CC BY
69
ОБЗОРЫ
© В. и. Киселев1,
л. А. Ашрафян2, В. ф. Беженарь3,
А. а. цыпурдеева 3
1 ФГБУ «российский научный центр решгенорадиологии» МЗ рФ, Москва;
2 ФГБУ «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва;
3 ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии имени д. О. Отта» сЗО рАМН, санкт-Петербург
химиопрофилактика как способ контроля эпигенетических изменений (аналитический обзор литературы)
УДК: 618.1-006.6:575
■ Эпигенетические изменения, проявляясь уже на ранних стадиях канцерогенеза, являются потенциальными мишенями химиопрофилактики. Терапия осуществляется в основном за счет реверсии метилирования ДНК за счет ингибирования ДНК-метилтрансфераз и низкого ацетилирования путем ингибирования гистондеацетилаз. Поиски терапевтических агентов показали, что наиболее эффективными являются вещества, обладающие множественным механизмом действия. Активные субстанции DIM и EGCG широко известны своими противоопухолевыми свойствами. Благодаря воздействию на эпигенетические механизмы, субстанции являются перспективными профилактическими и терапевтическими средства при наиболее распространенных видах рака.
■ Ключевые слова: химиопрофилактика; эпигенетика; 3,3'-дииндолилметан; EGCG; дНК-метилирование; ацетелирование гистонов.
Введение
Термин «эпигенетика» определяет изменения экспрессии генов, вызванные наследственными, но потенциально обратимыми, модификациями структуры хроматина [21]. Особый интерес эпигенетические изменения представляют в связи с подтвержденной ролью в онкогенезе. Во время канцерогенеза, как известно, нарушаются основные клеточные функции: регуляция клеточного цикла, репарация дНК, апоптоз, воспалительные стимулы, система клеточных сигналов и дифференциров-ки клеток. Последние данные указывает, что эпигенетические изменения способствуют дерегулированию этих процессов. В частности, в результате метилирования промоторов генов и модификации гистонов, а также негистоновых белков, таких как p53, NF-kB и шаперона HSP90 путем ацетилирования или метилирования, наблюдается ингибирование ферментов де-токсикации, генов-супрессоров опухолей, регуляторов клеточного цикла, сигнальных рецепторов и транскрипционных факторов, апоптоз-индуцирующих генов и генов, ответственных за репарацию дНК [4, 6, 9, 12, 13, 20, 19, 22].
Ключевым механизмом эпигенетической регуляции является метилирование дНК. Присоединение метильной группы к островкам CpG в промоторных областях подавляет экспрессию генов и переводит их в статус «молчащих» [4, 12, 20] (рис. 1). Метилирование осуществляется при помощи специального фермента дНК-метилтрансферазы (DNMT), а именно тремя изоферментами — DNMT1, DNMT3a, DNMT3b. Как полагают, именно DNMT3b играет ключевую роль во время образования опухолей [4]. Гиперметилирование происходит на разных стадиях развития рака и обычно взаимосвязано с генетическими повреждениями. Подобные взаимодействия происходят, в частности, при гиперметилировании CpG-островков промотора генов репарации hMLH1 и BRCA1. Замолкание генов репарации дНК открывает путь к опухолевой трансформации клеток [19].
с другой стороны, показано, что пониженное метилирование CpG в течение канцерогенеза в определенных повторяющихся геномных последовательностях также связано с геномной нестабильностью, активацией мобильных элементов и хромосомными аберрациями [13].
Эпигенетическая регуляция экспрессии генов также опосредована модификациями в ^концевых хвостах гистонов. Гистоны могут быть изменены в результате дерегуляции
Ген с подавленной экспрессией
Конденсированный хроматин Метилированные цитозины Деацетшшрованные гистоны
Рис. 1. Эпигенетическое регулирование экспрессии генов. CpG-островки (обогащенные цитозином и гуанином) как правило, не метилируются, но при канцерогенезе подавляются эпигенетически посредством гиперметилирования [Figueiredo L. M., Cross G.A., Janzen C. J. Epigenetic regulation in African trypanosomes: a new kid on the block. Nat Rev Microbiol. 2009; 7: 504-513]
экспрессии генов факторами транскрипции, или, пост-трансляционно, с помощью ферментов, модифицирующих гистоны [22]. До сих пор более всего исследовались ацетилирование и метилирование гистонов, а нарушение баланса этих процессов связывали с опухолевой трансформацией [2]
Также следует упомянуть об эпигенетическом механизме регуляции генов за счет модификации структуры хроматина небольшими некодирующи-ми молекулами мкРНК, которые влияют на экспрессию онкогенов с помощью специальной деградации мРНК или ингибирования их трансляции. Гиперметилирование ДНК приводит к «за-молканию» мкРНК и, как следствие, ослаблению их регуляции в опухолях [10].
Принципы эпигенетической терапии
рак органов женской репродуктивной системы (РОЖРС), включая рак молочной железы (РМЖ), яичников (РЯ) и эндометрия (РЭ), во всем мире стал одним из значимых факторов отрицательных демографических тенденций. Заболеваемость и смертность от этих новообразований стремительно растет. В России, по данным МЗ, в по-
следние годы значительно возросла летальность в течение первого года с момента установления диагноза: для молочной железы — 12,8 %; для рака эндометрия — 16,5 %; для рака яичников — 36,8 %; для рака шейки матки — 20,9 %.
Достижения современной фундаментальной медицинской науки в области канцерогенеза открывают новые возможности эффективной профилактики и ранней диагностики, в частности при ряде локализаций рака репродуктивных органов. современная стратегия профилактики неопластических процессов заключается в коррекции начальных нарушений молекулярно-биологических процессов. По мере накопления клинических и лабораторных данных совершенствуется и быстро развивающаяся область терапевтической эпигенетики.
В настоящее время для противодействия эпигенетическим изменениям, связанным с раком, все чаще применяется химиопрофилакти-ка. Это становится возможным благодаря тому, что в отличие от геномных мутаций, которые принципиально необратимы, модификации ДНК путем метилирования хотя и стабильны, но обратимы. Воздействие осуществляется за счет
76
обзоры
модулирования активности или экспрессии ДНК-метилтрансфераз и ферментов модификации гистонов (реверсия метилирования дНК путем ингибирования дНК-метилтрансфераз и низкого ацетилирования путем ингибирования гистонде-ацетилаз) [18].
Однако, следует понимать, что воздействуя на определенные компоненты патологического эпигенетического процесса, мы оказываем влияние одновременно на множественные сигнальные сети. Поэтому в последнее время, с учетом сложности эпигенетического контроля экспрессии генов, все больше работ посвящены определению профилей метилирования генов при разнообразных видах рака с целью осуществления таргетно-го воздействия — деметилирования определенных генов-супрессоров опухолевого роста [23].
Наиболее оптимальной сейчас признана эпигенетическая терапия, которая позволяет параллельно воздействовать на множество аномальных мишеней, при этом модулируя и компенсируя изменения в нецелевых сигнальных путях [1].
Химиопрофилактика эпигенетических изменений с использованием DIM и EGCG
В течение последних лет экспериментально и клинически обоснована уникальная способность соединений 3,3-дииндолилметана (DIM) и эпигаллокатехин-3-галлата (EGCG) модулировать молекулярные механизмы, опосредующие патологическую пролиферацию, сниженный апоптоз, опухолевый неоангиогенез, провоспа-лительную и инвазивную активность трансформированных клеток [3]. К настоящему моменту идентифицировано большое число биологически активных молекулярных мишеней, ингибируемых DIM и EGCG, в том числе являющихся звеньями эпигенетических нарушений.
Индол-3-карбинол (I3C) — метаболический предшественник DIM — проявляет эпигенетическую деметилирующую активность. На модели опухолевых клеток поджелудочной железы было показано, что I3C дозо-зависимым образом деме-тилировал промоторную область гена р16 INK4a и, как следствие, реактивировал его. Опухоль-супрессорный белок р16 является ингибитором циклин-зависимых киназ клеточного цикла и его гиперэкспрессия способствует остановке клеточного деления. В опухолевых клетках часто наблюдается метилирование гена, кодирующего белок р16, в результате чего данный ген переходит в статус неактивных «молчащих» генов [26].
DIM обладает самостоятельной ингибирую-щей активностью в отношении гистон-деацитилаз I класса. На модели рака толстой кишки in vitro
и в опухолевых ксенотрансплантатах DIM вызывал селективную протеасомную деградацию гистон-деацетилаз I класса (HDAC1, HDAC2, HDAC3 и HDAC8), не оказывая влияния на активность HDAC II класса. Данный эффект ослаблял HDAC-опосредованное понижение уровня ингибиторов циклин-зависимых киназ р21 и р27, в итоге способствуя значительному повышению их экспрессии и остановке клеточного цикла в фазе G2/M. Кроме того, истощение HDAC индуцировало повреждения ДНК и апоптоз. Селективная деградация всех HDAC I класса без влияния на активность HDAC II класса (экспрессия которых ассоциируется с хорошим прогнозом) является преимуществом DIM по сравнению с другими известными HDAC-ингибиторами [25].
В 2012 г. другая группа авторов подтвердила эти результаты на клеточной модели рака простаты [5]. Было показано, что DIM является эффективным ингибитором HDAC2-изофермента гистон-деацетилазы как в андроген-чувствительных (LNCaP), так и в андроген-нечувствительных (РС-3) простатических опухолевых клетках. При этом, как и в предыдущем случае, понижение активности HDAC коррелировало с повышением экспрессии белка р21.
В экспериментах in vitro и in vivo также показано, что DIM может повышать противоопухолевую активность известного ингибитора гистон-деацетилазы — бутирата. Данный эффект был обусловлен DIM-опосредованным ингибировани-ем белка сурвивина и потенцированием бутират-индуцированного апоптоза опухолевых клеток. Авторами было высказано мнение о целесообразности комбинированного использования DIM и бутирата в профилактике колоректального рака [8].
Полифенолы зеленого чая (GTP) и эпи-галлокатехин-3-галлат (EGCG) также ингибиру-ют активность фермента DNMT и его экспрессию. В частности, это было показано на клетках линии рака простаты LNCaP. Ингибирование DNMT приводило к снижению метилирования проксимального промотора GSTP1 и, следовательно, реактивировало экспрессию GSTP1. Транскрипции способствовало расширение связывания транскрипционного фактора Sp1 с промотором GSTP1 [30].
Fang и др. сообщали о деметилировании и реэкспресии p16 в раковых клетках пищевода KYSE510 и раковых клетках толстой кишки НСТ116 после лечения с помощью EGCG [14, 16]. На клетках эпидермоидной карциномы EGCG значительно понижал активность метилирования за счет ингибирования экспрессии DNMT1, DNMT3 а, и DNMT3b, что привело к реэкспрессии мРНК p16 и, как следствие, самого белка [29].
Во время канцерогенеза молочной железы обычно наблюдается потеря экспрессии гена RARß2 (бета-рецептор ретиноевой кислоты). Lee и др. в своем исследовании на линиях клеток рака молочной железы выявили небольшое снижение метилирования промотора RARß2 при воздействии EGCG [24]. При изучении раковых клеток пищевода также показано, что EGCG приводит к деметилированию и дозозависимой реэкспрес-сии RARß2 [14]. В исследованиях Fang и др. обработка клеток рака легких мышей EGCG в сочетании с трихостатином (TSA) или бутиратом синергически повышала уровень мРНК DAPK и RARß, что указывает на реверсию эпигенетического подавления [17].
Совместное лечение EGCG и генистеином привело к снижению метилирования промоторов генов MGMT и hMLHl, а также преобразованию мРНК/белка в раковых клетках пищевода человека [15] (рис. 2).
Еще одной мишенью активной субстанции EGCG является ген hTERT. Продукт этого гена — каталитическая субъединица фермента тело-меразы, который часто активируется в раковых клетках. От активности теломеразы зависит сохранность теломер, которые за счет репаративной активности обеспечивают стабильность хромосом, а также защищают хромосомные окончания от деградации. Прирост активности теломеразы при канцерогенезе позволяет осуществлять неограниченное деление клеток [27]. В исследовании ER+ и ER- клеточных линий рака молочной железы, а также в исследовании иммортализо-ванных эпителиальных клеток молочной железы, было показано, что в результате лечения EGCG или лекарственной формой EGCG с увеличенной биодоступностью и стабильностью дифференциально снижалось метилирование промотора hTERT на фиксированных участках CpG. Это по-
зволило усилить связывание репрессора E2F с геном, и снизить, таким образом, экспрессию мРНК hTERT [28, 7].
Самые последние данные свидетельствуют о роли EGCG в качестве эпигенетического индуктора TIMP-3 (тканевый ингибитор матриксной металлопротеиназы 3), подавляющего инвазив-ную активность матриксных металлопротеиназ MMP-2 и MMP-9. Эксперименты на клетках рака молочной железы показали, что механизм действия EGCG основан на снижении активности ги-стондеацетидаз HDAC класса I, а также усилении триметилирования H3K27 в промоторе TIMP-3 с параллельным усилением ацетилирования ги-стона H3K9/18 [11].
заключение
Основная цель эпигенетической терапии — реверсия патологического онкогенного эпигенома.
В настоящее время с целью профилактики злокачественных заболеваний интенсивно разрабатываются и начинают внедряться в клиническую лабораторную практику диагностические системы, позволяющие проводить всесторонний мониторинг патологических процессов. В связи с этим при поиске эффективных эпигенетических препаратов особое внимание уделяется компонентам и субстанциям, в основе действия которых лежит способность регулировать злокачественные процессы на ранних стадиях, не допуская их прогрессии. При этом наличие мультитаргетного механизма действия, позволяющего задействовать множественные рычаги влияния на молекулярном уровне, является преимуществом, позволяющим оптимизировать терапевтический подход.
с учетом огромного количества накопленных данных, мы считаем, что DIM и EGCG, являясь ДНК-деметилирующими агентами и ингибиторами деацетилаз гистонов, имеют перспективное
Прямое взаимодействие
Рис. 2. Схема ингибирования DNMT (ДНК-метилтрансфераз) эпигаллокатехин-3-галлатом (EGCG)
будущее в качестве профилактического и терапевтического средства для наиболее распространенных видов рака.
литература
1. AzadN. et al. The future of epigenetic therapy in solid tumours — lessons from the past. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2013; 10 (5): 256-266.
2. Balasubramanian S., Verner E., Buggy J.J. Isoform-specific his-tone deacetylase inhibitors: the next step? Cancer Lett. 2009; 280 (2): 211-221.
3. BanerjeeS. et al. Attenuation of multi-targeted proliferation-linked signaling by 3,3'-diindolylmethane (DIM): From bench to clinic. Mutat. Res. 2011;728 (1-2): 47-66.
4. BeaulieuN. et al. An essential role for DNA methyltransferase DNMT3B in cancer cell survival. J. Biol. Chem. 2002; 277 (310): 28 176-28 181.
5. BeaverL.M. et al. 3,3'-Diindolylmethane, but not indole-3-car-binol, inhibits histone deacetylase activity in prostate cancer cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2012; 263 (3): 345-351.
6. BerdascoM., EstellerM. Aberrant epigenetic landscape in cancer: how cellular identity goes awry. Dev. Cell. 2010; 19 (5): 698-711.
7. BerletchJ. B. et al. Epigenetic and genetic mechanisms contribute to telomerase inhibition by EGCG. J. Cell Biochem. 2008; 103 (2): 509-519.
8. BhatnagarN. et al. 3,3'-Diindolylmethane enhances the efficacy of butyrate in colon cancer prevention through down-regulation of surviving. Cancer Prev. Res. 2009; 2 (6): 581-589.
9. Chen S., Sang N. Histone Deacetylase Inhibitors: The Epi-genetic Therapeutics That Repress Hypoxia-Inducible Factors. J. Biomed. Biotechnol. 2011; 2011:197946. doi: 10.1155/2011/197946. Epub 2010 Dec 5.
10. Choudhuri S. From Waddington's epigenetic landscape to small noncoding RNA: some important milestones in the history of epigenetics research. Toxicol. Mech. Methods. 2011; 21 (4): 252-274.
11. Deb G. et al. Epigenetic induction of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-3 by green tea polyphenols in breast cancer cells. Mol. Carcinog. 2014; doi: 10.1002/mc.22121.
12. EstellerM. CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future. Oncogene. 2002; 21 (35): 5427-40.
13. Esteller M. Epigenetics in cancer. N. Engl. J. Med. 2008; 358 (11): 1148-59.
14. FangM., ChenD., Yang C. S. Dietary polyphenols may affect DNA methylation. J. Nutr. 2007; 137 (1): 223S-8S.
15. FangM.Z. et al. Reversal of hypermethylation and reactivation of p16INK4a, RARbeta, and MGMT genes by genistein and other isoflavones from soy. Clin. Cancer Res. 2005; 11 (19 Pt 1): P. 7033-7041.
16. FangM.Z. et al. Tea polyphenol (-) epigallocatechin-3-gal-late inhibits DNA methyltransferase and reactivates methy-lationsilenced genes in cancer cell lines. Cancer Res. 2003; 63 (22): 7563-7570.
17. Gao Z. et al. Promoter demethylation of WIF-1 by epigallocat-echin-3-gallate in lung cancer cells. Anticancer Res. 2009; 29 (6): 2025- 30
18. Gerhauser C. Cancer chemoprevention and nutriepigenetics: state of the art and future challenges. Top. Curr. Chem. 2013; 329: 73-132.
19. Herman J.G, Baylin S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N. Engl. J. Med. 2003; 349 (21): 2042-2054.
20. Herman J. G. Hypermethylation of tumor suppressor genes in cancer. Semin. Cancer Biol. 1999; 9 (5): 359-367.
21. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 2003; 33: 245- 54.
22. JohnstoneR. W., Licht J. D. Histone deacetylase inhibitors in cancer therapy: is transcription the primary target? Cancer Cell. 2003; 4 (1): 13-8.
23. Kelly T.K., De Carvalho D. D, Jones P. A. Epigenetic Modifications as Therapeutic Targets. Nat. Biotechnol. 2010; 28 (10): 1069- 1078.
24. Lee W.J, Shim J.Y, Zhu B. T. Mechanisms for the inhibition of DNA methyltransferases by tea catechins and bioflavonoids. Mol. Pharmacol. 2005; 68 (4): 1018-1030.
25. Li Y., Li X., GuoB. Chemopreventive agent 3,3'-diindolyl-methane selectively induces proteasomal degradation of class I histone deacetylases. Cancer Res. 2010; 70 (2): 646-654.
26. Lyn-CookB. D. et al. Gender differences in gemcitabine (Gemzar) efficacy in cancer cells: effect of indole-3-carbinol. Anticancer Res. 2010; 30 (12): 4907-4913.
27. Martinez P., Blasco M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat. Rev. Cancer. 2011; 11 (3): 161- 176.
28. Meeran S.M. et al. A novel prodrug of epigallocatechin-3-gal-late: differential epigenetic hTERT repression in human breast cancer cells. Cancer Prev. Res. 2011; 4 (8): 1243-1254.
29. Nandakumar V., Vaid M,. Katiyar S.K. (-)-Epigallocatechin3--gallate reactivates silenced tumor suppressor genes, Cip1/ p21 and p16INK4a, by reducing DNA methylation and increasing histones acetylation in human skin cancer cells. Car-cinogenesis. 2011; 32 (4): 537- 544.
30. PandeyM., Shukla S., Gupta S. Promoter demethylation and chromatin remodeling by green tea polyphenols leads to re-expression of GSTP1 in human prostate cancer cells. Int. J. Cancer. 2010; 26 (11): 2520-2533.
Статья представлена Э. К. Айламазяном, ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург
chemoprevention as a way to control epigenetic
changes (analytical review of the literature)
Kiselev V. I., Ashrafyan L. A., Bezhenar V. F., Tsypurdeyeva A. A.
■ Summary: Epigenetic alterations have been identified as promising new targets for cancer prevention strategies as they occur early during carcinogenesis. Therapy is mainly focused on reversion of DNA methylation by inhibiting DNA-methyl-transferases and low level of acetylated histones by inhibiting histone deacetylases. DIM and epigallocatechin-3-gallate (EGCG) substances are believed to be an anticancer agent
in part through its regulation of epigenetic processes. These agents demonstrate efficacy in cancer chemopreventive action and have potential to be used to current cancer therapies.
■ Key words: cancer chemoprevention; epigenetic mechanisms; 3,3'-Diindolylmethane; EGCG; DNA methylation; histone acetylation.
■ Адреса авторов для переписки-
Киселев Всеволод Иванович — д. б. н., профессор, член-корреспондент РАН. ФГБУ «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт». 123182, Россия, Москва, пл. Академика Курчатова, д. 1. E-mail: vkis10@mail.ru. Ашрафян Лев Андреевич — д. м. н., профессор, Член-корреспондент РАН, руководитель отделения онкогинекологии. ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» МЗ РФ. 117997, Россия, Москва, ул. Профсоюзная, д. 86. E-mail: levaa2004@yahoo.com.
Беженарь Виталий Федорович — д. м. н., профессор, руководитель отделения оперативной гинекологии. ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» РАМН. 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: bez-vitaly@yandex.ru.
Цыпурдеева Анна Алексеевна — к. м. н., доцент, старший научный сотрудник отделения оперативной гинекологии. ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» РАМН. 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: iagmail@ott.ru.
Kiselev Vsevolod Ivanovich — National Research Centre (NRC) "Kurchatov Institute". 123182, Moscow, Akademika Kurchatova pl., 1, Russia. E-mail: vkis10@mail.ru.
Ashrafyan Lev Andreyevich — Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR). 117997, Moscow, Profsoyuznaya St., 8' Russia. E-mail: levaa2004@yahoo.com.
Bezhenar Vitaliy Fedorovich — D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology. 199034, Saint Petersburg, Mendeleyevskaya Liniya, 3, Russia. E-mail: bez-vitaly@yandex.ru.
Tsypurdeyeva Anna Alekseyevna — D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology. 199034, Saint Petersburg, Mendeleyevskaya Liniya, 3, Russia. E-mail: iagmail@ott.ru.
