CC BY
138
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
© С.А. ЗАМОРИНА, С.В. ШИРШЕВ
УДК 612.018:577.175.327].063:612.017.1:618.2
С.А. Заморина, С.В. Ширшев
ХОРИОНИЧЕСКИЙ ГОНАДОТРОПИН - ФАКТОР ИНДУКЦИИ ИММУННОЙ
толерантности при беременности
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, г Пермь (614081, г Пермь, ул. голева, 13; тел. (342) 2808431; факс (342)2809211; e-mail: mantissa7@mail.ru
Изучали роль хорионического гонадотропина (Хг) в регуляции баланса между Т-регуляторными (Treg) лимфоцитами и субпопуляцией интерлейкин (И)-17-продуцирующих (Th17) лимфоцитов у женщин. Установлено, что Хг в исследуемых концентрациях, соответствующих таковым в I и II-III триместры беременности (10 и 100 МЕ/мл соответственно), увеличивал количество FoxP3+ и FoxP3+CTLA-4+-клеток в культуре CD4+-лимофцитов. В отношении Th17 показано, что Хг снижал количество RORgt+-, RORgt+IL-17A+- и IL-17А+CCR6+-клеток в культуре СD4+-лимфоцитов, одновременно снижая способность этих клеток секретировать И-17А. В то же время Хг в высокой концентрации, соответствующей таковой в I триместре беременности, повышал липополисахаридиндуцированную активность индоламин-2,3-диоксигеназы (IDo) в моноцитах. Таким образом, Хг является индуктором формирования иммунной толерантности на периферии, непосредственно контролируя баланс Treg/Th17 и активность IDo.
К л ю ч е в ы е с л о в а : хорионический гонадотропин, моноциты, Treg, Th17, IL-17A, индоламин-2,3-диоксигеназа S.A.Zamorina, S.VShirshev
human chorionic gonadotropin is a factor in the induction of immune tolerance IN pregnancy
Studied the role of human chorionic gonadotropin (ChG) in the regulation of balance between T-regulatory lymphocytes (Treg) and сsubpopulation of IL-17-producing (Th17) lymphocytes women. It is established, that of ChG in the concentrations of the corresponding II-III and I trimester (10 and 100 lU/ml, respectively) increased number of FOXP3+ FOXP3+CTLA-4+cells in the culture of CD4+-lymphocytes. tYln respect of Th17 shown that ChG reduced the number of ROR-+-, tYROR-+IL-17A+- and IL-17A+CCR6+-cells in the culture of CD4+lymphocytes, while reducing the ability of these cells secrete IL-17A. At the same time, ChG high concentration corresponding to the I trimester of pregnancy, increased lipopolysaccharide induced activity indolamin-2,3-dioxygenaze (IDO) in monocytes. Thus, ChG is the inductor of the formation of immune tolerance on the periphery, directly controlling the balance of Treg/Th17 and activity of IDO.
Keywords: human chorionic gonadotropin, monocytes, Treg, Th17, IL-17A, indolamin-2,3-dioxygenaze
Хорионический гонадотропин (ХГ) является плацентарным аналогом ЛГ, который в физиологических условиях продуцируется после оплодотворения клетками трофобласта. Гормон отличается широким спектром биологического действия, регулируя стероидогенез плаценты и плода [2]. Максимальная концентрация ХГ в период гестации совпадает с экспрессией антигенов MHC I класса на клеточной поверхности эмбриона (I триместр), распознавание которых, как правило, приводит к процессам иммунного отторжения.
С позиции иммунологии беременность представляет собой физиологически обусловленное состояние толерантности иммунной системы матери к полуаллогенному плоду. Для объяснения механизмов, обеспечивающих нормальное развитие беременности, предложена новая концепция - "Th1/ Th2/Th17/Treg" [12]. Суть данной парадигмы заключается в том, что в период физиологически протекающей беременности в иммунной системе матери происходят изменения, сопровождающиеся доминированием Th2- и T-регуляторных (Treg) клеток над Th1- и ^П-лимфоцитами (интерлейкин (ГЬ)-17-продуценты). Изменение соотношения этих клеточных подтипов, как правило, приводит к преждевременным родам или спонтанному аборту [12, 13, 17]. Помимо этого, формирование периферической толерантности осуществля-
Заморина Светлана Анатольевна (Zamorina Svetlana Anataol’evna), e-mail: mantissa7@mail.ru
ется благодаря экспрессии антигенпрезентирующими клетками (АПК) фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), что блокирует антифетальные клеточно-опосредованные иммунные реакции матери [11]. Взаимодействие Treg с АПК через CTLA-4 приводит к экспрессии в последних фермента IDO и усилению катаболизма триптофана [6], что еще больше усиливает материнско-фетальную толерантность. С учетом того, что ХГ обладает выраженной иммуномодулирующей активностью, усиливая иммунный ответ 2-го типа [1] и способствуя привлечению Treg в децидуальную оболочку беременной матки [14], он может быть важным регулятором баланса Th17- и Treg-клеток, равно как и фактором индукции IDO.
Цель работы - изучение влияния ХГ на индукцию Th17 и Treg-клеток с оценкой механизмов, опосредованных IDO в системе in vitro.
Материалы и методы. В работе использовали периферическую кровь здоровых женщин репродуктивного возраста, находящихся в фолликулярной фазе менструального цикла (5-11-е сутки). Из гепаринизированной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3) ("Sigma", США; "Spofa", Чехия) выделяли мононуклеар-ную фракцию, из которой на магнитных бусах ("Invitrogen", США) получали CD4+-лимфоциты. ХГ применяли в физиологических концентрациях 10 и 100 МЕ/мл (I и II-III триместры беременности соответственно). Клетки (105-106 кл/мл) культивировали в полной питательной среде, содержащей
- 105 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2013
среду 199 ("Биолот", Россия) с добавлением 10% ЭТС ("Sigma", США), 10 мМ Hep-es ("ICN Рh.", США), 2 мМ L-глутамина ("iCn Рh.", США) и 100 мкг/мл гентамицина ("KRKA", Словения).
Для индукции формирования Тreg в культуры вносили трансформирующий фактор роста b (TGF-b) (5 нг/мл, "GiBCO",
США), магнитные частицы с анти-CD3/
CD28 моноклональными антителами ("In-vitrogen", США) и нейтрализующие антиинтерферон (IFN)g и анти-ГЬ-4-антитела (10 мкг/мл, "eBioscience", США). После 72 ч инкубации с гормоном удаляли магнитные частицы и оценивали количество Treg как процент CD4+FOXP3+-клеток (anti-human Foxp3 Per-Cy5; anti-human CD4-FITC), одновременно изучая оценивая экспрессию CTLA-4 (anti-human CD152 APC, все антитела "eBioscience", США). Для индукции дифференцировки Th17 использовали аналогичную схему эксперимента, где вместо TGF-b в культуры вносили IL-1P и IL-6 (по 10 нг/мл, "eBioscience", США). После 72 ч инкубации с гормоном удаляли магнитные частицы и оценивали количество Th17 как процент CD4+-лимфоцитов (anti-human CD4-FITC), экспрессирующих ROR-gt (anti-mouse/human ROR-gt-PE) и IL-17A (anti-human IL-17A-Per-CP-Cy5.5). В ряде экспериментов количество Th17 также определяли по экспрессии хемокинового рецептора CCR6 (CD196; anti-human CCR6-PE). Измерения проводили на проточном цитофлюориметре FACSCalibur, анализируя не менее 100 000 событий в пробе ("Becton Dickinson", США). Гейты выставляли по соответствующему изотипическому контролю (все антитела фирмы eBioscience, США). В супернатантах культур Th17 оценивали уровень IL-17A иммуноферментным методом при помощи набора ("eBioscience", США).
Активность IDO определяли спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренина, первого стабильного метаболита пути распада триптофана [4]. Мононуклеары, полученные центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина, культивировали с ХГ (10 и 100 МЕ/мл) в растворе Хенкса, содержащем 100 мкМ триптофана ("Sigma", США) в течение 4 ч, часть проб стимулировали липополисахаридом (ЛПС) (100 нг/мл; "Sigma", США). Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30% трих-лоруксусной кислоты, встряхивали на вортексе и центрифу-
Таблица 1
Влияние ХГ на уровень FoxP3+- и FoxP3+CTLA-4+-ktotok в популяции CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови женщин в системе in vitro
№ Гормональное воздействие FoxP3+, % FoxP3+CTLA-4+, % FoxP3+CTLA-4+/ FoxP3+
1 Контроль 6,60±1,31 4,76±0,97 0,72
2 ХГ, 10 МЕ/мл 12,07±1,96 7,88±0,98 0,65
p(2-1) < 0,05 p(2-1) < 0,05
3 ХГ, 100 МЕ/мл 11,89±1,77 8,63±1,42 0,73
p(3-1) < 0,05 p(3-1) < 0,05
П р и м е ч е н и е . Здесь и в табл. 2 представлено процентное содержание клеток (М+SD) в популяции CD4+ Т-лимфоцитов крови (n = 8). p - достоверные по парному t-критерию Стьюдента отличия с показателем в контроле.
гировали в течение 5 мин, после чего в лунках 96-луночного планшета 75 мкл супернатанта культур смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Biohit BP 800 (США), калибруя по кинуренину ("Sigma", США).
Статистическую обработку данных проводили с помощью общепринятых методов вариационной статистики с использованием парного /-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Ранее нами показано, что ХГ в концентрациях, соответствующих таковым в I и II-III триместры, достоверно увеличивал долю CD4+FoxP3+ T-клеток без дополнительной TGF-b-индукции [3]. В условиях физиологически протекающей беременности плацента наряду с ХГ продуцирует высокий уровень TGF-b1 [2], дифференцирующего антигенпримированные CD4+CD25- наивные Т-клетки в направлении Treg и анергичного Т-клеточного фенотипа [5,16].
72-часовая инкубация ХГ с CD4+-T-клетками на фоне индуктора транскрипции Foxp3 TGF-b1 вне зависимости от концентрации гормона также приводит к достоверному повышению количества Treg (CD4+FoxP3+). Одновременно ХГ повышает уровень Treg, экспрессирующих CTLA-4
Спонтанный вариант Стимулированный ЛПС вариант
Рис. 1. Модуляция активности IDO под влиянием ХГ (n = 9). По оси ординат - нинуренин (в мкМ). 1 - контроль; 2 - ХГ (10 МЕ/мл); 3 -ХГ (100 МЕ/мл).
p - достоверное по парному /-критерию Стьюдента различие с показателем в контроле, * - достоверные по парному /-критерию Стьюдента отличия между спонтанным и стимулированным вариантами теста.
Рис. 1. Модуляция активности IDO под влиянием ХГ (n = 9). По оси ординат - нинуренин (в мкМ). 1 - контроль; 2 - ХГ (10 МЕ/мл); 3 -ХГ (100 МЕ/мл).
p - достоверное по парному /-критерию Стьюдента различие с показателем в контроле, * - достоверные по парному t-критерию Стьюдента отличия между спонтанным и стимулированным вариантами теста.
- 106 -
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
(CD4+CD152+FoxP3+) (табл. 1). Таким образом, ХГ увеличивает как количество Treg, так и их функциональную активность, связанную с экспрессией CTLA-4 на фоне TGF-Pj.
Благодаря CTLA-4 Treg способны индуцировать экспрессию IDO в АПК, взаимодействуя с костимулирующими молекулами CD80/86, что является одним из механизмов периферической толерантности [2, 7, 8]. Внесение гормона в суспензию мононуклеаров с последующей 72-часовой инкубацией приводит к достоверному усилению ферментативной активности только ЛПС-индуцируемой IDO моноцитов. Данный эффект присущ только высокой концентрации ХГ, т. е. его можно наблюдать в I триместре беременности (рис. 1).
В отношении Th17 установлено, что ХГ снижает количество CD4+-лимфоцитов, экспрессирующих мастер-регулятор Th17 ROR-yt. Кроме того, ХГ достоверно снижает уровень дубльпозитивных ROR-Yt+IL-17А+-лимфоцитов. При изучении содержания IL-17A в супернатантах фракционированных CD4+-клеток получили подтверждение угнетающего эффекта ХГ на процессы дифференцировки Th в Th17. Кроме того, гормон достоверно снижает процент клеток, экспрессирующих хемокиновый рецептор CCR6, который необходим для направленной миграции Th17 в очаг воспаления [10]. Важно отметить, что ХГ реализует данные эффекты вне зависимости от исследованных концентраций, т.е. на протяжении всего периода физиологически протекающей беременности (табл. 2). Таким образом, ХГ препятствует не только диффе-ренцировке Th в Th17, но и существенно угнетает функциональную активность данных эффекторов.
Подводя итоги, можно достаточно уверенно говорить о ХГ как об одном из важных факторов индукции локальной толерантности при физиологически протекающей беременности (рис. 2). В основе действия гормона лежит механизм передачи сигнала ХГ через цАМФ-протеинкиназу А (ПКА) [1], что приводит к индукции экспрессии FoxP3 в CD4+-лимфоцитах [15]. Известно, что FoxP3 имеет как минимум четыре изоформы молекулы, одна из которых является полномасштабной, а три другие формируются в результате сплайсинга отдельных экзонов [9]. В контексте наших исследований можно предполагать, что ХГ самостоятельно и/или совместно с TGF-b приводит к экспрессии молекулы FoxP3, содержащей домен (кодируемый экзоном 2), который ответствен за связывание транскрипционных факторов семейства ROR [9]. По-видимому, это и создает условия поляризации CD4+-T-клеток в Treg, одновременно блокируя процессы диф-ференцировки в Th17. Одновременно с этим ХГ усиливает ЛПС-индуцируемую экспрессию IDO в моноцитах. Известно, что простагландин E2, который также повышает уровень цАМФ с последующей активацией ПКА, индуцирует экспрессию мРНК IDO, а ЛПС через сигналинг с Toll-подобных рецепторов превращает неактивную IDO в биологически активный фермент [4]. В то же время можно предполагать, что ХГ принимает участие и в качестве дополнительного агента, усиливающего экспрессию данного фермента опосредованно, через CTLA-4+-Treg.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ширшев С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля
процессов репродукции. Екатеринбург: УрО РАН; 2002; 2.
2. Ширшев С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий. Екатеринбург: УрО РАН; 2009.
3. Ширшев С.В., Орлова Е.Г., Заморина С.А., Некрасова И.В. Влияние гормонов репродукции на индукцию
Таблица 2
Влияние ХГ на уровень Th17 в популяции CD4+-Т-лимфоцитов периферической крови у женщин в системе in vitro
№ Гормональное воздействие RORyt+, % RORyt+IL17A+, % IL17A+CCR6+, % HT-17A, пг/мл
1 Контроль 2,24±0,09 0,542±0,091 1,610±0,227 247,09±15,89
2 ХГ, 10 МЕ/мл 1,26±0,09 0,319±0,041 0,880±0,051 178,68±20,45
p(24) < 0,05 p(24) < 0,05 p(24) < 0,05 p(24) < 0,05
3 ХГ, 100 МЕ/мл 1,23±0,16 0,343±0,056 0,930±0,081 196,43±13,04
p(3-1) < 0,05 p(24) < 0,05 p(3-1) < 0,05 p(24) < 0,05
CD4+CD25bri8thFoxp3+ Т-регуляторных лимфоцитов. Доклады РАН. 2011; 440 (1): 132-5.
4. Braun D., Longman R.S., Albert M.L. A two-step induction of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) activity during dendritic-cell maturation. Blood. 2005; 106: 2375-81.
5. Chen W., Jin W., Hardegen N. et al. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-p induction of transcription factor Foxp3. J. Exp. Med. 2003; 198: 1875-86.
6. Fallarino F., Grohmann U., Hwang K.W. et al. Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells. Nature Immunol. 2003; 4: 1206-12.
7. Finger E.B., Bluestone J.A. When ligand becomes receptor -tolerance via B7 signaling on DCs. Nature Immunol. 2002; 3: 1056-7.
8. Grohmann U., Orabona C., Fallarino F. et al. CTLA-4-Ig regulates tryptophan catabolism in vivo. Nature Immunol. 2002; 3: 1097-101.
9. Ichiyama K., Yoshida H., Wakabayashi Y., Chinen T. et al. Foxp3 inhibits RORyt-mediated IL-17A mRNA transcription through direct interaction with RORyt. J. Biol. Chem. 2008; 283: 17003-8.
10. Maddur M.S., Miossec P., Kaveri S.V., Bayry J. Th17 cells: Biology, pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases, and therapeutic strategies. Am. J. Pathol. 2012; 181: 8-18.
11. Mellor A.L., Munn D.H. Tryptophan catabolism prevents maternal T-cell from activating lethal anti-fetal immune responses. J. Reprod. Immunol. 2001; 52: 5-13.
12. Saito S., Nakashima A., Shima T., Ito M. Th1/Th2/Th17 and regulatory T-cell paradigm in pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63: 601-10.
13. Santner-NananB., PeekM.J., Khanam R., Richarts L. et al. Systemic increase in the ratio between Foxp3+ and IL-17-producing CD4+ T cells in healthy pregnancy but not in preeclampsia. J. Immunol. 2009; 183: 7023-30.
14. Schumacher A., Brachwitz N., Sohr S. et al. Human chorionic gonadotropin attracts regulatory T cells into the fetal-maternal interface during early human pregnancy. // J. Immunol. 2009; 182: 5488-97.
15. Sharma S., Yang S.-Ch., Zhu L. et al. Tumor cyclooxygenase-2/ prostaglandin E2-dependent promotion of FOXP3 expression and CD4+CD25+ T regulatory cell activities in lung cancer. Cancer Res. 2005; 65: 5211-20.
16. Walker M.R., Kasprowicz D.J., Gersuk V.H. et al. Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25-T cells. J. Clin. Invest. 2003; 112: 1437-43.
17. Wang W.J., Hao C.F., Yi-Lin et al. Increased prevalence of T helper 17 (Th17) cells in peripheral blood and decidua in unexplained recurrent spontaneous abortion patients. J. Reprod. Immunol. 2010; 84: 164-70.
Поступила 06.07.12
Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная
биология" 12-П-4-1017.
- 107 -
