CC BY
107
Химия растительного сырья. 2001. №2. С. 69-81.
УДК 577.175.27:577.352.24
ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ 20-ГИДРОКСИЭКДИЗОНА И ИССЛЕДОВАНИЕ МЕМБРАНОТРОПНЫХ СВОЙСТВ ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ
© Н.К. Политова, Л.А. Ковлер, В.В. Володин, В.Г. Лукша, Е.А. Пшунетлева
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, ул. Коммунистическая, 28, Сыктывкар, 169280 (Россия) e-mail: volodin@ib.komisc.ru
Экдистероиды - класс стероидов природного происхождения, структурно близких гормонам линьки членистоногих и обладающих высокой биологической активностью на млекопитающих. Ацильные производные экдистероидов представляют интерес для разработки медицинских препаратов ранозаживляющего действия, эффективность которых значительно повышается при включении в липосомы. Целью работы являлся синтез ацильных производных 20-гидроксиэкдизона, обладающих сродством к липидным бислоям, и получение на их основе липосом с высоким содержанием экдистероидов. В результате проведенных исследований была разработана новая схема получения производных 20-гидроксиэкдизона с карбоновыми кислотами по 22-му или 25-му положениям боковой цепи. Получен ряд производных, отличающихся числом, положением и природой заместителей. Среди них 22-ацетат и 2,3,22-трипальмитат синтезированы впервые, а также существенно увеличен выход 25-ацетата 20-гидроксиэкдизона по сравнению с известными данными. Впервые было исследовано сравнительное включение ацильных производных 20-гидроксиэкдизона в состав липосом и показана зависимость включения экдистероидов от числа, положения и природы замещающих групп. Показана лабильность ацильных производных экдистероидов в свободной и липосомальной форме по отношению к гидролитическим ферментам в экспериментах in vitro, позволяющая прогнозировать контролируемое высвобождение биологически активного вещества из липосом.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РГНТП "Новейшие методы биоинженерии " (грант №2-118).
Введение
Экдистероиды - класс стероидных веществ природного происхождения - привлекают интерес исследователей благодаря своей высокой биологической активности. Они представляют собой группу полигидроксистероидов, структурно близких экдизону - основному гормону линьки насекомых. В природе экдистероиды синтезируются беспозвоночными для контроля процессов, сопровождающихся сложной перестройкой организма, таких как линька, метаморфоз, диапауза (зооэкдистероиды). Соединения экдистероидной природы широко представлены и в растениях (фитоэкдистероиды). Наиболее часто встречаются экдизон и 20-гидроксиэкдизон (20Е), отличающийся дополнительной гидроксильной группой в 20-м положении (рис. 1).
Их содержание в некоторых видах растений довольно высоко и может составлять до 1-2% мас. на сухой вес, что на несколько порядков превышает содержание зооэкдистероидов в беспозвоночных [1].
* Автор, с которым следует вести переписку.
ОН
ОНЁ
Рис. 1. Структурная формула экдизона (Я=Н) и 20-гидроксиэкдизона (Я=ОН)
Считают, что экдистероиды в растениях выполняют защитную функцию, проявляя антифидантную активность по отношению к насекомым-фитофагам [2].
Физиологическое действие экдистероидов на млекопитающих обусловлено их свойством стимулировать биосинтез белка при отсутствии побочного гормонального эффекта [3]. Экдистероиды оказывают влияние на пролиферацию клеток позвоночных [3, 4], вызывают дифференциацию человеческих кератиноцитов и стимулируют их трансглутаминовую функцию [5], что способствует быстрому рубцеванию ран и трофических язв. Хорошо известны тонизирующие, адаптогенные и иммуномодулирующие свойства экдистероидов, продемонстрированные на примере 20Е в тестах на лабораторных животных [6].
Установлено, что производные экдистероидов также обладают высокой биологической активностью. Например, витикостерон Е из 8вгга(и1а согвп^а обладает широким спектром биологической активности (проявляет пестицидную активность, оказывает анаболический эффект, препятствует развитию экспериментального атеросклероза у кроликов и обладает эстрогенной активностью) [7]. Проведены исследования анаболической активности фитоэкдистероидов и их ацетатов, которые, предположительно, высвобождают активное соединение при гидролизе [8]. Таким образом, экдистероиды перспективны для использования в составе тонизирующих пищевых добавок и адаптогенных лекарственных препаратов; также для них показано антиоксидантное, противовоспалительное и ранозаживляющее действие, эффективность которого повышается при использовании в липосомальной форме [9, 10].
К настоящему времени в различных природных источниках обнаружены производные экдистероидов: сложные эфиры с карбоновыми и неорганическими кислотами, гликозидные производные по гидроксильным группам в ядре (С2, С3) и в боковой цепи (С22, С25) [11, 12]. Наибольший интерес среди природных конъюгатов представляют производные экдистероидов с карбоновыми кислотами, а именно 2-, 3-, 22- или 25-ацетаты, встречающиеся в растениях [7, 13], и 22-производные высших жирных кислот - олеиновой С18 : 1, стеариновой С:8 : 0, линолевой С:8 : 2, пальмитиновой С:6 : 0, обнаруженные в насекомых [14]. Производные экдистероидов и высших жирных кислот, по-видимому, являются важным классом экдистероидных метаболитов. С одной стороны, их можно рассматривать как продукты дезактивации экдистероидов, поглощенных насекомыми с пищей. С другой стороны, обнаружение жирнокислотных производных в яичниках и свежеотложенных яйцах насекомых приводит к заключению, что они являются запасной неактивной формой гормона. В ходе эмбриогенеза происходит высвобождение активной формы гормона для развивающегося организма, еще не способного вырабатывать его самостоятельно [2, 14]. Показано, что образование 22-производных 20Е и высших жирных кислот обратимо [15]. Они хранятся в вителлинах (липопротеиновых комплексах) яйцеклеток насекомых, где защищены от метаболизма. В случае необходимости при деградации вителлинов и
гидролизе производных внутриклеточными эстеразами в гемолимфу поступает активная форма гормона [2, 16].
Использование принципа обратимого конъюгирования экдистероидов, реализуемого в организме насекомых, представляется нам перспективным направлением для создания экдистероидсодержащих ранозаживляющих препаратов в липосомальной форме. Так как содержание ацильных производных экдистероидов в природных объектах как растительного, так и животного происхождения мало, целесообразно их получение методом химической модификации доступных фитоэкдистероидов.
Разнообразные производные экдистероидов привлекают внимание исследователей в связи с возможностью их использования в качестве стандартов в биохимических исследованиях по определению их роли в природных объектах (для идентификации нативных метаболитов, как модельные системы для изучения гидролитической устойчивости по отношению к ферментам), а также создания на их основе эффективных лекарственных препаратов.
Получение ацильных производных экдистероидов обычно проводят обработкой ангидридами и хлорангидридами кислот в органических растворителях (пиридин, диоксан, диметилформамид, тетрагидрофуран), их смесях, иногда в присутствии третичных аминов в качестве катализаторов [7, 11,
12, 15]. Так, при ацилировании 20Е в пиридине при 40оС 100-кратным избытком уксусного ангидрида в течение 4-х часов с последующим разделением продуктов реакции методом колоночной хроматографии (силикагель) авторами работы [7] были получены 2,3,22,25-тетраацетат (элюент - хлороформ, выход продукта 21%) и 2,3,22-триацетат 20Е (элюент - хлороформ, выход продукта 46%). Аналогичная методика приведена и в работе [17].
С целью количественной оценки различий в реакционной способности гидроксильных групп была исследована скорость их ацетилирования в различных производных 20-гидроксиэкдизона (экдистерона) [17]. Наиболее быстро ацетилируется 2р-гидроксигруппа 20Е из-за сравнительно незатрудненной экваториальной конформации. Кроме того, ацетилирование 2р-оксигруппы облегчается наличием соседней свободной оксигруппы. В свою очередь, С22-ОН является более реакционно-способной, чем С3-ОН [17].
Монопроизводные 20Е и Е с высшими жирными кислотами получают по реакции с ангидридами высших жирных кислот (ВЖК) в молярном соотношении 1 : 1. Авторы работы [15] провели реакцию 20Е с пальмитиновым ангидридом (1,4-кратный избыток). Методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии продукты были идентифицированы как 2-пальмитат (60%), 22-пальмитат (2,5%), а также следовые количества 3-пальмитата и дипальмитатов 20Е.
Для получения моноацетатов 20Е в боковой цепи используют предварительную защиту гидроксильных групп. Например, авторы [7] провели встречный синтез 25-ацетата 20Е с защитой диольных групп в положениях 2,3- и 20,22- в виде диизопропилиденового производного. В этой же статье [7] описан способ получения 25-ацетата через 2,3,22,25-тетраацетат 20Е. Для этого тетраацетат гидролизовали водным раствором гидрокарбоната калия с выходом 6,6%. Описан синтез 22-производных Е и ВЖК: лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой,
линоленовой, арахидоновой [18]. Для этого Е переводили в 2,3-изопропилиденовое производное и проводили ацилирование ангидридом жирной кислоты (1 00-кратный избыток). Выходы 22-производных Е с высшими жирными кислотами после гидролиза изопропилиденовой группы составили 50-55%.
В работе [19] описан синтез экдистероида с длинной боковой цепью на основе циастерона. Авторам удалось селективно защитить 20,22-диольную группу в виде фенилбората, а 2,3-диол - в виде изопропилиденового производного. По данным авторов, изопропилиденовая защитная группа устойчива в условиях, требуемых для удаления фенилборной группы, но легко гидролизуется под действием катионита в Н+-форме в смеси органических растворителей при комнатной температуре в течение трех дней [19].
Мы предположили, что применение такого метода для защиты диольных групп 20-гидроксиэкдизона позволит селективно провести химическую трансформацию его гидроксильных групп в положениях 22 или 25.
Одной из перспективных областей применения экдистероидов являются лекарственные средства для лечения ожоговых и других видов ран с выраженным антибиотическим, ранозаживляющим и противовоспалительным действием [20, 21, 22]. Известно, что при включении БАВ в липосомы в составе кремов и мазей наблюдается эффект увеличения их биологической активности, связанный с повышением локальной концентрации вещества в эпидермисе и верхних слоях дермиса [23]. Эксперименты по включению экдистероидов в липосомы проводились в рамках патентов [9, 10]. И хотя эффективность их включения не определялась, было показано увеличение ранозаживляющего эффекта 20-гидроксиэкдизона при его применении в составе липосомальной композиции в тестах на лабораторных животных. Поэтому для нас представляло интерес исследование включения в липосомы ацильных производных экдистероидов, различающихся числом, природой и положением замещающих групп.
Таким образом, целью работы являлся синтез ацильных производных 20-гидроксиэкдизона, обладающих сродством к липидным бислоям, и получение на их основе липосом с высоким содержанием экдистероидов. В задачи исследования входили:
- синтез ацильных производных 20-гидроксиэкдизона, отличающихся природой, числом и положением замещающих групп: 2-ацетата, 22-ацетата, 25-ацетата, 2,3,22-триацетата, 2,3,22,25-тетраацетата, 2,3,22-трипальмитата;
- сравнительная оценка включения в липосомы 20-гидроксиэкдизона и его ацильных производных;
- определение устойчивости ацильных производных 20-гидроксиэкдизона по отношению к гидролитическим ферментам в экспериментах in vitro.
Экспериментальная часть
20E выделен из листьев растений Serratula coronata L. (98% ВЭЖХ). Синтез соединений (2), (3), (4) и
(5) проводили методом прямого ацилирования 20E в соответствии с методиками [7, 17, 18]. Соединения
(6) и (7) получали по разработанной нами схеме (схема 1). Продукты реакций разделяли методом колоночной хроматографии (200x40 mm, silica gel L 100/250 |jm), элюент - метанол:хлороформ (0 до 100%), очищали ПВЭЖХ (4x250 mm, Diasorb 130/6 |jm, элюент гексан : изопропанол : вода 100 : 40 : 3, 254 nm). Структуры синтезированных продуктов подтверждали методом 1Н ЯМР-спектроскопии ("Bruker", 500 МГц).
МОВ получали методом гидратации сухой липидной пленки с последующей обработкой ультразвуком [24]. 20Е и его ацильные производные добавляли к навеске яФХ на стадии получения липидной пленки и приливали фосфатный буфер до конечной концентрации экдистероида 7% мас.
Гель-хроматографию проводили на колонке 0.85x20 cm, Bio-Gel P-2, элюент фосфатный буфер, pH 7.5, 4oC, для разделения фракции липосом от невключившегося вещества. Собранные фракции упаривали и анализировали методом ВЭЖХ (гексан : изопропанол : вода 100 : 40 : 3). Рассчитывали среднее арифметическое значение включения из трех повторов как отношение содержания вещества в липосомах после гель-хроматографии к общему содержанию вещества в липосомальной дисперсии.
Гидролиз 2,3,22,25-тетраацетата проводили комплексным препаратом ферментов Helix (Sygma Type H-1) с эстеразной активностью 342 дмоль/минЧг в фосфатном буфере, pH 5.8, 37oC. Анализ проводили методом ТСХ на пластинах Sorbfil UV, элюент хлороформ:метанол (9:1). Гидролиз 2,3,22-трипальмитата 20Е в мицеллярной и липосомальной форме проводили панкреатической липазой (липазная активность 3500 FIP U), отбираемые аликвоты анализировали методом ВЭЖХ.
Обсуждение результатов
Синтез аналогов гормонов линьки насекомых. В структуре 20-гидроксиэкдизона (рис. 1) содержится шесть гидроксильных групп; реакционная способность вторичных НО-групп в реакциях ацетилирования уменьшается в следующем ряду: С2 > С22 > С3 [17]. При ацилировании 20Е (1) большим избытком ангидрида карбоновой кислоты достаточно легко образуются его три- и тетра-производные. Так, при ацилировании 20Е 100-кратным избытком уксусного ангидрида нами были получены 2,3,22,25-тетраацетат (3) с выходом 63% и 2,3,22-триацетат (2) с выходом 31% (схема 1). Синтез 2,3,22-трипальмитата 20Е (4) (рис. 2) проводили в аналогичных условиях, используя 25-кратный избыток хлорангидрида пальмитиновой кислоты. Выход продукта реакции (4) составил 63%.
При эквимольном соотношении 20Е (1) и ацилирующего агента образуются смеси разнообразных продуктов, из которых хроматографическими методами можно выделить монопроизводные 20Е. Ацильная группа вводится преимущественно во второе положение стероидного ядра, в небольших количествах образуются также 22-моно-, ди- и поли-производные [17].
При соотношении 20Е и уксусного ангидрида 1 : 1 в качестве продуктов реакции мы получили смесь моно-, ди-, три- и тетраацетатов. Из этой смеси методом препаративной ВЭЖХ был выделен 2-ацетат (5) (рис. 2) с выходом 15%.
Синтез монопроизводных 20Е в боковой цепи с количественным выходом проводят при использовании эффективных методов защиты диольных групп через образование изопропилиденовых, боратных производных, а также ацетатов. Мы предположили, что применение двойной защиты диольных групп позволит нам селективно провести ацилирование 20Е по положениям 22 или 25 (схема 2).
Обработкой 20Е (1) фенилборной кислотой и последующей очисткой продукта методом колоночной хроматографии нами был получен 20,22-фенилборат 20Е (6) с выходом 95%. Диольную группу в положении 2,3 защищали в виде изопропилиденового производного, выдерживая 20,22-фенилборат (6) в абсолютном ацетоне в присутствии катализатора (и-ТСК) и 10-ти эквивалентов 2,2-диметоксипропана. После очистки методом колоночной хроматографии выход продукта реакции (7) составил 93%. Далее боратную группу удаляли обработкой перекисью водорода в тетрагидрофуране с образованием 2,3-изопропилидена 20Е (8). После очистки продукта методом препаративной ВЭЖХ выход (8) составил 58%.
О-Ас
Схема 1. Синтез 2,3,22-триацетата (2) и 2,3,22,25-тетраацетата (3) 20-гидроксиэкдизона
О-СО-ОбНэ1
ОН
Рис. 2. Структуры 2,3,22-трипальмитата (4) и 2-ацетата (5)
Согласно ряду реакционной способности, в случае 2,3-изопропилидена 20Е (8) ацилирование будет протекать преимущественно по гидроксильной группе при вторичном 22-м атоме углерода с образованием 2,3-изопропилидена-22-ацетата 20Е (9), в случае 2,3-изопропилидена-20,22-фенилбората
(7) - при третичном 25-м атоме углерода с образованием 2,3-изопропилидена-20,22-фенилбората-25-ацетата 20Е (11). Ацилирование проводили, обрабатывая соединения (7) и (8) уксусным ангидридом в пиридине.
Для введения ацетатной группы в 25-е положение был использован больший избыток (100:1) ацилирующего агента, чем в случае С22-ОН (10:1). Выход 2,3-изопропилидена-22-ацетата 20Е (9) составил 58%, а выход 2,3-изопропилидена-20,22-фенилбората-25-ацетата 20Е (11) - 90%. Удаление изопропилиденовой защиты было проведено под действием катионита в Н+-форме в смеси дихлорметан-метанол. Общий выход 22-ацетата (10) составил 22%, 25-ацетата (13) - 24%.
Подтверждение структур полученных соединений проводили методом :Н ЯМР-спектроскопии. Химические сдвиги сигналов протонов приведены в таблице.
Поскольку 25-ацетат 20Е (13) идентичен природному витикостерону Е, содержащемуся в экстрактах некоторых растений [7,25], его идентификацию проводили по временам удерживания в разных хроматографических системах, а также на основании температуры плавления.
Таким образом, были получены 2,3,22-триацетат, 2,3,22,25-тетраацетат, 2,3,22-трипальмитат, 2-ацетат, 22-ацетат и 25-ацетат 20-гидроксиэкдизона.
Схема 2. Получение ацильных производных 20Е (1 ) по положениям 22 или 25
Химические сдвиги протонов (м.д.) 20-гидроксиэкдизона (1) и его производных (2-10)
Протоны 20Е (1) 2,3,22-триацетат 20Е (2) 2,3,22,25-тетраацетат 20Е (3) 2,3,22-трипальмитат 20Е(4) 2-ацетат 20Е (5)
2На 3,87 (м, w=22,3) 5,05 (уш.т, л=21) 5,05 (уш.т, w=22,1) 5,05 (уш. т) 5,02 (уш. т, л=22,1)
3Не 4,02 (уш. с, w=9) 5,35 (уш.с, л=7,8) 5,35 (уш.с, 8,3) 5,35 (м, w=9,6) 4,12 (уш. с, л=8,1)
5Н 2,43 (дд, 13,1; 4,2) 2,39 (м) 2,35 (дд, 12,6; 3,8) - 2,52 (дд, 13,4; 3,8)
7Н 5,86 (д, 2,5) 5,85 (д, 2,0) 5,85 (д, 2,5) 5,85 (д, 2,5) 5,85 (д, 2,0)
9На 2,89 (уш.т, w=22) 3,10 (уш.т, л=22,4) 3,10 (уш.т, w=22,7) 3,12 (уш. т, w=33,4) 3,08 (уш.т, л=22,4)
17Н 2,34 (уш.т, 8,8) 2,38 (уш.т, 8,8) 2,33 (уш.т, 8,3) 2,21 (м) 2,34 (уш.т 8,3)
22Н 3,45 (м) 4,85 (дд, 10,4; 2,0) 4,82 (дд, 10,3; 2,0) 4,79 (д, 10,0) 3,45 (м)
18Ме 0,86 (с) 0,83 (с) 0,83 (с) 0,83 (с) 0,87 (с)
19Ме 0,98 (с) 1,01 (с) 1,01 (с) 1,01 (с) 0,98 (с)
21Ме 1,21 (с) 1,26 (с) 1,21 (с) - 1,18 (с)
26Ме 1,24 (с) 1,20 (с) 1,35 (с) - 1,22 (с)
27Ме 1,25 (с) 1,22 (с) 1,40 (с) - 1,23 (с)
Сигналы - ацетат ацетат X 1,23 (м); ацетат
замести- 1,98 (с), 2,08 (с), 1,98 (с), 2,0 (с), 2,1 У 0,86 (т, 6,3); 7 2,07 (с)
телей 2,10 (с) (с), 2,12 (с) 2,35(т, 6,5)
20,22-фе- 2,3-изопро- 2,3-изопропилиден 22-ацетат-2,3- 22-ацетат 20Е
нилборат 20Е (6) пилиден-20,22-фенилборат 20Е (7) 20Е (8) изопропилиден 20Е (9) (10)
2На 4,16 (уш.т) 4,23 (м) 4,24 (м) 4,20 (м) 3,87 (м, л=22,0)
3Не 4,23 (уш.с) 4,26 (м) 4,26 (м) 4,25 (м) 4,02 (м, л=8,7)
5Н - 2,37 (м) 2,37 (м) 2,36 (дд) 2,42 (дд)
7Н 6,23 5,82 (д, 2,2) 5,82 (д, 2,2) 5,82 (д, 2,9) 5,84 (д, 2,3)
9На 3,55 (уш. т) 2,82 (уш. т, л=24,0) 2,82 (уш.т, w=23,7) 2,81 (уш. т, w=24,5) 3,02 (уш. т, л=21,0)
17Н 3,0 (дд) 2,33 (м) 2,34 (м) 2,38 (м) 2,36 (м)
22Н 4,41 (дд) 4,15 (дд, 9,0; 2,1) 3,45 (дд, 10,2; <2) 4,86 (дд, 10,2; <2) 4,86 (дд, 9,4; <2)
1 8 Ме 1,1 0,96 (с) 0,88 (с) 0,87 (с) 0,87 (с)
1 9 Ме 1,09 0,99 (с) 0,99 (с) 0,99 (с) 0,98 (с)
21Ме 1,47 1,33 (с) 1,22 (с) 1,21 (с) 1,2 (с)
26Ме 1,35 1,27 (с) 1,25 (с) 1,23 (с) 1,22 (с)
27Ме 1,35 1,28 (с) 1,25 (с) 1,27 (с) 1,27 (с)
Сигналы фенил изопропил 1,35 (с), изопропил 1,33 (с), ацетат ацетат 2,1 (с)
замести- 7,25-7,79 1,49 (с); фенил 1,49 (с) 2,1 (с);
телей 7,25-7,79 изопропил 1,33; 1,49
Примечание: X - метиленовые группы пальмитатных остатков; У - концевые метильные группы пальмитатов; Ъ - метильные группы, соседствующие с карбоксилом; с - синглет, д - дублет, дд - дублет дублетов, м - мультиплет, т - триплет, уш. т - уширенный триплет, уш. с. - уширенный сигнал.
Сравнительная оценка включения ацильных производных 20Е в липосомы. При проведении гель-хроматографии липосом, содержащих 20Е (образец II), мы наблюдали выход двух пиков, соответствующих липосомам и свободному 20Е. Отнесение пика к липосомальному было проведено на основании данных гель-хроматографии "пустых" липосом. При хроматографировании раствора 20-гидроксиэкдизона время его удерживания совпадало с пиком 2 свободного субстрата в экспериментах с липосомальными дисперсиями.
Включение 20-гидроксиэкдизона и его ацетатов в липосомы было низким: 5,1±0,4% (0,43±0,03% мол.), 1,7±0,6% (0,11±0,03% мол.), соответственно для 20Е и 2,3,22-триацетата 20Е, а 2,3,22,25-тетраацетат 20Е вообще не включился.
Полученные результаты позволяют предположить, что исследованные экдистероиды захватывались во внутреннее водное пространство липосом: включение 20Е было немного выше, чем 2,3,22- триацетата и 2,3,22,25-тетраацетата. Это можно объяснить снижением растворимости экдистероидов в водном буфере с введением в структуру молекулы ацетильных остатков. Однако тот факт, что содержание ацетатов в водной фазе вне липосом такое же и даже выше, чем в случае 20Е, позволяет предположить, что ацетаты ассоциировали с липидной фазой липосом. При прохождении через гель такие слабые связи, скорее всего, разрушаются, вследствие чего обнаружить и количественно оценить содержание 2,3,22,25-тетраацетата не представлялось возможным.
Метод искусственной гидрофобизации субстрата для повышения эффективности его встраивания в липидный бислой липосом в случае экдистероидов является аналогией природного процесса, происходящего при резервировании гормона линьки у насекомых. Предложенный нами принцип получения экдистероидсодержащих липосом заключается в повышении сродства экдистероидов к липидному бислою липосом путем введения в состав их молекул мембранотропного фрагмента оптимального размера и позволяет добиться эффективного встраивания экдистероидов в липосомальную мембрану. Экспериментальное подтверждение было получено при включении в липосомы 2,3,22-трипальмитата 20Е.
При проведении гель-хроматографии образца липосом, содержащих трипальмитат, было выявлено наличие только одного пика. ВЭЖХ-анализ показал, что трипальмитат присутствует только в этой фракции. Отнесение пика к липосомальному было подтверждено при элюировании «пустых» липосом. Мы не наблюдали выхода свободного трипальмитата, поскольку он нерастворим в воде и, по-видимому, необратимо связывается с гелем. для проверки этого предположения была получена дисперсия мицелл трипальмитата 20Е. Результаты гель-хроматографии и ВЭЖХ-анализа показали, что мицеллы трипальмитата разрушаются при прохождении через слой биогеля и на выходе из колонки в растворе остается не более 3% от исходного содержания 2,3,22-трипальмитата 20Е. Включение 2,3,22-трипальмитата 20Е в липосомы было значительно больше, чем 20Е и его ацетатов - 27,5±3,2% (0,90±0,10% мол.). Мы полагаем, что производные 20Е и высших жирных кислот, имея большее сродство к фосфолипидным молекулам, встраиваются в липидный бислой липосом.
Таким образом, успешное включение экдистероидов было достигнуто при модификации молекулы 20Е путем образования ацильного производного с высшими жирными кислотами (например, пальмитиновой кислотой), что свидетельствует о целесообразности выбранной стратегии моделирования событий, происходящих у насекомых при резервировании гормона линьки.
Определение оптимального соотношения липид/субстрат. При использовании в качестве субстрата 2,3,22-трипальмитата 20Е (4), показавшего наилучшее включение в липосомы, были проведены эксперименты по исследованию зависимости мольной доли субстрата в липосомах от его исходной концентрации при формировании дисперсии. По результатам гель-хроматографии и ВЭЖХ-анализа было установлено, что в 3,6%-ной липосомальной дисперсии наблюдается плавный максимум концентрации субстрата в липидном бислое при исходных концентрациях 10,7-19,2% мол., т.е. когда на одну молекулу субстрата приходится от четырех до девяти молекул липида. При этом степень включения составляет 27,8±0,6%. С уменьшением исходного содержания субстрата наблюдается тенденция к повышению степени включения, однако его содержание в препарате остается низким (рис. 3).
При исходном содержании субстрата выше установленного оптимума (19,2% мол.) наблюдается снижение степени включения и мольной доли субстрата в липидном бислое. Это может быть объяснено невозможностью солюбилизации липосомами избытка субстрата, который остается в виде осадка на стенках колбы уже в процессе формирования липосом. Кроме того, эксперименты по определению потерь липида во время формирования везикул показали, что осадок субстрата адсорбирует часть липида благодаря, вероятно, гидрофобным взаимодействиям, т.е. снижается общее количество формируемых везикул (концентрация липосомальной дисперсии), способных солюбилизировать субстрат. Содержание
2.3.22-трипальмитата 20Е в липидном бислое максимально (1,8% мол. в смеси, а в пересчете на количество диспергированного ФХ 2,0% мол.) при его концентрации в исходной смеси 19,2% мол.
Таким образом, эксперименты по исследованию оптимального соотношения липид/субстрат показали, что максимальная нагрузка 3,6%-ной дисперсии липосом 2,3,22-трипальмитатом 20Е (4) составляет 2,0% от количества диспергированного ФХ.
Гидролиз ацильных производных 20-гидроксиэкдизона под действием ферментов. Нами была исследована гидролитическая устойчивость ацильных производных 20-гидроксиэкдизона на примере
2.3.22.25-тетраацетата 20Е (3) как производного с наибольшим числом замещающих групп, а также
2.3.22-трипальмитата 20Е (4), который показал максимальную степень включения в липосомы. Гидролитическая устойчивость 2,3,22,25-тетраацетата 20Е (3) была исследована in vitro с помощью
комплексного препарата гидролаз Helix, обладающего эстеразной активностью (342 мкмоль/мин-г, соотношение фермент/субстрат 14 : 1). Результаты гидролиза показали, что уже на первые сутки тетраацетат 20Е расщепляется до 2-ацетата 20Е (5) и свободного 20Е (1). Кроме того, в пробе, взятой на четвертые сутки, анализ подтвердил наличие только 20Е (1), что свидетельствует о полном гидролизе
2.3.22.25-тетраацетата 20Е (3).
Рис. 3. Зависимость мольной доли субстрата в липосомах от его мольного содержания в исходной дисперсии
2,5
1,5 -
0,5 -
1,2
1,3
10 20 30 40
Мольная доля субстрата в навеске, %
2
1
0
0
Попытки провести гидролиз 2,3,22-трипальмитата 20Е (4) комплексным препаратом ферментов Helix не привели к успеху даже в дисперсии мицелл или при солюбилизации ПАВ проксанолом REP-40. Был сделан вывод о том, что для гидролиза такого гидрофобного производного, как 2,3,22-трипальмитат 20Е, необходим фермент, способный работать на границе раздела фаз. Гидролиз трипальмитата 20Е (4) был осуществлен при помощи панкреатической липазы (липазная активность 3500 ед. FIP, соотношение фермент/субстрат 10 : 1). Результаты ВЭЖХ-анализа продуктов гидролиза показали, что в мицеллярной форме субстрат гидролизуется до свободного 20Е (1) на 1-3 сутки в зависимости от количества внесенного фермента (рис. 4). Кроме того, наблюдается появление новых пиков, соответствующих, скорее всего, промежуточным продуктам гидролиза (ди- и монопальмитатам, соединения Xj-X5). По данным ВЭЖХ, на пятые сутки количество свободного 20Е (1) составило 68% от теоретически возможного. При гидролизе 2,3,22-трипальмитата 20Е (4) в липосомальной форме наблюдалось более медленное высвобождение 20Е (1): на пятые сутки его содержание составило 14% от теоретически возможного, что косвенно свидетельствует о возможном пролонгированном действии трипальмитата 20Е.
Таким образом, на основании полученных данных показано, что гидролизу подвергаются все сложноэфирные связи исследованных ацильных производных 20Е. Тем не менее при гидролизе 2,3,22-трипальмитата (4), заключенного в липосомы, наблюдается более медленное высвобождение 20Е (1). Полученные результаты можно рассматривать как аргументы в пользу того, что конструируемые липосомальные композиции на основе ацильных производных экдистероидов будут обеспечивать пролонгирование биологической активности лекарственного начала in vivo.
Сутки
Рис. 4. Динамика гидролиза 2,3,22-трипальмитата 20Е в мицеллярной форме панкреатической липазой: 8 - субстрат (2,3,22-трипальмитат 20Е); Х^Х5 -промежуточные продукты; Р - конечный продукт гидролиза (20Е). Содержание вещества определяли как отношение высоты его пика на ВЭЖХ-хроматограмме к сумме высот всех пиков в реакционной смеси
Выводы
Разработаны методы синтеза ацильных производных 20-гидроксиэкдизона, различающихся числом, положением и природой заместителей, в результате чего получены: 2-ацетат, 2,3,22-триацетат, 2,3,22,25-тетраацетат, 2,3,22-трипальмитат 20-гидроксиэкдизона путем прямого ацилирования ангидридами или хлорангидридами карбоновых кислот; 22- и 25-ацетаты при использовании двойной защиты диольных групп 20-гидроксиэкдизона.
Повышение эффективности включения экдистероидов в липосомы достигается при использовании их ацильных производных с высшими жирными кислотами.
Исследование устойчивости ацильных производных 20Е по отношению к гидролитическим ферментам показало их лабильность. Полученные результаты можно рассматривать как аргументы в пользу того, что конструируемые липосомальные композиции на основе ацильных производных экдистероидов будут обеспечивать пролонгирование биологической активности лекарственного начала in vivo.
Авторы выражают благодарность С.О. Володиной, А.В. Игнатову, В.Н. Филипповой за помощь в работе.
Список литературы
1. Lafont R., Bouthier A., Wilson I.D. Phytoecdysteroids: structures, occurrence, biosynthesis and possible ecological significance // Proc. Conf. Insect Chem. Ecol. Tabor, 1990. P. 197-214.
2. Koolman J. Ecdysteroids // Zool.Science. 1990. V. 7. P. 563-580.
3. Slama K., Lafont R. Insect hormones - ecdysteroids: their presence and actions in vertebrates // Eur. J. Entomol. 1995. V. 92. P. 355-377.
4. Саатов З., Сыров В.Н., Маматханов А.У., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Ajuga и их биологическая активность // Химия природных соединений. 1994. №2. С. 152-159.
5. Detmar M., Dumas M., Bonte F., Meybeck A., Orfanos C.E. Effects of ecdysterone on the differentiation of normal human keratinocytes in vitro // Eur. J. Dermatol. 1994. V.4. P. 558-562.
6. Сыров В.Н., Курмуков А.Г. О тонизирующих свойствах экдистерона, выделенного из левзеи сафлоровидной // Доклады АН УзССР. 1977. №12. С. 27-30.
7. Зацны И.А., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдизоны Serratula. Витикостерон Е из Serratula sogdiana и его частичный синтез // Химия природных соединений. 1973. №2. С. 175-178.
8. Сыров В.Н., Курмуков А.Г., Усманов Б.З. Анаболический эффект туркестерона и тетраацетата туркестерона // Доклады АН УзССР. 1975. Т. 32. №2. С. 32-34.
9. Patent ЕР 0436650 МКИ А 61 К №7/00 Phases lamellaires lipidiques hydratees on liposomes a base d'ecdysteroides. Meybeck A., Bonte F. №8812909; Заявл. 03.10.88; Опубл. 17.07.91. // Bull. №91/29.
10. Patent USA 56009873 МКИ А 61 №35/78. Use of an ecdysteroid for the preparation of cosmetics or dermatological compositions intended, in particular, for strengthening the water barrier function of the skin or for the preparation of a skin cell culture medium, as well as to the compositions. Meybeck A., Bonte F., Redzinijak G. Заявл. 27.04.95; Опубл. 11.03.97.
11. Ахрем А.А., Ковганко Н.В. Экдистероиды: химия и биологическая активность. Минск, 1989. 325 с.
12. Pis J., Girault J.-P., Grau V., Lafont R. Analysis of ecdysteroid conjugates: chromatographic characterization of sulfates, phosphates and glucosides // Eur. J. Entomol. 1995. V. 92. №1. P. 41-42.
13. Саатов З., Умарова Р.У., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Melandrium. I. Полиподин В 22-ацетат из Melandrium turkestanicum // Химия природных соединений. 1990. №4. С. 480-483.
14. Dinan L.N., Rees H.H. The identification and titres of conjugated and free ecdysteroids in developing ovaries and newly-laid eggs of Schistocerca gregaria // J. Insect Physiol. 1981. V. 27. P. 51-58.
15. Diehl P.A., Connat J.-L., Girault J.-P., Lafont R. A new class of apolar ecdysteroid conjugates: esters of 20E with long-chain fatty acids in ticks // Int. J. Invertebrate Reprod. Develop. 1985. V. 8. P. 1-13.
16. Connat J.-L., Diehl P.A., Morici M. Metabolism of ecdysteroids during the vitellogenesis of the tick Ornithodoros moubata (Ixodoidea, Argasidae): accumulation of apolar metabolites in the eggs // Gen. Comp. Endocrinol. 1984. V. 56. P. 100-110.
17. Galbraith M.N., Horn D.H.S. Insect molting hormones: crustecdysone from Podocarpus elatus // Austr. J. Chem. 1969. V. 22. P. 1045-1057.
18. Dinan L. The chemical synthesis of ecdysone 22-long chain fatty acyl esters in high yield // J. Steroid Biochem. 1988. V. 31. №2. P. 237-245.
19. Guedin-Vuong D., Nakatani Y., Ourisson G. Ecdysteroids. Selective protections and synthesis of potential tools for biochemistry studies // Croatica Chem. Acta. 1983. V. 38. №4. P. 547-557.
20. Курмуков А.Г., Сыров В.Н. Противовоспалительные свойства экдистерона // Медицинский журнал Узбекистана. 1988. №10. С. 68-70.
21. Володин В.В., Ширшова Т.И., Бурцева С.А., Мельник М.В. Биологическая активность 20-гидроксиэкдизона и его ацетатов // Растительные ресурсы. 1999. Вып. 2. С. 76-81.
22. Патент (19) RU (11) 2119331 (13) С1 Россия, (51) А 61 К 9/06, 35/78. Средство для лечения ожоговых ран "Витадерм". В.Н. Дармограй, С.М. Потехинский, Ю.И. Ухов, В.К. Петров, С.С. Потехинский, С.В. Дармограй; №96104062/14; Заявл. 29.02.96; Опубл. 27.09.98. // Бюл. №27.
23. Meybeck A. Past, present and future of liposome cosmetics // Liposome dermatics / Ed. by O.Braun-Falco, H.C.Korting, H.I.Maibach. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 1996. P. 341-345.
24. Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде / Г.М. Сорокоумова, А.А. Селищева, А.П. Каплун, В.И. Швец. М., 2000. 68 с.
25. Новосельская И.Л., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Экдистерон и полиподин В из Paris quadrifolia // Химия природных соединений. 1986. №3. С. 402-403.
Поступило в редакцию 5 июля 2001 г.
