CC BY
422016, т. 6, №1 (21)
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
УДК 543.95:615.074: 615.076.7
ХИМИЧЕСКИЙ И БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ЭКСТРАКТОВ СОЛОДКИ ГОЛОЙ
Н. В. Наумова, Е. Д. Мельникова, С. Л. Сафронюк, И. Е. Цокало, А. М. Кацев
Кафедра медицинской и фармацевтической химии
Медицинская академия имени С. И. Георгиевского
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского»
Адрес переписки: бул. Ленина, 5/7, г. Симферополь, 295006, Республика Крым, Российская Федерация
E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
С использованием физико-химических и биологических методов исследованы водные и этанольные (50% и 70%) экстракты корня солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.), произрастающей в Крыму. Показано, что применение спиртовых растворителей приводит к увеличению выхода биологически активных веществ и более высокой неспецифической антибактериальной активности экстрактов.
CHEMICAL AND BIOLOGICAL BIOLUMINESCENT ANALYSIS OF GLYCYRRHIZA
GLABRA EXTRACTS
N. V. Naumova, E. D. Melnikova, S. L. Safronyuk, I. Ye. Tsokalo, A. M. Katsev
SUMMARY
Some aqueous and ethanolic (50% and 70%) extracts of licorice root (Glycyrrhiza glabra L.), growing in Crimea region, were studied using physico-chemical methods and biological luminescent bacteria biotests. It was revealed that the application of alcohol-based solvents led to an increased yield of biologically active substances and a higher non-specific antibacterial activity of extracts.
Ключевые слова: Glycyrrhiza glabra L., корень солодки, биотестирование, люминесцентные
бактерии.
Препараты солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) обладают разносторонней биологической активностью. Корни и корневища солодки широко используются в медицине благодаря противовоспалительному, антибактериальному, спазмолитическому, гиполипидемическому действию, а также влиянию на водно-солевой обмен и гормональную систему. Резаный корень входит в состав слабительных, мочегонных и грудных сборов [1, 2, 3]. Основной группой веществ, оказывающих перечисленные эффекты, являются сапонины [3, 4]. Помимо них в сырье солодки содержится большое число флавоновых гликозидов (астрагалин, ликви-ритин, ликвиритигенин, ликвиритозид, изо-ликвиритрин, глаброн, глабридин, глаброзид и др.) [3, 5, 6]. Это требует детального изучения их активности и возможности изолированного применения в лекарственных средствах.
Целью работы был химический и биологический анализ экстрактов произрастающей в Крыму солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экстракты корня солодки Glycyrrhiza glabra L. получали с использованием в качестве растворителей, воды, и водно-спиртовых смесей с содержанием спирта 50% и 70%. Экстракцию про-
водили при нагревании на водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение 30 мин.
Для исследования полученных экстрактов на содержание флавоноидов использовались стандартные качественные реакции: циани-диновая проба, реакция с солями железа (III), с 2-5% раствором алюминия хлорида, с 10% раствором щелочи, с ацетатом свинца и бор-но-лимонная реакция с реактивом Вильсона.
Отличия в составе получаемых экстрактов оценивали с помощью метода ВЭЖХ на хроматографе Varian (USA), с колонкой С-18. В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил-вода 1:1 со скоростью потока 1 мл/мин. Детекцию результатов хроматографии проводили по оптической плотности при длине волны 254 нм.
Спектральные исследования экстрактов проводили на спектрофотометре СФ-2000, (ЛОМО, Россия) в 1 см кварцевых кюветах, используя воду в качестве контроля. Для обнаружения флавоно-идов применяли дифференциальную спектро-фотометрию в присутствии AlCl3, анализируя поглощение в области длин волн 400 - 450 нм [7].
Данные хроматографии и спектрофотометрии обрабатывались программой Microsoft Excel.
Для биологических испытаний в качестве тест-обьектов использовали морские биолюминесцентные бактерии Photobacterium leiognathi
Sh1 из коллекции Медицинской академии Крымского федерального университета [8]. Методика биотестирования была описана ранее [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты проведенных c экстрактами Glycyrrhiza glabra L. качественных реакций позволили предположить наличие в сырье солодки голой, собранном в Крыму, окисленных форм флавоноидов: флавонов и флавонолов. Реакция с реактивом Вильсона позволила исключить присутствие в экстракте фуранох-
ромонов. Образование в реакции со щелочью желтого окрашивания, переходящего в коричневое при нагревании, дало возможность предположить, что в сырье солодки голой присутствуют такие классы флавоноидов, как фла-воны, флавононы и флавононолы, а также отметить отсутствие халконов и ауронов [3, 6].
Исследование спектров поглощения образцов, представленных на рис. 1, показало наличие основного пика при 265-270 нм, соответствующего сапонинам - глицирри-зиновой кислоте и ее производным [4, 7].
Рис. 1. Спектры поглощения экстрактов корня солодки при использовании различных экстрагентов: 1 -вода; 2 - 50%-й этанол; 3 - 70-й этанол. Разведение экстрактов 1:500.
Также появление пика на 420 нм в присутствии А1С13 свидетельствовало о. присутствие в экстрактах флавоноидов, основным из которых считается ликуразид [5, 7], рис. 2. Отмечено, что экстракция 70%-м этанолом позволяет получить больший выход биологически активных веществ, при сохранении общей формы спектров поглощения, рис.1, 2. Использование 50% и 70%
этанола в качестве экстрагентов также давали сходный выход флавоноидов, о чем свидетельствуют результаты дифференциальной спектро-фотометрии в присутствии А1С13, представленные на рис.2. Увеличения оптической плотности при 420 нм в присутствии ионов алюминия составили для водного, 50%-го и 70%-го экстрактов, соответственно 0,08, 0,24 и 0,26 единиц.
Рис. 2. Дифференциальная спектрофотометрия экстрактов корня солодки: А - водный экстракт; Б - 50%-й этанольный экстракт; В - 70%-й этанольный экстракт. 1 - спектр поглощения без добавления А1С13; 2 -
спектр поглощения при добавлении А!С1.
Данные ВЭЖХ водного (1) и водно-спиртового 70%-го (2) экстрактов представлены на рис. 3. На хроматограммах 1 и 2 наблюдались одинаковые пики со временем выхода 1 1,3 мин и 2,2 мин. Также как и по данным спектрального анализа, содержание экстрагируемых веществ в водно-спиртовых образцах было приблизительно в 3 раза выше, чем в водных вытяжках. Однако, несмотря на схожесть спек-
тров поглощения, хроматограммы водных и водно-спиртовых экстрактов имели некоторые отличия. 70%-й спиртовый экстракт характеризовался наличием второго пика (1=1,8 мин), который не наблюдался на хроматограмме водного экстракта. Кроме того, водный экстракт содержал дополнительные компоненты, которые элюировались между 3-й и 5-й мин и не присутствовали в водно-спиртовых образцах.
Рис. 3. ВЭЖХ хроматограмма водного (1) и водно-спиртового (70%) (2) экстрактов корня солодки.
Биологическое (биоцидное) действие препаратов солодки было изучено с помощью биолюминесцентного метода на основе бактерий P leiognathi Sh1 [8, 9]. Данный тест позволяет быстро оценить комплексное воздействие, связанное с действием многих антибактериальных и токсических факторов. Обнаружено, что все образцы ингибировали биолюминесценцию, с усилением эффекта от водного к 70%-му спир-
товому экстрактам, рис. 4. Действующие разведения 50%-го и 70%-го водно-спиртовых экстрактов, ингибирующие биолюминесценцию на 50% (ЭК ), составили 0,034 и 0,01 соответственно. Водный экстракт оказывал незначительное действие на бактериальную биолюминесценцию, вызывая ее снижение до 76%, при минимальном используемом разведении 1:20 (0,05), что не дало возможности определить ЭК50
Рис. 4. Действие экстрактов корня солодки на биолюминесценцию бактерий P. 1е^паШ Sh1
В этих же условиях, при тех же разведениях, сами растворители (50%-е и 70%-е водно-спиртовые смеси), как показано на рис. 5, оказывали
лишь незначительное действие на бактериальную биолюминесценцию и, таким образом, не могли вызвать отмеченные биологические эффекты.
Действие этанола на биолюминесценцию бактерий P. leiognathi Sh1
Рис. 5.
ВЫВОДЫ
1. Комплексное изучение водных и водно-спиртовых экстрактов корня солодки позволяет заключить, что использование спиртовых экстрагентов предпочтительней из-за большего выхода, как сапонинов, так и флавоноидов.
2. Показано, что водно-спиртовые вытяжки из корня солодки обладают более выраженным неспецифическим антибактериальным действием, чем водные экстракты.
3. Сходные результаты спектральных и биологических исследований дают основание
рассматривать биолюминесцентный метод анализа на основе морских светящихся бактерий, как перспективный метод исследования и стандартизации растительного сырья.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rauchensteiner F. Matsumura Y., YamamotoaY., Yamaji S., Tani T. Analysis and comparison of Radix Glycyrrhizae (licorice) from Europe and China by capillary-zone electrophoresis (CZE). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005;38:594-600.
2016, т. 6, №1 (21)
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
2. Sang Chan Kima, Sung Hui Byunb, Chae Ha Yang, Chul Young Kima, Jin Woong Kima, Sang Geon Kim. Cytoprotective effects of Glycyrrhizae radix extract and its active component liquiritigenin against cadmium-induced toxicity (effects on bad translocation and cytochrome c-mediated PARP cleavage. Toxicology. 2004;197:239-251
3. Hosseinzadeh H., Nassiri-Asl M. Pharmacological Effects of Glycyrrhiza spp. and Its Bioactive Constituents: Update and Review. Phytother Res. 2015;29(12):1868-1886.
4. Zhongping John Lina, Sheng-Xiang Qiub, Aisya Wufuera, Linyee Shuma. Simultaneous determination of glycyrrhizin, a marker component in radix Glycyrrhizae, and its major metabolite glycyrrhetic acid in human plasma by LC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 2005;814:201-207.
5. Tao Bo, Ke An Li, Huwei Liu. Fast determination of flavonoids in Glycyrrhizae radix by capillary zone electrophoresis. Analytica Chimica Acta. 2002;458:345-354.
6. Tolstikov G.A., Baltina L.A., Grankina V.P., Kondratenko R.M., Tolstikova T.G. Solodka: bioranoobrazie, khimiia, primenenie v meditsine. Novosibirk Akademicheskoe izdatel'stvo «Geo». 2007; 311 p.
7. Kurkin V.A., Egorov. M.V. Standardization of Glycyrrhiza glabra L. roots and pharmaceutical "glycyrrhizae liquid extract". Fundamental research. 2014;6:1232-1236.
8. Katsev A.M. New thermophilic luminescent bacteria isolated from Azov sea. Tavricheskiy Mediko-Biologicheskiy Vestnik. 2014;17(2): P. 59-64.
9. Maligina V.Yu., Katsev A.M. Luminous bacteria from the Black sea and the Sea of Azov. Ekologiya Morya. 2003;64:18-23.
