже 108 видов макромицетов (Гельтман, 2018), по сравнению с 38 видами в прошлом издании (Красная книга природы Ленинградской области, 2000). Увеличиваются списки редких макромицетов и в других региональных Красных книгах.
Важная особенность макромицетов заключается в том, что вегетативное тело (мицелий) многих представителей этой группы можно культивировать в искусственных условиях на соответствующих питательных средах. Это дает возможность использовать широкий спектр методов сохранения видов ex situ (хранение чистых культур в лабораторных условиях, создание резерватов редких видов в ботанических садах, парках и природных экосистемах).
Тема сохранения чистых культур редких ма-кромицетов разными методами криоконсер-вации в целях дальнейшей реинтродукции затрагивалась во многих работах (Белова и др., 2005; Широких, Широких, 2021; Larson, 1978; Honegger, 2003; Kaul, 2007).
В настоящее время имеется ряд примеров практического подхода к проведению реинтро-дукции редких макромицетов. В лесных экосистемах на юге Финляндии были проведены работы по инокуляции валежных еловых бревен мицелием 7 видов афиллофороидных макроми-цетов, занесенных в Красную книгу и редких в данном регионе. Все инокулированные виды закрепились в виде мицелия, а три из семи видов образовали плодовые тела (Abrego et al., 2016).
На территории Цинхай-Тибетского нагорья в Китае был организован микологический заповедник Мацутакэ. На базе этого заповедника была развернута программа «Один район, один гербарий и пять банков», в рамках которой создана уникальная коллекция чистых культур ма-кромицетов заповедника. Одна из главных задач этой программы (в частности, коллекции культур) - сохранение живого материала редких грибов в целях дальнейшей реинтродукции (Li, Wang, 2019).
В Южной Корее разработана методика культивирования склероциев Polyporus umbellatus (Pers.) Fr. (syn. Grifola umbellata (Pers.) Pilát, трутовик зонтичный) совместно с ризоморфами Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm. (опенок осенний, медовый). P. umbellatus включен в списки редких видов многих государств. В Российской Федерации этот вид входит в списки ряда региональных Красных книг. Разработанная методика позволяет как культивировать склероции в коммерческих целях, так и успешно реинтродуци-ровать этот вид в природные экосистемы (Choi et al., 2003).
Польские микологи провели интересный эксперимент по реинтродукции Fomitopsis officinalis (Vill.) Bondartsev & Singer (лиственич-ная губка), патогенного трутового гриба как на живых старовозрастных лиственницах, так и на лиственичных бревнах (Pi^tka, Grzywacz, 2005). Результаты демонстрируют возможность создавать резерваты этого редкого во многих регионах вида в природных экосистемах на мертвой древесине.
Большая программа по изучению ряда ксило-трофных макромицетов из списков редких видов проведена в Великобритании. Создана коллекция культур и подробно изучена биология Hericium cirrhatum (Pers.) Nikol., Hericium coralloides (Scop.) Pers., Hericium erinaceus (Bull.) Pers. и Buglossoporus quercinus (Schrad.) Kotl. & Pouzar (Boddy et al., 2004). Для H. coralloides показаны способы культивирования на древесных бревнах в природных экосистемах, а также разработан метод заражения живых деревьев бука, поскольку этот макромицет является факультативным патогеном (Crockatt, 2008).
Одним из самых передовых научных учреждений в подходах к сохранению и реинтродукции редких макромицетов является коллекция чистых культур института ботаники имени Н.Г. Хо-лодного НАН Украины в Киеве. В коллекции собраны практически все возможные чистые культуры краснокнижных видов макромицетов Украины. Более того, проведена основательная работа по изучению биологии этих видов: морфоло-го-культуральные и молекулярно-генетические характеристики, физиология, механизмы плодо-образования и т.п. (Bisko et al., 2018). Эксперименты по реинтродукции осуществляли на Украине в Национальном природном парке «Гуцуль-щина». Работы проводили с тремя видами редких макромицетов, которые занесены в Красную книгу Украины: Clathrus archeri (Berk.) Dring (syn. Anthurus archeri (Berk.) E. Fisch., Антурус
Арчера), Sparassis laminosa Fr. (Спарассис пластинчатый) и Hericium coralloides (Scop.) Pers. (Ежовик коралловидный) (Pasaylyuk et al., 2018; Pasailiuk et al., 2022). На основании полученных результатов Clathrus archeri исключен из Красной книги Украины (Domashlinets, 2021).
В настоящее время работы по сохранению и реинтродукции редких макромицетов ведутся и отечественными микологами. В РФ лидер в этой области - коллекция чистых культур макромицетов Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН, которая содержит культуры более 500 видов макромицетов (Psurtseva et al., 2007). Одна из важнейших задач этой коллекции состоит в сохранении редких и находящихся под угрозой исчезновения видов (Белова и др., 2005).
Цель настоящей работы - подбор и оптимизация методов хранения чистых культур редких макромицетов с перспективами дальнейшей ре-интродукции и транслокации.
Материалы и методы Изоляция чистых культур
Сбор плодовых тел макромицетов для последующего выделения чистых культур проводили на территории Московской обл., Уссурийского государственного природного заповедника ДВО
РАН (с сопредельными территориями), Кавказского государственного природного биосферного заповедника им. Х.Г. Шапошникова (с сопредельными территориями).
Изоляцию чистых культур осуществляли тканевым методом из плодовых тел сразу после их сбора в полевых условиях на агаризованные среды (сусло-агар и среда № 337 ATCC с добавлением антибиотика цефотаксима в концентрации 0,75 мг/мл).
В результате была создана коллекция чистых культур, в которую вошли штаммы восьми редких видов макромицетов, в том числе включенных в Красную книгу РФ и региональные Красные книги (табл. 1).
Определение видовой принадлежности
Видовую идентификацию проводили по морфологии плодовых тел, морфолого-культураль-ным признакам и молекулярно-генетическим данным (Бухало, 1988).
Выделение ДНК исследуемых штаммов проводили по модифицированному протоколу с применением CTAB-буфера (Lee et al., 1988). Для амплификации региона ITS использовали праймеры ITS1F и ITS4. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Bio-Rad
Т а б л и ц а 1
Коллекция штаммов чистых культур макромицетов
Штамм Вид Место сбора Субстрат Охранный статус
MR40 Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. Московская обл. древесина Betula sp. Красная книга РФ и 62 региональные Красные книги
MR57 Hericium coralloides (Scop.) Pers. Московская обл. древесина лиственной породы 61 региональная Красная книга
FE53 Hericium erinaceus (Bull.) Pers. Приморский край древесина лиственной породы 10 региональных Красных книг
RA09 Hericium flagellum (Scop.) Pers. Республика Адыгея древесина лиственной породы Красная книга РФ и 5 региональных Красных книг
FE20 Lentinula edodes (Berk.) Pegler Приморский край Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb. 1 региональная Красная книга (Красная книга Приморского края)
FE34 Mycoleptodonoides vassiljevae Nikol. Приморский край древесина лиственной породы Не включе н в список охраняемых видов
MR61 Sarcosoma globosum (Schmidel) Casp. Московская обл. почва в смешанном лесу Красная книга РФ и 24 региональные Красные книги
FE30 Sparassis latifolia Y.C. Dai & Zheng Wang Приморский край Pinus koraiensis Siebold & Zucc. Красная книга Еврейской Автономной области
T100 Thermal Cycler». Для очистки полученной ДНК использовали набор «Cleanup Standard» («Евроген», Москва). Секвенирование ДНК осуществляли с помощью праймеров ITS1F и ITS4. Видовую идентификацию проводили, используя генетическую базу данных NCBI и пакет программ MEGA и ClustalX.
Методы хранения чистых культур
Для оценки влияния различных методов длительного хранения чистых культур на биологию развития редких видов макромицетов отобранные штаммы рабочей коллекции были заложены на хранение с помощью ряда методов, включающих как классические протоколы хранения, применяемые в большинстве мировых коллекций чистых культур, так и модифицированные.
Серийный пересев на агаризованных средах проводили с использованием питательной среды № 337 АТСС. После периода инкубации при +25 °С биоматериал штаммов переносили в холодильную камеру (+5 °С). Пересев на стерильные носители проводили каждые 2 месяца.
Хранение под слоем дистиллированной воды осуществляли путем вырезания блоков из слоя агаризованной среды № 337 с развившимся на ней мицелием исследуемого штамма с дальнейшим помещением в стерильные полипропиленовые криопробирки, покрытием стерильной дистиллированной водой и переносом в холодильные камеры (+5 °С).
Биоматериал штаммов находился также на хранении в замороженном состоянии (криохра-нение). Криохранение осуществляли согласно нижеуказанным протоколам. Для помещения на хранение методом «агаровых блоков» использовали модификацию протокола, включающую заморозку блоков агаризованной среды с развившимся мицелием в криопробирках под слоем раствора криопротекторного соединения (Hwang, 1960; Hwang, 1966; Hwang, 1968). «Перлитовый протокол» подразумевает заморозку перлита, выполняющего роль субстрата-носителя, покрытого слоем жидкой питательной среды с добавлением криопротекторных соединений, с развившимся на нем мицелием исследуемых штаммов (Homolka et al., 2001; Homolka et al., 2007). Мы использовали авторскую модификацию указанного протокола, которая включает осуществление рыхления субстрата на 7-е сут. инкубации и внесение дополнительного объема жидкой питательной фракции, содержащей
криопротекторные соединения. «Зерновой протокол» включает использование зернового мицелия - термически обработанных зерен пшеницы (Triticum aestivum L.) с развившимся на них мицелием, помещенных под слой раствора криопротектора (Colauto et al., 2011; Berteli et al., 2022).
В работе использовали следующие криопро-текторные соединения (КПС): 10%-е растворы глицерина и трегалозы, а также смесь этих соединений в 10%-й концентрации. В целях заморозки биоматериала использовали контейнеры для контролируемой заморозки Nalgene Mr. Frosty Cryo («Thermo Scientific»). Все опыты проводили в трехкратной повторности. Продолжительность хранения составляла 6 мес. По окончании периода хранения было проведено изъятие культур, посев на агаризованные среды, изучение морфо-лого-культуральных характеристик и эндоглюка-назной активности.
Морфолого-культуральные характеристики штаммов видов макромицетов
Для изучения влияния хранения на морфоло-го-культуральные характеристики штаммов ма-кромицетов проводили изучение внешней морфологии колоний (Бухало, 1988), микроморфологии, радиальной скорости роста и ростового коэффициента до и после хранения.
Анализ микроморфологии включал микро-скопирование колоний с поиском следующих структур: пряжки, анаморфы, удлиненные, укороченные, вздутые или гантелевидные клетки мицелия (Камзолкина, Богданов, 2017). Изучение микроморфологических характеристик чистых культур проводили стандартными методами световой микроскопии (микроскоп «Leica DM500»). Исследование диаметров колоний проводили на агаризованной среде № 337 на 7-е сут. с начала инкубации измерением радиуса колонии в трех горизонтальных измерениях, вычисляя затем среднее значение, проводили подсчет ростового коэффициента (Бухало, 1988).
Статистическая обработка данных
Все лабораторные эксперименты проводили в пятикратной повторности. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excel. Проводили дисперсионный анализ данных с последующей оценкой достоверности различий, согласно методу Тью -ки (уровень вероятности P = 0,95) (Tukey, 1949).
В приведенных далее таблицах (табл. 2-4) даны значения коэффициента вариации.
Результаты
Хранение на агаризованных средах. После окончания срока хранения наблюдалось снижение показателей скорости роста колоний и ростового коэффициента по сравнению с данными контрольных вариантов, полученными вскоре после выделения чистых культур до закладки на хранение. Наиболее существенно это проявляется у культур Hericium flagellum и Sarcosoma globosum. Примечательно, что отдельные штаммы (Lentinula edodes, Sparassis latifolia) показали лишь небольшие изменения (табл. 2). Вместе с тем пиковые значения скорости роста и их выход на плато в ряде случаев сдвигались по сравнению с контролем на 1-2 суток.
Хранение под слоем дистиллированной воды. Все штаммы сохранили свою жизнеспособность при использовании этого протокола. Большинство штаммов показали сохранение морфолого-культуральных характеристик на уровне, близком к контролю, кроме Hericium flagellum и Sarcosoma globosum, у колоний которых наблюдали снижение радиальной скорости роста.
Криохранение по протоколу с использованием агаровых блоков. Отмечено сильное снижение значений скорости роста и ростовых коэффициентов для колоний всех образцов и повторностей. Для большинства штаммов, заложенных по этому протоколу, наилучшие показатели скорости роста и ростовых коэффициентов были показаны для вариантов эксперимента
с использованием 10%-го раствора трегалозы и смеси криопротекторов. При этом большая часть штаммов демонстрировала более сильное развитие стелющегося по поверхности субстрата мицелия, в то время как воздушный мицелий формировался сравнительно слабо. Штаммы Hericium flagellum и Sparassis latifolia не смогли сохранить свою жизнеспособность ни в одном из вариантов закладки с разными криопротек-торами, в то время как биоматериал Ganoderma lucidum не сохранился при хранении с использованием 10%-го раствора глицерина.
После хранения согласно «перлитовому протоколу» для большинства штаммов чистых культур наблюдали значительное снижение значений средней скорости роста и ростового коэффициента колоний, а в случае Ganoderma lucidum наблюдали обратный эффект. Биоматериал Sparassis latifolia утратил жизнеспособность во всех вариантах закладки. Как и в предыдущем опыте, было отмечено, что использование 10%-го раствора глицерина, повсеместно применяемого как криопротекторное соединение, приводит к потере жизнеспособности биоматериала штаммов Ganoderma lucidum, Hericium flagellum. Биоматериал штамма Lentinula edodes, показавший хорошие ростовые характеристики во всех вариантах хранения по методу агаровых блоков, утратил свою жизнеспособность при хранении по «перлитовому протоколу». Применение 10%-го раствора трегалозы в качестве КПС позволило сохранить жизнеспособность большинства исследуемых штаммов, в частности, биоматериал штаммов вида Hericium flagellum смог пережить хранение только в этом
Т а б л и ц а 2
Диаметр колоний исследуемых штаммов до закладки на хранение и после периода серийных пересевов
Штамм Вид Средний диаметр колоний, мм (контроль) Средний диаметр колоний, мм (опыт)
MR40 Ganoderma lucidum 55,3±1,65 50,2±0,93
MR57 Hericium coralloides 71,2±2,1 67±1,34
FE53 Hericium erinaceus 61,6±1,2 55,3±1,1
RA09 Hericium flagellum 22,7±0,68 15,3±0,61
FE20 Lentinula edodes 49,4±0,98 48,5±1,2
FE34 Mycoleptodonoides vassiljevae 80±1,6 76±1,44
MR61 Sarcosoma globosum 43,6±1,39 33,5±1,17
FE30 Sparassis latifolia 3,5±0,03 3,2±0,04
Т а б л и ц а 3
Диаметр колоний исследуемых штаммов до закладки на хранение и после периода хранения под слоем
дистиллированной воды
Штамм Вид Средний диаметр колоний, мм (контроль) Средний диаметр колоний, мм (опыт)
MR40 Ganoderma lucidum 55,3±1,65 54,3±1,46
MR57 Hericium coralloides 71,2±2,1 70,1±1,75
FE53 Hericium erinaceus 61,6±1,2 60,5±1,27
RA09 Hericium flagellum 22,7±0,68 16,7±0,31
FE20 Lentinula edodes 49,4±0,98 48,9±1,02
FE34 Mycoleptodonoides vassiljevae 80±1,6 78±1,56
MR61 Sarcosoma globosum 43,6±1,39 38,7±0,81
FE30 Sparassis latifolia 3,5±0,03 3,4±0,06
Т а б л и ц а 4
Диаметр колоний исследуемых штаммов до закладки на криохранение и после периода криохранения по
методу агаровых блоков
Штамм Вид Средний диаметр колоний, мм (контроль) Средний диаметр колоний, мм (опыт)
10%-й раствор глицерина 10%-й раствор трегалозы Смесь 10%-х растворов
MR40 Ganoderma lucidum 55,3±1,65 - 39,2±0,78 33±0,56
MR57 Hericium coralloides 71,2±2,1 40,5±0,48 43±1,1 31±0,62
FE53 Hericium erinaceus 61,6±1,2 34,5±0,72 32±0,89 23,5±0,73
RA09 Hericium flagellum 22,7±0,68 - - -
FE20 Lentinula edodes 49,4±0,98 27,75±0,33 35,5±0,88 34,5±0,93
FE34 Mycoleptodonoides vassiljevae 80±1,6 62±1,48 66,6±1,39 71±1,77
MR61 Sarcosoma globosum 43,6±1,39 25,5±0,3 25,2±0,23 25,7±0,21
FE30 Sparassis latifolia 3,5±0,03 - - -
варианте эксперимента. Использование смеси растворов глицерина и трегалозы показало интересные результаты. Для штаммов ряда видов, таких как Ganoderma lucidum, Lentinula edodes и Mycoleptodonoides vassiljevae, использование смеси криопротекторов оказало наиболее положительное влияние в виде наименьшего снижения значений скорости роста и ростового коэффициента.
Криохранение по «зерновому протоколу» показало наилучшие результаты, по сравнению с другими методами. Некоторые культуры (Mycoleptodonoides vassiljevae и Sarcosoma globosum) даже увеличили скорость роста по сравнению с контрольными значениями. Бо-
лее того, большинство штаммов, заложенных по «зерновому протоколу» хранения, продемонстрировало наибольшую толщину мице-лиальных гиф (за исключением штаммов видов Mycoleptodonoides vassiljevae, Sarcosoma globosum) и наибольшее число пряжек на мицелии (кроме штамма вида Ganoderma lucidum), в ряде случаев превышая контрольные значения.
При исследовании влияния хранения по «зерновому протоколу» на морфолого-культураль-ные характеристики чистых культур показано, что в случае Ganoderma lucidum число мице-лиальных пряжек у биоматериала, заложенного под слой смеси 10%-х растворов глицерина и трегалозы, превышает в два раза значения этого
показателя для мицелия, заложенного под слой 10%-го раствора трегалозы, и в три раза - для варианта с использованием 10%-го раствора глицерина.
Исключение составляли культуры Hericium flagellum и Sparassis latifolia, не сохранившиеся ни в одном из вариантов хранения по «зерновому протоколу».
Обсуждение
Основная задача настоящего исследования заключалась в подборе оптимальных методов хранения с учетом сохранения ростовой активности и морфолого-культуральных характеристик исследуемых видов. Рассмотрим, какие методы оказались оптимальными индивидуально для каждого вида, используемого в работе.
Штамм Ganoderma lucidum демонстрировал снижение значений скорости роста и в ряде случаев ростового коэффициента при хранении методом серийных пересевов и при криохранении согласно протоколу с использованием агаровых блоков. Биоматериал штамма не сохранил свою жизнеспособность при криохранении на агаровых блоках с использованием 10%-го раствора глицерина. В то же время колонии штамма показали повышение значений скорости роста и ростового коэффициента с усилением развития воздушного мицелия, увеличением толщины гиф, при криохранении по «перлитовому протоколу» (вариант опыта с использованием смеси криопротекторов) и по «зерновому протоколу» (в варианте с использованием 10%-го раствора
глицерина). Для хранения биоматериала этого штамма оптимальным оказалось использование методов хранения под слоем дистиллированной воды, а также по «зерновому» и «перлитовому» протоколам криохранения с использованием 10%-го раствора глицерина или смеси криопро-текторных соединений.
Штамм ИетШыт flagellum сохранял свою жизнеспособность только при хранении методом серийных пересевов, под слоем дистиллированной воды, а также при криохранении по «перлитовому протоколу» в варианте с использованием 10%-го раствора трегалозы. Во всех вариантах закладки, за исключением хранения под слоем дистиллированной воды, биоматериал штамма демонстрировал сильное снижение значений скорости роста и ростового коэффициента. Оптимальные методы хранения биоматериала этого штамма - хранение под слоем дистиллированной воды и по «перлитовому протоколу» с использованием 10%-го раствора трегалозы.
Штамм ИетШыт coralloides сохранил жизнеспособность при хранении согласно всем указанным протоколам, за исключением варианта «перлитового протокола» с использованием смеси КПС. Использование метода криохранения на агаровых блоках привело к сильному снижению значений скорости роста и ростового коэффициента, преобладанию стелющегося по поверхности среды поискового мицелия и слабому развитию воздушного мицелия. Наилучшие результаты показал биоматериал штамма, заложенный на хранение под слоем дистиллированной воды,
Т а б л и ц а 5
Диаметр колоний исследуемых штаммов до закладки на криохранение и после периода криохранения по
«перлитовому протоколу»
Штамм Вид Средний диаметр колоний, мм (контроль) Средний диаметр колоний, мм (опыт)
10%-й раствор глицерина 10%-й раствор трегалозы Смесь 10%-х растворов
MR40 Ganoderma lucidum 55,3±1,65 - 43,3±0,9 61,3±2,32
MR57 Hericium coralloides 71,2±2,1 64,2±2,11 62±1,42 -
FE53 Hericium erinaceus 61,6±1,2 48±1,06 33,3±0,86 34±0,91
RA09 Hericium flagellum 22,7±0,68 - 8,3±0,16 -
FE20 Lentinula edodes 49,4±0,98 - 17,8±0,32 22,3±0,71
FE34 Mycoleptodonoides vassiljevae 80±1,6 74±1,18 78,6±1,8 73±2,04
MR61 Sarcosoma globosum 43,6±1,39 34,3±0,61 35±0,87 34±0,68
FE30 Sparassis latifolia 3,5±0,03 - - -
а также на криохранение по «перлитовому» и «зерновому» протоколам с использованием 10%-го раствора глицерина и 10%-го раствора трегалозы соответственно.
Штамм Иеггешш еттаевш сохранил жизнеспособность при хранении согласно всем протоколам. Тем не менее, для вариантов опыта с использованием метода агаровых блоков и серийных пересевов наблюдали сильное снижение скорости роста и ростовых коэффициентов. Как и в случае Иеггсгыш coralloides, было отмечено сильное развитие поисковых гиф при слабом развитии воздушного мицелия, а плотность колоний была значительно ниже. Оптимальными способами хранения этого штамма, помимо хранения под слоем дистиллированной воды, являются способы с использованием «перлитового» и «зернового» протоколов с применением 10%-го раствора глицерина и 10%-го раствора трегалозы в качестве крио-протекторных соединений.
Штамм ЬепШы1а edodes, в отличие от большинства исследованных штаммов, не показал достоверного снижения значений ростовых характеристик при хранении методом серийных пересевов. При криохранении худшие результаты показаны для вариантов с использованием 10%-го раствора глицерина. В частности, при криохранении по «перлитовому протоколу» с использованием глицерина биоматериал Ь. edodes утратил свою жизнеспособность. Наиболее под-
ходящими методами хранения для этого штамма оказались методы хранения под слоем дистиллированной воды, по методу агаровых блоков и по «зерновому протоколу».
Штамм Mycoleptodonoides vassiljevae сохранил жизнеспособность во всех вариантах закладки по всем протоколам хранения и криохранения. Тем не менее, имело место снижение ростовых характеристик при хранении методом серийных пересевов и при криохранении методом агаровых блоков. В то же время для биоматериала штамма M. vassiljevae наблюдали повышение значений скорости роста и ростовых коэф -фициентов при хранении согласно «зерновому протоколу».
Штамм Sarcosoma globosum, как и большинство исследованных штаммов, демонстрировал снижение значений ростовых характеристик при хранении указанными методами. Наиболее сильное снижение наблюдали для вариантов закладки по методу агаровых блоков и серийными пересевами. Наиболее близкие к исходным значения ростовых характеристик наблюдали для биоматериала штамма, заложенного на хранение под слоем дистиллированной воды и на криохранение по «перлитовому» и «зерновому» протоколам с использованием 10%-го раствора трегалозы.
Штамм Sparassis latifolia, как и штамм Hericium flagellum, смог сохранить свою жизнеспособность только при хранении методами
Т а б л и ц а 6
Диаметр колоний исследуемых штаммов до закладки на криохранение и после периода криохранения по
«зерновому протоколу»
Штамм Вид Средний диаметр колоний, мм (контроль) Средний диаметр колоний, мм (опыт)
10%-й раствор глицерина 10%-й раствор трегалозы Смесь 10%-х растворов
MR40 Ganoderma lucidum 55,3±1,65 53±1,06 44,3±0,57 43,57±0,91
MR57 Hericium coralloides 71,2±2,1 60,5±1,27 64,6±1,48 62,3±1,43
FE53 Hericium erinaceus 61,6±1,2 33±0,49 53,8±1,07 49,2±1,37
RA09 Hericium flagellum 22,7±0,68 - - -
FE20 Lentinula edodes 49,4±0,98 13,67±0,23 30,5±0,43 23,5±0,39
FE34 Mycoleptodonoides vassiljevae 80±1,6 58,3±1,16 56,5±1,24 55,7±1,22
MR61 Sarcosoma globosum 43,6±1,39 34,3±0,58 38,5±0,92 36,5±0,47
FE30 Sparassis latifolia 3,5±0,03 - - -
Т а б л и ц а 7
Диаметр колоний исследуемых штаммов после периода хранения всеми исследуемыми методами
Штамм Вид Средний диаметр колоний, мм
К СП ДВ АБ ПП ЗП
MR40 Ganoderma lucidum 55,3±1,65 50,2±0,93 54,2±1,2 39,2±0,78 61,3±2,32 53±1,06
MR57 Hericium coralloides 71,2±2,1 67±1,34 68,5±1,4 43±1,1 64,2±2,11 64,6±1,48
FE53 Hericium erinaceus 61,6±1,2 55,3±1,1 58,7±1,11 34,5±0,72 48±1,06 53,8±1,07
RA09 Hericium flagellum 22,7±0,68 15,3±0,6 18,4±0,65 - 8,3±0,16 -
FE20 Lentinula edodes 49,4±0,98 48,5±1,2 49,1±1,1 35,5±0,88 22,3±0,71 30,5±0,43
FE34 Mycoleptodonoides vassiljevae 80±1,6 76±1,44 79±1,54 71±1,77 78,6±1,8 58,3±1,16
MR61 Sarcosoma globosum 43,6±1,39 33,5±1,17 39±1,32 25,7±0,21 35±0,87 38,5±0,92
FE30 Sparassis latifolia 3,5±0,03 3,2±0,04 3,2±0,04 - - -
О б о зн а ч е н и я: К - контроль, СП - серийные пересевы, ДВ - дистиллированная вода, АБ - метод агаровых блоков, 1111 - «перлитовый протокол», ЗП - «зерновой протокол».
серийных пересевов и под слоем дистиллированной воды. При этом снижения значений ростовых характеристик не наблюдалось. То, что биоматериал штамма вида, являющегося облигатным паразитом древесных растений, не сохранил свою жизнеспособность при отрицательной температуре, можно объяснить использованием неоптимальных питательных сред, отсутствием необходимых специфических соединений в питательной среде, которые могли бы повысить устойчивость биоматериала к стрессовым условиям.
Уменьшение значений скорости роста и ростовых коэффициентов исследуемых штаммов при хранении методами серийных пересевов может быть связано с использованием неоптимальных питательных сред, постепенным старением культуры или накоплением нежелательных мутаций. Стоит отметить, что контрольные значения скорости роста были получены для первых пассажей культур макромицетов, содержащих остатки накопленных в природных экосистемах микроэлементов, которые могут отсутствовать в составе питательных сред.
Наблюдаемое снижение ростовых характеристик при криохранении можно объяснить стрессовыми факторами заморозки. Утрата жизнеспособности при криохранении с разными криопротекторами может быть связана с индивидуальными характеристиками штаммов, для которых высокое содержание того
или иного криопротектора или их комбинаций может оказывать цитотоксичный эффект, как было в случае с Ganoderma lucidum, Hericium flagellum и Lentinula edodes, когда использование 10%-го раствора глицерина приводило к гибели биоматериала.
Увеличение скорости роста, связанное с сильным развитием стелющегося по поверхности субстрата мицелия (поисковых гиф) при снижении развития воздушного мицелия после периода хранения в замороженном состоянии может свидетельствовать о возможном переходе к R-стратегии, которая предполагает быстрое освоение большого объема субстрата как ответ на стрессовые условия окружающей среды. В то же время грибной мицелий способен использовать излишки трегалозы и глицерина в качестве дополнительного источника питания.
Стоит отметить, что биоматериал большинства исследуемых штаммов, заложенный по «зерновому протоколу» хранения чистых культур и сохранивший при этом свою жизнеспособность, продемонстрировал наибольшую толщину мицелиальных гиф и ростовые характеристики, наиболее близкие к контрольным значениям. Это обусловлено, вероятно, тем, что амилоза, амилопектин и их мономер глюкоза, которыми богат эндосперм зерен пшеницы, являются природными стабилизаторами, связывающими молекулы воды, играя роль
криопротекторных соединений. Использование разных криопротекторов показало, что для отобранных штаммов наиболее подходящими вариантами были те, что включали применение 10%-го раствора трегалозы и смеси 10%-х растворов гли -церина и трегалозы, в то время как используемый отдельно 10%-й раствор глицерина в ряде случаев приводил к утрате жизнеспособности.
В ходе исследования было показано, что для хранения чистых культур большинства изучаемых в проводимом эксперименте макромицетов наиболее эффективно использовать следующие протоколы: под слоем дистиллированной воды, «перлитовый» и «зерновой» протоколы криох-ранения. Использование протокола с дистиллированной водой позволило добиться сохранения жизнеспособности всех изучаемых штаммов при
незначительном снижении значений морфоло-го-культуральных характеристик. В табл. 5 приведены данные по величине диаметра колоний отобранных штаммов после изъятия с хранения всеми вариантами оптимальными криопротек-торными соединениями (табл. 7).
На основании результатов проведенной работы следует отметить, что для успешного сохранения жизнеспособности, морфолого-культу-ральных и биохимических характеристик помещаемых на хранение штаммов макромицетов из разных эколого-трофических групп необходимо применять индивидуальный подход к каждому образцу или группе сходных по индивидуальным особенностям образцов, что подтверждает результаты предыдущих исследований (Комиссаров и др., 2023).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ [REFERENCES]
Белова Н.В., Псурцева Н.В., Гачкова У.Ю., Озер-ская С.М. Сохранение биоразнообразия ба-зидиомицетов ex situ в специализированной коллекции культур LE (БИН) // Микология и фитопатология. 2005. Т. 39, вып. 2. С. 1-10 [Belova N.V., Psurtseva N.V., Gachkova U.Yu., Ozerskaya S.M. Sokhranenie bioraznoobraziya bazidiomitsetov ex situ v spetsializirovannoi kollektsii kul'tur LE (BIN) // Mikologiya i fitopatologiya. 2005. T. 39. Vyp. 2. S. 1-10 (in Russ.)].
Бухало А. С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев, 1988. 143 с. [Bukhalo A.S. Vysshie s»edobnye bazidiomitsety v chistoi kul'ture. Kiev, 1988. 143 s. (in Russ.)].
Камзолкина О.В., Богданов А.Г. Методическое пособие по микроскопии в исследованиях грибов и водорослей // 2017. М., 115 с. [Kamzolkina O.V., Bogdanov A.G. Metodicheskoe posobie po mikroskopii v issledovaniyakh gribov i vodoroslei // 2017. M., 115 s. (in Russ.)].
Комиссаров Н.С., Дьяков М.Ю., Гарибова Л.В. Методы длительного хранения чистых культур макромицетов // Микология и фитопатология. 2023. Т. 57. Вып. 3. С. 155-171 (DOI: 10.31857/S0026364823030054) [Komissarov N.S., D'yakov M.Yu., Garibova L.V. Metody dlitel'nogo khraneniya chistykh kul'tur makromitsetov // Mikologiya i fitopatologiya. 2023. T. 57. Vyp. 3. S. 155-171 (DOI: 10.31857/S0026364823030054) (in Russ.)].
Красная книга Российской Федерации // 2008. М., 854 с. [Krasnaya kniga Rossiiskoi Federatsii // 2008. M., . 854 s. (in Russ.)].
Красная книга Ленинградской области // 2018. СПб., 848 с. [Krasnaya kniga Leningradskoi oblasti // 2018. SPb., 848 s. (in Russ.)].
Красная книга природы Ленинградской области // 2000. Т. 2. СПб., 672 с. [Krasnaya kniga prirody Leningradskoi oblasti // 2000. T. 2. SPb., 672 s. (in Russ.)].
Минприроды РФ. Об утверждении Перечня объектов растительного мира, занесенных в Красную книгу Российской Федерации // Приказ № 320 от 23.05.2023. Регистрационный № 74362 от 21.07.2023. [Minprirody RF. Ob utverzhdenii Perechnya ob»ektov rastitel'nogo mira, zanesennykh v Krasnuyu knigu Rossiiskoi Federatsii // Prikaz № 320 ot 23.05.2023. Registratsionnyi № 74362 ot 21.07.2023. (in Russ.)].
Широких А.А., Широких И.Г. К вопросу об охране грибов // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2021. Т. 22. Вып. 5. С. 641-660 (https:// doi.org/10.30766/2072-9081.2021.22.5.641-660) [Shirokikh A.A., Shirokikh I.G. K voprosu ob okhrane gribov // Agrarnaya nauka Evro-Severo-Vostoka. 2021. T. 22. Vyp. 5. S. 641-660 (https:// doi.org/10.30766/2072-9081.2021.22.5.641-660) (in Russ.)].
Abrego N., Oivanenb P., Vinerc I., Nordéne J., Pent-tilag R., Dahlbergh A., Heilmann-Clauseni J., Somer-vuod P., Ovaskainena O., Schigel D. Reintroduction of threatened fungal species via inoculation // Biological Conservation. 2016. Vol. 203. P. 120-124 (https://doi. org/10.1016/j.biocon.2016.09.014).
Bertéli M.B.D., Pinheiro C.R., Philadelpho B.O., Otero D.M., Ribeiro C.D.F., de Souza C.O., Ferreira E.S., Ruiz S.P., do Valle J.S., Linde G.A., Colauto N.B. Long-term cryopreservation of Lentinus crinitus strains
by wheat grain technique // Journal of Microbiological Methods. 2022. Vol. 198. https://doi.org/10.1016/j. mimet.2022.106491.
Bisko N.A., Lomberg M.L., Mykchaylova O.B., Mytropol-ska N.Y. Conservation of biotechnological important species diversity and genetic resources of rare and endangered fungi of Ukraine // Plant & Fungal Research. 2018. Vol. 1. Is. 1. P. 18-27 (DOI: 10.29228/plantfun-galres.41).
Boddy, L., P. Wald, D. Parfitt, and H. Rogers. Preliminary ecological investigation of the wood-inhabiting tiered tooth Creolophus (= Hericium) cirrhatus, coral tooth Hericium erinaceum, bearded tooth H. coralloides and oak polypore Piptoporus quercinus (= Buglossoporus pulvinus) // English Nature Report 2004. no. 616.
Cardinale B.J., Duffy J.E., Gonzalez A., Hooper D.U., Perrings C., Venail P., Narwani A., Mace G.M., Tilman D., Wardle D.A., Kinzig A.P., Daily G.C., Loreau M., Grace J.B., Larigauderie A., Srivastava D.S., Naeem S. Biodiversity loss and its impact on humanity // Nature. 2012. Vol. 486. P. 59-67.
Choi K.-D., Lee K.-T., Shim J.O., Lee Y.-S., Lee, T.-S., Lee S.S., Guo S.-X., Lee M.W. A New Method for Cultivation of Sclerotium of Grifola umbellata // Mycobi-ology. 2003. Vol. 31. Is. 2. P. 105-112.
Colauto N.B., da Eira A.F., Linde G.A. Cryopreservation at -80 °C of Agaricus blazei on rice grains // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2011. Vol. 27. Is. 12. P. 3015-3018 (https://doi.org/10.1007/ s11274-011-0772-9).
Crockatt M. Ecology of the rare oak polypore Piptoporus quercinus and the tooth fungi Hericium cirrhatum. H. coralloides, and H. erinaceus in the UK // 2008. Pro-Quest LLC.
Dahlberg A., Genney D.R., Heilmann-Clausen J. Developing a comprehensive strategy for fungal conservation in Europe: current status and future needs // Fungal Ecology. 2010. Vol. 3. P. 50-64.
Domashlinets V. List the excluded plant and fungal species from the Red Book of Ukraine (flora) // Order of the Ministry of Environmental Protection and natural resources of Ukraine February 15. 2021. № 111. Ukraine (нет полного документа).
Homolka L., Lisa L., Eichlerova I., Nerud F. Cryopreser-vation of basidiomycete strains using perlite // J. Microbiological Methods. 2001. Vol. 47. Is. 3. P. 307-313 (https://doi.org/10.1016/S0167-7012(01)00338-4).
Homolka L., Lisa L., Kubatova A., Vanova M., Jan-derova B., Nerud F. Cryopreservation of filamentous micromycetes and yeasts using perlite // Folia Micro-biologica. 2007. Vol. 52, Is. 2. P. 153-157 (https://doi. org/10.1007/BF02932154).
Honegger R. The Impact of different long-term storage conditions on the viability of lichen-forming ascomycetes and their green algal photobiont, Trebouxia spp. // Plant
Biology. 2003. Vol. 5. Is. 3. P. 324-330 (нет полной статьи).
Hwang S.W. Effects of Ultra-Low Temperatures on the Viability of Selected Fungus Strains // Myco-logia. 1960. Vol. 52. Is. 3. P. 527-529 (https://doi. org/10.2307/3755974).
Hwang S.W. Long-Term Preservation of Fungus Cultures with Liquid Nitrogen Refrigeration // Applied Microbiology. 1966. Vol. 14, Is. 5. P. 784-788 (https://doi. org/10.1128/am.14.5.784-788.1966).
Hwang S.W. Investigation of Ultra-Low Temperature for Fungal Cultures. I. An Evaluation of Liquid-Nitrogen Storage for Preservation of Selected Fungal Cultures // Mycologia. 1968. Vol. 60. Is. 3. P. 613-621 (https://doi. org/10.1080/00275514.1968.12018610).
Kaul T.N. Conservation of mushroom biodiversity // Mushroom biology and biotechnology (Eds. Rai R.D., Singh S.K., Yadav M.C., Tewari R.P.) 2007. Mushroom Society of India, Chambaghat, Solan. P. 115-126 (https://www.researchgate.net/publication/294889868).
Larson D.W. Patterns of lichen photosynthesis and respiration following prolonged frozen storage // Canad. J. Bot. 1978. Vol. 17. P. 2119-2123.
Lee S.B., Milgroom M.G., Taylor J.W. A rapid, high yield mini-prep method for isolation of total genomic DNA from fungi // Fungal Genetics Reports. 1988. Vol. 35. Is. 11. P. 23-24.
Li Y., Wang Q. The development of the Fungal Resources Conservation System «One District, One Herbarium and Five Banks» and its application on Qinghai-Tibet Plateau // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2019. Т. 20, вып. 1. С. 29-35 (DOI: 10.30766/20729081.2019.20.1.29-35).
Pasailiuk M.V., Sukhomlyn M.M., Gryganskyi A.P., Fontana N.M. World biota conservation vs fungal conservation practice // Current Research in Environmental & Applied Mycology. 2022. Vol. 12. Is. 1. P. 268-284 (DOI 10.5943/cream/12/1/17).
Pasaylyuk M., Petrichuk Y., Tsvyd N., Sukhomlyn M. The aspects of reproduction of Clathrus archeri (Berk.) Dring by re-situ method in the National Nature Park Hutsulshchyna // Forest Research Papers. 2018. Vol. 79. Is. 3. P. 281-287 (DOI: 10.2478/frp-2018-0028).
Pi§ tka J., Grzywacz A. In situ inoculation of larch with the threatened wood-decay fungus Fomitop-sis officinalis (Basidiomycota) - experimental studies // Polish Botanical Journal. 2005. Vol. 50. Is. 2. P. 225-231.
Psurtseva N.V., Kiyashko A.A., Gachkova E.Y., Belova N.V. Basidiomycetes Culture Collection LE (BIN): Catalogue of Strains. M., 2007. 116 p.
Tukey J.W. Comparing individual means in the analysis of variance // Biometrics. 1949. Vol. 5. Is. 2. P. 99-114.
Информация об авторах
Никита Сергеевич Комиссаров - инженер-лаборант МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микологии и альгологии (macoloams@ gmail.com);
Максим Юрьевич Дьяков - вед. инженер МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микологии и альгологии, (max_fungi@mail.ru);
Лидия Васильевна Гарибова - профессор МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микологии и альгологии, докт. биол. наук (gariblv@ yandex.ru).
Information about the author
Nikita Sergeevich Komissarov, Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, Department of Mycology and Algology, Laboratory Engineer (macoloams@ gmail.com);
Maxim Yurievich Dyakov, Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, Department of Mycology and Algology, Leading Engineer (max_fungi@mail.ru);
Lydia Vasilievna Garibova, Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, Department of Mycology and Algology, Professor, Doctor of Biological Sciences (gariblv@yandex.ru).
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Contribution of the authors
The authors contributed equally to this article.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interests
The authors declare no conflicts of interests.
Статья поступила в редакцию 04.11.2023; одобрена после рецензирования 17.12.2023; принята к публикации 30.01.2024.
The article was submitted 04.11.2023; approved after reviewing 17.12.2023; accepted for publication 30.01.2024.
