CC BY
7УДК: 577.112.083
ХИМИЧЕСКИ СТАБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ КРАСНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ С БОЛЬШИМ СТОКСОВЫМ СДВИГОМ
DOI
Субач О. М.Власкина А. В.Агапова Ю. К. Самыгина В. Р.12, Субач Ф. В.1
1 НИЦ Курчатовский Институт, Москва, Россия
2 ФНИЦ Кристаллография и Фотоника РАН, Москва, Россия e-mail: subach_fv@nrcki.ru
Аннотация: Разработаны два новых красных флуоресцентных белка с большим Стоксовым сдвигом, называемые LSSmScarlet2 и LSSmScarlet3, более фотостабильные и химически устойчивые, чем исходный белок LSSmScarlet. LSSmScarlet3 был в 2.2 раза ярче в лизосомах в составе фью-жен-белка LAMP3, чем LSSmScarlet. Получена кристаллическая структура LSSmScarlet2.
Ключевые слова: LSSRFP; разработка белков; красная флуоресценция, рентгеноструктурный анализ.
Текст сообщения
Генетически кодируемые красные флуоресцентные белки с большим Стоксовым сдвигом (LSSRFP) имеют разницу между максимумами возбуждения и испускания более 100 нм. Они эффективно возбуждаются синим светом, излучая при этом красную флуоресценцию. LSSRFP обеспечивают отдельный цвет флуоресценции для многоцветной флуоресцентной микроскопии и могут использоваться для одновременной визуализации нескольких процессов в живых клетках [1]. Эти белки имеют длину волны возбуждения аналогичную обычным зеленым флуоресцентным белкам и, следовательно, позволяют проводить двухцветную визуализацию как LSSRFP, так и зеленых флуоресцентных белков с использованием одно- или двух-фотонного микроскопа. Недавно мы разработали LSSRFP LSSmScarlet. Этот LSSRFP характеризовался двумя значениями pKa при рН 1,9 и 5,8 [2]. В данной работе создано два белка LSSmScarlet2 и LSSmScarlet3, характеризующихся одиноч-
ным рКа 2.18—2.19. Кроме того, оба Ь88КБР были в 1,5—1,6 раза более фотостабильными и более химически устойчивыми, чем Ь88ш8еаг1е1. Ь88ш8еаг1е12 и Ь88ш8еаг1е13 созревали в 1,8 раза быстрее и в 3 раза медленнее, чем Ь88ш8еаг1е^ соответственно. Благодаря более высокой рН-стабильности и более быстрому созреванию Ь88ш8еаг1е13-ЬЛМР3 фьюжн-белок был в 2,2 раза ярче, чем Ь88ш8еаг1е^ЬЛМР3 в лизосомах живых животных клеток. Белки были успешно применены для конфокальной визуализации структурных белков в живых животных клетках. Также была решена кристаллическая структура белка Ь88ш8еаг1е12 с разрешением 1,41А с использованием синхротронного излучения (Рис. 1). Направленный мутагенез белка Ь88ш8еаг1е12 на основе анализа структуры позволил выявить роль остатка Т74 в улучшении его рН и химической стабильности.
Рис. 1. Общая структура LSSmScarlet2.
Работа выполнена в рамках темплана НБИКС-пт НИЦ
Курчатовский Институт.
Список литературы:
1. Chudakov D. M., Matz M. V., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological reviews 2010, 90, (3), 1103—63.
2. Subach O. M., Vlaskina A. V., Agapova Y. K., Dorovatovskii P. V., Ni-kolaeva A. Y., Ivashkina O. I., Popov V. O., Piatkevich K. D., Khren-ova M. G., Smirnova T. A., Boyko K. M., Subach F. V. LSSmScarlet,
dCyRFP2s, dCyOFP2s and CRISPRed2s, Genetically Encoded Red Fluorescent Proteins with a Large Stokes Shift. Int J Mol Sci. 2021, 22 (23), 12887.
CHEMICALLY STABLE GENETICALLY ENCODED RED FLUORESCENT PROTEINS WITH A LARGE STOKES SHIFT
Subach O. M. 1, Vlaskina A. V. 1, AgapovaYu. K. 1, Samygina V. R. and Subach F. V. 1
1 Complex of NBICS Technologies, National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia;
2 Institute of Crystallography of Federal Research Scientific Center "Crystallography and Photonics" of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
e-mail: subach_fv@nrcki.ru
Abstract: New LSSmScarlet2 and LSSmScarlet3 red fluorescence proteins with a large Stokes shift were developed. Proteins were more photostable and had enhanced chemical stability as compared to the LSSmScarlet progenitor. LSSmScarlet3 in fusion with LAMP3 protein was 2.2-fold brighter than LSSmScarlet in lysosomes of live mammalian cells. Crystal structure of LSSmScarlet2 was solved.
Key words: LSSFP; protein engineering; red fluorescent; X-ray analysis
