CC BY
149
Химия растительного сырья. 2014. №2. С. 115-119. DOI: 10.14258/jcprm.1402115
УДК 582.949.27:547.913:581.184.19 (470.44) (045)
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ЭФИРНОГО МАСЛА THYMUS MARSHALLIANUS WILLD. И THYMUS PALLASIANUS H. BR., ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ
© H.A. Дурнова, Ю.В. Романтеева , А.Н. Ковтун
Саратовский государственный медицинский университет
им. В.И. Разумовского, ул. Большая Казачья, 112, Саратов (Россия),
e-mail: [email protected]
Изучены качественный и количественный составы эфирного масла Thymus marschallianus Willd. и Th. pal-lasianus H.Br., произрастающих на территории Саратовской области. Максимальный выход эфирного масла составил у тимьяна Маршалла 1,38%, у тимьяна Далласа - 1,2%. В эфирном масле тимьяна Маршалла обнаружено 23 индивидуальных компонента, 22 из которых идентифицированы. В эфирном масле тимьяна Далласа обнаружено 20 индивидуальных компонентов, из них идентифицировано 19. Эфирное масло тимьяна Маршалла относится к фенольному типу (содержание тимола составляет 54,61%); эфирное масло тимьяна Далласа - к нефенольному типу (содержание у-терпиненил ацетата - 48,5%, га/>аноа-терпинеола - 32,8%).
Ключевые слова: эфирное масло, тимьян Маршалла, тимьян Далласа.
Введение
Внимание исследователей издавна привлекает род Thymus L., представители которого являются источниками лекарственного сырья, обладающего широким спектром действия [1-10]. В медицинской практике используются лекарственное растительное сырье (ЛРС) тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и тимьяна ползучего (Th. serpyllium L.).
Для представителей рода Thymus L. характерен полиморфизм компонентного состава эфирных масел как на межвидовом, так и на внутривидовом уровне. Например, в эфирных маслах тимьянов различных видов северных широт карвакрола (21-37%) содержится больше, чем тимола (10-17%) [11]. Также известен хемотип масла тимьяна с содержанием порядка 33% линалоола и его ацетата [11]. Для тимьяна блошиного (Th. pulegioides) авторы указывают на наличие восьми его хемотипов, различающихся составом эфирного масла [12]. На территории Алтая выявлено два хемотипа Th. serpyllum, в которых варьирует соотношение тимола, карвакрола и неролидола [13]. В Поволжье изучены представители рода Thymus L., произрастающие только в Волгоградской области. Для этого региона выявлены виды тимольного хемотипа (Th. marschallianus, Th. kirgisorum) с содержанием тимола от 30 до 65% и виды со значительным количеством нераля, гераниаля, гераниола (Th. calcareous, Th. kirgisorum var creticola) [14].
Дурнова Наталья Анатольевна - заведующая На территории Саратовской области произ-
кафедрой общей биологии, фармакогнозии и растает пять видов тимьяна (Th cimicinus Blum ex
ботаники, доктор биологических наук, доцент, Ledeb, Th. guberlinensis Iljin., Th. marschallianus
тел.: (8452) 66-97-40, e-mail: [email protected] Willd., Th. pallasianus H.Br, Th. zheguliensis Klok. et
РомантееваЮлияВикторовна - доцент кафедры ShoSt). Наиболее распространены два вида: Th.
общей биологии, фармакогнозии и ботаники, , „. ... Г1_
, marschallianus и Th. pallasianus 115, 161, которые
кандидат фармацевтических наук, Г г
тел.: (8452) 66-98-12, e-mail: [email protected] мал0 изучены для данного региону имеются только
Ковтун Анна Николаевна - ассистент кафедры предварительные данные обих химическом составе
общей биологии, фармакогнозии и ботаники, [17] и фармакологической активности [18].
тел.: (8452) 66-98-12, e-mail: [email protected]
* Автор, с которым следует вести переписку.
116
Н.А. Дурнова, Ю.В. Романтеева, А.Н. Ковтун
Целью данной работы является исследование качественного и количественного составов эфирных масел Th. marschallianus и Th. pallasianus, произрастающих в условиях Саратовской области.
Экспериментальная часть
Для получения эфирного масла в период массового цветения собирали вручную надземную часть растений тимьяна Маршалла и тимьяна Палласа, произрастающих в Саратовской области (в окрестностях с. Поповка Саратовского района и с. Узморье Энгельсского района) в 2011 г. Собранное сырье сушили в сухом, хорошо проветриваемом, прохладном месте в течение трех суток. Эфирное масло получали методом 1 (ГФ XI, вып. 1, с. 290).
Качественный и количественный анализы эфирных масел тимьяна Маршалла и тимьяна Палласа проводили методом хромато-масс-спектрометрии на газовом хроматографе Finnigan модель Trace DSQ с квадрупольным масс-спектром в качестве детектора.
Использовалась 30-метровая TR-5MS с внутренним диаметром 0,32 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Расчет процентного состава эфирного масла производили по площадям газо-хроматографических пиков без использования корректирующих коэффициентов. Качественный анализ основан на сравнении полных масс-спектров с соответствующими данными компонентов и данными библиотеки масс-спектрометрических данных NIST и Wiley [19, 20].
Обсуждениерезультатов
В ходе работы из надземной части Th. marschallianus и Th. pallasianus выделены эфирные масла прозрачного темно-желтого цвета с приятным специфическим запахом. Выход масла из надземной части тимьяна Маршалла составил 0,914±0,128%, что немного меньше, чем у этого вида в Волгоградской области (1,59%) [10, 14] и в Казахстане (1,55-2,26%) [21]. В тимьяне Палласа содержание эфирного масла составляет 1,09±0,128%, что сопоставимо с количеством маслау этого вида в Волгоградском регионе (0,7-1,24%) [10, 14]. Методом хромато-масс-спектрометрии идентифицирована и количественно определена большая часть компонентов эфирных масел обоих видов. Результаты анализа приведены в таблице.
В эфирном масле тимьяна Маршалла обнаружено 23 индивидуальных компонента, 22 из которых идентифицированы, содержание соединения неизвестной структуры составляет 2,65%.
Основными компонентами эфирного масла Th. marschallianus являются ароматические монотерпены: и-цимен (20,99%) и тимол (54,61%) на фоне очень малого количества карвакрола (2,92%), следовательно, эфирное масло тимьяна Маршалла можно отнести к фенольному типу. Суммарная доля основных компонентов в масле составила 75,60%. Относительно базовых компонентов эфирное масло тимьяна Маршалла сходно по химическому составу с эфирным маслом тимьяна обыкновенного и тимьяна ползучего, основными веществами эфирных масел которых являются тимол, карвакрол, и-цимен. Аналогичное содержание тимола в эфирном масле тимьяна Маршалла Волгоградской области (49-55%), хотя и с меньшим содержанием и-цимена (7-9%) [10, 14], в эфирном масле Th. marschallianus, произрастающего в Казахстане, тимола содержится 42,47-70,91%, при этом карвакрол, и-цимен не обнаруживаются [21]. Также достаточно высокое содержание тимола (46,9%) обнаруживается у тимьяна гобийского, произрастающего в Монголии [22].
В эфирном масле тимьяна Палласа обнаружено 20 индивидуальных компонентов, из них идентифицировано 19, содержание соединения неизвестной структуры составляет 3,4%.
Основными компонентами эфирного масла Th. pallasianus являются моноциклические монотерпены: а-терпиненил ацетат (48,5%) и даранс-а-терпинеол (32,8%), в связи с этим масло тимьяна Палласа можно отнести к нефенольному типу. Суммарная доля доминирующих компонентов в масле составила 81,3%. Высокое содержание монотерпеновых спиртов может отвечать за антисептическое действие эфирного масла Th. pallasianus [23]. В малых количествах содержатся тимол (0,40%) и карвакрол (0,10%). Низкое содержание ароматических монотерпенов обнаруживается в сырье Th. pallasianus Волгоградской области [10, 14], Th. talijevii, произрастающего на территории Республики Коми [24], Th. petraeus из Республики Хакасии [23].
Для обоих видов тимьяна, изученных нами, характерно небольшое содержание сесквитерпеноидов, из которых общим компонентом является спатуленол (табл.). Из монотерпеновой фракции и в тимьяне Маршалла, и в тимьяне Палласа встречается линалоол, содержание которого в Th. pallasianus в 6 раз больше, чем в другом виде.
Состав образцов эфирного масла тимьяна Маршалла и тимьяна Палласа
№ п/п Название компонента Время удерживания, мин Содержание компонента в % от суммы цельного эфирного масла
Тимьян Маршалла Тимьян Палласа
1. а-терпиненил ацетат 2,50 - 48,50
2. и-цимен 6,46 20,99 -
3. ^иоа-терпинеол 6,56 - 2,50
4. а-терпинен 7,44 3,83 -
5. камфора 8,25 - 0,40
6. линалоол 9,30 1,04 6,50
7. борнеол 11,56 1,91 -
8. терпинеол-4 11,77 2,33 -
9. вещество А неизвестной структуры 12,11 - 3,40
10. и-мент-1 -ен-8-ол 12,36 0,42 -
11. Вещество Б (С12Н220) 13,37 2,65 -
12. га^акс-а-терпинеол 16,15 - 32,8
13. 7-муролен 16,30 - 0,70
14. Е-цитраль 16,66 - 0,70
15. гераниол 16,96 0,99 1,30
16. геранил ацетат 17,30 - 0,90
17. ацетилтимол 17,47 0,12 -
18. а-копаен 18,31 0,10 -
19. нерол 18,44 - 0,20
20. гераниола ацетат 18,49 0,19 -
21. га^акс-карвеол 19,29 - 0,07
22. кариофиллен 19,81 1,25 -
23. 2-хлоро-4,6-ди(2-тиазолил)-пиримидин 20,43 0,63 -
24. тимол 21,46 54,61 0,40
25. т-муролен 21,62 0,41 -
26. карвакрол 21,81 2,92 0,10
27. гермакрен-Д 21,84 0,18 -
28. леден 22,13 0,50 -
29. кариофиллена оксид 22,52 - 0,10
30. Р-бизаболен 22,64 1,58 -
31. Р-кадинен 22,88 0,21 -
32. 5-кадинен 22,99 0,56 -
33. гумулен 23,64 0,34 -
34. неролидол 24,06 - 0,85
35. хедикариол 24,74 - 0,10
36. спатуленол 25,60 0,71 0,20
37. т-кадинол 26,52 - 0,10
38. ледена оксид 29,92 - 0,05
Выявленные различия в химическом составе эфирных масел изучаемых нами тимьянов могут быть обусловлены как генетическими особенностями видов [25], так и экологическими условиями произрастания этих растений [10]. Известно, что тимьян Маршалла произрастает в степях, на сухих полянах и опушках, а тимьян Палласа - в черноземной зоне на приречных песках, в песчаных степях [15, 16]. В Волгоградской области тимьян Маршалла встречен на супесчаных почвах [10], тимьян Палласа - на песках, по склонам степных балок и пр. [10]. В Саратовской области П. marschaШanus встречается на разных типах почв, в частности материал для нашего исследования собран на каштановых почвах в окрестностях с. Узморье Энгельсского района. Сырье П. pallasianus нами заготовлено на песчаных обнажениях в окрестностях с. Поповка Саратовского района. В дальнейшем необходимо продолжить изучение качественного и количественного составов эфирного масла тимьяна Машалла и тимьяна Палласа Саратовского региона, собранных в разные фазы вегетации, а также динамику накопления эфирного масла в ЛРС этих видов.
Эфирные масла исследуемых нами видов близки по составу с эфирными маслами официнальных видов тимьянов, что требует более детального исследования фармакологических свойств ЛРС тимьяна Маршалла и тимьяна Палласа и открывает перспективу применения этих растений в фармацевтической отрасли.
Выводы
1. Выход масла из надземной части тимьяна Маршалла в фазе цветения составил 0,91±0,13%, для эфирного масла тимьяна Палласа - 1,09±0,13%.
2. В составе эфирного масла тимьяна Маршалла идентифицировано 20 компонентов, составляющих 95,82%. Основными компонентами эфирного масла являются: и-цимен (20,99%) и тимол (54,61%).
118
Н.А. Дурнова, Ю.В. Романтеева, А.Н. Ковтун
3. В составе эфирного масла тимьяна Палласа идентифицировано 19 компонентов с общей концентрацией 96,47%. В исследованном образце преобладают монотерпеновые соединения: а-терпиненил ацетат (48,5%), да^анс-а-терпинеол (32,8%), поэтому эфирное масло можно отнести к нефенольному типу.
Список литературы
1. Thyme: The genus Thymus. London ; New York, 2002. 330 p.
2. Ismaili H., Sosa S., Brkic D. et al. Topical anti-inflammatory activity of extracts and compounds from Thymus brous-sonettii // J. Pharmacy Pharmacology. 2002. Vol. 54, N8. Pp. 137-140.
3. Miura K., Kikuzaki H., Nakatani N. Antioxidant activity of chemical components from sage (Salvia officinalis L.) and thyme (Thymus vulgaris L.) measured by the oil stability index method // J. Agric Food Chem. 2002. Vol. 50, N7. Pp. 1845-1851.
4. Kulisic T., Dragovic-Uzelac V., Milos M. Antioxidant activity of aqueous tea infusions prepared from Oregano, Thyme and Wild Thyme // Food Technol. Biotechnol. 2006. Vol. 44, N4. Pp. 485-492.
5. Wang M., Kikuzaki H., Lin C.-C. et al. Acetophenone glycosides from thyme (Thymus vulgaris L.) // J. Agr. Food Chem. 1999. Vol. 47, N5. Pp. 1911-1914.
6. Broucke C.O., Lemli J.A. Spasmolytic activity of the flavonoids from Thymus vulgaris // Pharmacy World Science. 1983. Vol. 5, N1. Pp. 9-14.
7. Korayem M., Hasabo S., Ameen H. Effects and mode of action of some plant extracts on certain plant parasitic nematodes // J. Pest. Science. 1999. Vol. 66, N2. Pp. 32-36.
8. Couladis M., Tzakou O., Kujundzic S., Sokovic M., Mimica N. Chemical analysis and antifungal activity of Thymus striatus // Phytother. Research. 2004. Vol. 18, N1. Pp. 40-42.
9. Kahkonen M.P., Hopia A.I., Vuorela H.J. et al. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic // J. Agric. Food Chem. 1999. N47. Pp. 3954-3962.
10. Кулакова Ю.Ю. Ботанико-ресурсоведческая характеристика рода Thymus L. на территории Нижнего Поволжья : автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2011. 24 с.
11. Жигжитжапова С.В., Рабжаева А.Н., Звонцов И.В., Раднаева Л.Д. Химический состав эфирного масла тимьяна Байкальского Thimus baikalensis Serg., произрастающего в Забайкалье // Химия растительного сырья. 2008. №1. С. 73-76.
12. Моцкуте Д., Бернотене Г. Эфирное масло Thymus pulegioides L. с лимонным запахом из окрестностей Вильнюса // Растительныересурсы. 1998. Т. 34, вып. 1. С. 131-134.
13. Банаева Ю.А., Покровский Л.М., Ткачев А.В. Исследование химического состава эфирных масел представителей рода Thymus L., произрастающих на Алтае // Химия растительного сырья. 1999. №3. С. 41-48.
14. Кулакова Ю.Ю., Зайко Л.Н., Дмитриев Л.Б., Дмитриева В.Л. Обзор рода Thymus L. на территории Нижнего Поволжья: экология, ресурсы, фитохимия сырья // Аграрная Россия. 2009. №1. С. 48-50.
15. Еленевский А.Г., Буланый Ю.И., Радыгина В.И. Конспект флоры Саратовской области. Саратов. 2008. 232 с.
16. Маевский П.Ф. Флора средней полосы европейской части России. 10-е изд. М., 2006. С. 440-441.
17. Ковалева Л.В. Определение химического состава эфирного масла травы тимьяна Маршалла и тимьяна Палласа // Материалы 73-й студенческой научно-практической конференции в рамках 1-й Всероссийской недели с международным участием, посвященной Дню российской науки «Молодые ученые - здравоохранению». Саратов, 2012. С. 331-332.
18. Ковалева Л.В., Райкова С.В. Изучение антимикробной активности действия эфирных масел тимьяна Маршалла и тимьяна Палласа // Материалы 72-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Саратов, 2011. С. 488-489.
19. Eight Peak Index of Mass Spectra; Royal Society of Chemistry: University of Notinham, England, Third Edition, 1983. Vol. 1-2.
20. McLafferty F.W., Stauffer D.B. The Wiley/ NBS Registry of Mass Spectral Data; Wiley-Interscience. 1989. Vol. 1-7.
21. Suleimenov E.M., Machmudah S., Ishmuratova M.Yu, Sasaki M., Goto M. Investigation of Kazakhstani flora. I. GC/MS analysis of Thymus marschallianus Willd essential oil obtained by supercritical C02 extraction // Химия растительного сырья. 2010. №1. С. 161-163.
22. Рабжаева А.Н. Особенности накопления биологически активных веществ Thymus baicalensis Serg. в зависимости от экологических факторов : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Улан-Удэ, 2011. 24 с.
23. Мяделец М.А., Домрачев Д.В., Водолазов С.В. Исследование химического состава эфирных масел Nepeta Sibirica L., Thymus Petraeus L. , Schizonepeta Multifida L., произрастающих на территории Республики Хакасия // Химия растительного сырья. 2012. №4. С. 119-124.
24. Алексеева Л.И., Груздев И.В. Полиморфизм эфирных масел тимьянов Европейского Северо-Востока России и Урала // Физиологиярастений 2012. Т. 59, №6. С. 771-780.
25. Thompson J.D., Chalchat J.- C., Michet A., Linhart Y. B., Ehlers B. Qualitative and quantitative variation in mono-terpene co-occurrence and composition in the essential oil of Thymus vulgaris chemotypes // Journal of Chemical Ecology. 2003. Vol. 29, N4. Pp. 859-880.
Поступило в редакцию 24 апреля 2013 г.
После переработки 24 октября 2013 г.
Durnova N.A., Romanteeva Y.V.*, Kovtun A.N. THE CHEMICAL COMPOSITION OF THE ESSENTIAL OIL OF THYMUS MARSHALLIANUS WILLD. AND THYMUS PALLASIANUS H. BR., GROWING IN THE SARATOV REGION Saratov State Medical University named after V. I. Razumovsky, Bolshaya Kazachia st., 112, Saratov (Russia), e-mail: yuliyarom81@mail. ru
The qualitative and quantitative composition of essential oil of Thymus marschallianus Willd. and Th. pallasianus
H.Br., from Saratov region was studied. The maximum yield of Th. marschallianus essential oil was 1,38%, Th. pallasianus -
I,2%. In the Th. marschallianus essential oil 23 components were found, 22 of them were identified. In the Th. pallasianus essential oil 20 individual components were revealed, with 19 of them identified. The essential oil of Th. marschallianus was labeled as phenolic subtype (contents 54,61% of thymol); the essential oil of Th. pallasianus - as nonphenolic subtype (contents 48,5% of y-terpinenil acetate, 32,8% of trans-a-terpineol).
Keywords: essential oil, Thymus marshallianus Willd., Thymus pallasianus H. Br.
References
1. Thyme: The genus Thymus. London, New York, 2002. 330 p.
2. Ismaili H., Sosa S., Brkic D. et al. J. Pharmacy Pharmacology, 2002, vol. 54, no. 8, pp. 137-140.
3. Miura K., Kikuzaki H., Nakatani N. J. Agric Food Chem., 2002, vol. 50, no. 7, pp. 1845-1851.
4. Kulisic T., Dragovic-Uzelac V., Milos M. Food Technol. Biotechnol., 2006, vol. 44, no. 4, pp. 485-492.
5. Wang M., Kikuzaki H., Lin C.-C. et al. J. Agr. Food Chem, 1999, vol. 47, no. 5, pp. 1911-1914.
6. Broucke C.O., Lemli J.A. Pharmacy World Science, 1983, vol. 5, no. 1, pp. 9-14.
7. Korayem M., Hasabo S., Ameen H. J. Pest. Science, 1999, vol. 66, no. 2, pp. 32-36.
8. Couladis M., Tzakou O., Kujundzic S., Sokovic M., Mimica N. Phytother. Research, 2004, vol. 18, no. 1, pp. 40-42.
9. Kahkonen M.P., Hopia A.I., Vuorela H.J. et al. J. Agric. Food Chem, 1999, no. 47, pp. 3954-3962.
10. Kulakova Iu.Iu. Botaniko-resursovedcheskaia kharakteristika roda Thymus L. na territorii Nizhnego Povolzh'ia : avtoref. dis. ... kand. biol. nauk. [Botanical and resursovedcheskaya characteristic kind of Thymus L. in the territory of the Lower Volga region: the dissertation author's Ph.D. in Biology]. Moscow, 2011, 24 p. (in Russ.).
11. Zhigzhitzhapova S.V., Rabzhaeva A.N., Zvontsov I.V., Radnaeva L.D. Khimiia rastitel'nogo syr'ia, 2008, no. 1, pp. 73-76. (in Russ.).
12. Motskute D., Bernotene G. Rastitel'nye resursy, 1998, vol. 34, no. 1, pp. 131-134. (in Russ.).
13. Banaeva Iu.A., Pokrovskii L.M., Tkachev A.V. Khimiia rastitel'nogo syr'ia, 1999, no. 3, pp. 41-48. (in Russ.).
14. Kulakova Iu.Iu., Zaiko L.N., Dmitriev L.B., Dmitrieva V.L. Agrarnaia Rossiia, 2009, no. 1, pp. 48-50. (in Russ.).
15. Elenevskii A.G., Bulanyi Iu.I., Radygina V.I. Konspekt flory Saratovskoi oblasti. [Synopsis of the flora of the Saratov region]. Saratov. 2008, 232 p. (in Russ.).
16. Maevskii P.F. Flora srednei polosy evropeiskoi chasti Rossii. [Flora of the middle belt of the European part of Russia]. Moscow, 2006, pp. 440-441. (in Russ.).
17. Kovaleva L.V. Materialy 73-i studencheskoi nauchno-prakticheskoi konferentsii v ramkakh 1-oi Vserossiiskoi nedeli s mezhdunarodnym uchastiem posviashchennykh dniu rossiiskoi nauki «Molodye uchenye - zdravookhraneniiu». [Proceedings of the 73rd student scientific conference in the framework of the 1st All-Russian Week with international participation on the Day of Russian Science «Young scientists - Health Care»]. Saratov, 2012, pp. 331-332. (in Russ.).
18. Kovaleva L.V., Raikova S.V. Materialy 72-i mezhregional'noi nauchno-prakticheskoi konferentsii studentov i mo-lodykh uchenykh s mezhdunarodnym uchastiem. [Proceedings of the 72th inter-regional scientific-practical conference of students and young scientists with international participation]. Saratov, 2011, pp. 488-489. (in Russ.).
19. Eight Peak Index of Mass Spectra; Royal Society of Chemistry: University of Notinham, England, Third Edition, 1983, vol. 1-2.
20. McLafferty F.W., Stauffer D.B. The Wiley/ NBS Registry ofMass Spectral Data; Wiley-Interscience. 1989, vol. 1-7.
21. Suleimenov E.M., Machmudah S., Ishmuratova M.Yu, Sasaki M., Goto M. Khimiia rastitel'nogo syr'ia, 2010, no. 1, pp. 161-163.
22. Rabzhaeva A.N. Osobennosti nakopleniia biologicheski aktivnykh veshchestv Thymus baicalensis Serg. v zavisimosti ot ekologicheskikh faktorov : avtoref. dis. ... kand. biol. nauk. [Features of accumulation of biologically active substances Thymus baicalensis Serg. depending on environmental factors: the dissertation author's Ph.D. in Biology]. Ulan-Ude, 2011, 24 p. (in Russ.).
23. Miadelets M.A., Domrachev D.V., Vodolazov S.V. Khimiia rastitel'nogo syr'ia, 2012, no. 4, pp. 119-124. (in Russ.).
24. Alekseeva L. I., Gruzdev I. V. Fiziologiia rastenii, 2012, vol. 59, no. 6, pp. 771-780. (in Russ.).
25. Thompson J.D., Chalchat J.-C., Michet A., Linhart Y. B., Ehlers B. Journal of Chemical Ecology, 2003, vol. 29, no. 4, pp. 859-880.
Received April 24, 2013 Revised October 24, 2013
* Corresponding author.
