CC BY
24
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Характеристики батуминоустойчивых вариантов, полученных из клинических изолятов Staphylococcus aureus
Л. Н. ЧУРКИНА1, С. И. БИДНЕНКО2, Л. В. АВДЕЕВА1, Л. В. ЯРОШЕНКО'
' Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев,
2 Институт травматологии и ортопедии АМН Украины, Киев
Characterization of Batumin Resistant Variants of Staphylococcus aureus Clinical Isolates
L. N. CHURKINA, S. I. BIDNENKO, L. V. AVDEEVA , L. V. YAROSHENKO
Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of the Ukraine, Kiev Institute of Traumatology and Orthopedics, Medical Academy of Sciences of the Ukraine, Kiev
Популяционный анализ 20 штаммов стафилококков, выделенных из клинических источников и чувствительных к антибиотику батумину, позволил обнаружить резистентные клоны только у 3 штаммов. Частота выделения батуминорезистент-ных вариантов была низкой и зависела от концентрации антибиотика. Резистентность к батумину у 5 клинических и одного эталонного штамма Staphylococcus aureus ATCC 6538 P (209P) индуцировалась в лабораторных условиях и вызывала важные фенотипические и хемотаксономические изменения патогена. Резистентные к батумину варианты имели такую же степень вирулентности для мышей, как и исходные чувствительные штаммы. Устойчивые к батумину варианты S.aureus были нестабильными и на питательной среде без батумина полностью восстанавливали свой первоначальный фенотип.
Ключевые слова: антибиотик батумин, S.aureus, резистентность.
Population analysis of 20 batumin susceptible staphylococcal strains, isolated from clinical materials allowed to detect resistant clones only in 3 strains. The frequency of batumin resistant variants isolation was low and depended on the antibiotic concentration. Resistance to batumin in 5 clinical strains and in 1 reference strain of Staphylococcus aureus ATCC 6538 P (209P) developed under laboratory conditions and induced significant phenotypic and chemotaxonomic changes in the pathogen. The variants, resistant to batumin, had the same degree of virulence for mice as the initial susceptible strain. The batumin resistant variants of S.aureus were unstable and on the medium without batumin completely restored their initial phenotype.
-Q~
Key words: batumin, S.aureus, resistance.
Введение
Антибиотик батумин обладает избирательной активностью в отношении всех исследованных видов стафилококков, включая метициллиноре-зистентные штаммы (МЯЗА) [1—3]. Селективность действия батумина в отношении стафилококков составляет его принципиальное отличие от антибиотиков с широким спектром действия или от антибиотиков, действующих на целый ряд грамположительных бактерий.
Лекарственная форма батумина — мазь, содержащая 0,1% натриевой соли антибиотика, показала высокую эффективность при санации назального носительства Б.аигвт у медицинского персонала и больных [4, 5], а также как эффективное средство для лечения гнойновоспалительных инфекций кожи стафилококковой этиологии. До настоящего времени бату© Коллектив авторов, 2009
Адрес для корреспонденции: Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, ул. Заболотного, 154. Киев, 03680, Украина
минорезистентные стафилококки не были изолированы из клинического материала.
Результаты ранних исследований [6] свидетельствуют о том, что устойчивость к батумину у эталонного штамма Staphylococcus aureus 209P (ATCC 6538P) развивалась постепенно, батуми-ноустойчивым вариантам стафилококков свойствен замедленный рост с длительной лаг-фазой, низкими скоростью роста и накоплением биомассы.
Целью настоящей работы был анализ гетерогенности популяции стафилококков по их чувствительности к батумину, получение из клинических изолятов S.aureus батуминорезистентных вариантов, изучение их биологических особенностей, в том числе вирулентных свойств.
Материал и методы
Штаммы бактерий. В работе исследовано 20 штаммов S.aureus — 17 из них выделены от больных травматолого-орто-педического стационара с гнойно-воспалительными инфекциями костей, клинически и лабораторно подтвержденными,
-е-
Є
Таблица 1. Частота батуминоустойчивых вариантов в клинических штаммах S.aureus
Штаммы S.aureus Концентрация батумина в МХА, мкг/мл Батуминоустойчивые варианты*
43 100 0
10 0
4 4
2 9
461 100 0
10 1
4 4
2 7
1078 100 0
10 2
4 5
2 11
Примечание. * — при посевной дозе 108 КОЕ/мл.
а 3 штамма выделены при обследовании медицинского персонала на назальное носительство S.aureus. Были исключены штаммы, повторно выделенные от одного пациента.
Идентификацию штаммов стафилококков проводили с помощью рутинных, принятых в лаборатории методов, а также с помощью препарата «Диастаф», представляющего собой диски с батумином, обеспечивающие быструю идентификацию бактерий рода Staphylococcus [1, 7].
Чувствительность стафилококков in vitro к батумину (МПК) определяли методом серийных разведений на бульоне Мюллера—Хинтон (МХБ) при концентрации инокулюма 2^105 КОЕ/мл.
Батуминоустойчивые вариан ты стафилококков были получены из клинических штаммов S.aureus 26, 497, 505, 511, 1448, а также эталонного штамма S.aureus 209P (ATCC 6538P) в лабораторных условиях методом селекции с возрастающими концентрациями антибиотика.
Физиологические и биохимические тесты. Морфологию колоний и пигментацию исследовали методом W. E. Kloos и соавт.
[8]. Образование кислот из углеводов и ферментативная активность (фосфатазная, уреазная, нитратредуктазная) были изучены с помощью системы API-Staph galleries (API System, Biomeiieux), ферментация глюкозы — с использованием метода
[9]; каталазную активность определяли путём инокуляции небольшого количества исследуемой культуры каплей 3% H2O2; оксидазную активность — по методу [10]; коагулазную активность — по методу [11]; определение лецитиназной активности проводили в соответствии с рекомендациями А. К. Акатова и В. С. Зуевой [12]; гемолитическую активность определяли на агаре, содержащем 5% отмытых кроличьих эритроцитов.
Определение вирулентности батуминорезистентных вариантов стафилококков. Батуминочувствительные родительские штаммы и устойчивые к батумину варианты выращивали в МХБ (с добавлением 200 мкг/мл батумина для резистентных штаммов), отмывали 2 раза 0, 85% раствором NaCl и суспендировали в 1 мл. Летальную дозу (LD50) определяли посредством внутрибрюшинного введения суспензий штаммов стафилококков: для чувствительных — в дозе от 103 до 109 клеток/мл, для резистентных штаммов — 108 и 109 клеток/мл. В экспериментах использовались самки белых мышей весом 20 г. За животными наблюдали в течение 14 дней после введения культуры стафилококков.
Реверсию устойчивых к 200 мкг/мл батумина вариантов стафилококков в исходный чувствительный фенотип получали методом пассажей в МХБ без батумина. Бульонную культуру инкубировали 24 ч при 37°С и по 0,1 мл исследуемых культур стерильно растирали на МХА без батумина и МХА, содержащем 200 мкг/мл антибиотика, для определения числа батуминочувствительных и резистентных бактерий.
Частоту батуминорезистентных вариантов в популяции 20 клинических изолятов S.aureus определяли путём высева 18-ча-
совой культуры стафилококков (0,1 мл) на МХА с 100, 10, 4, 2 мкг/мл батумина с концентрацией инокулюмов 1*108 КОЕ/мл.
Результаты и обсуждение
Двадцать клинических штаммов S.aureus показали высокую чувствительность к батумину: МПК на МХБ составляла 0,2 мкг /мл для всех изученных штаммов.
Анализ популяции 20 чувствительных к батумину штаммов стафилококков показал, что на среде с батумином (2, 4, 10 мкг/мл) только у трёх штаммов — S.aureus 43, 461 и 1078 вырастало незначительное количество резистентных клонов. На среде с более высокими концентрацияи бату-мина устойчивые клоны не были обнаружены (табл. 1). Полученные результаты говорят о том, что среди клинических изолятов стафилококков встречаются штаммы с гетерогенной по чувствительности к батумину популяцией. К такому выводу мы пришли ранее [13] на основании изучения жирно-кислотных профилей устойчивых и чувствительных к батумину стафилококков. Эти выводы подтвердились и в настоящей работе.
Следовательно, стафилококки обладают генетической информацией, детерминирующей устойчивость к батумину — антибиотику, который ограниченно применялся в клинике. Аналогичный факт описан в литературе для мупироцина — антибиотика, который так же, как и батумин, синтезируется бактерией рода Pseudomonas [14]: в популяциях чувствительных стафилококков присутствовали устойчивые к мупироцину клоны.
Известно, что развитие устойчивости к антибиотикам обусловлено двумя процессами — возникновением генов устойчивости и их распространением [15]. Более изучен второй процесс. Проведённое V. M. Hughes и N. Datta [16] исследование коллекции энтеробактерий, собранной E. D. G. Murrey в 1917—1954 гг. до широкомасштабного использования антибиотиков, показало наличие в ней, хотя и в небольшом количестве, антибиотикорезистентных штаммов. Так, у 9 штаммов рода Proteus, выделенных в 1919—1940 гг., в
О
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 2. Некоторые биохимические характеристики батуминочувствительных штаммов S.aureus и их ба-туминорезистентных вариантов
Характеристика
S.aureus 26
S.aureus 497
S.aureus 511
чувствительные р т е чувствительные резистентные чувствительные резистентные
Диаметр колоний, мм >5 <1 >5 <1 >5 <1
Пигментация колоний + — + — + —
Рост в аэробных условиях + + + + + +
Каталаза + — + — + —
Оксидаза Образование кислоты (аэробные условия) из:
ксилозы — — — — — —
арабинозы - — — — — —
сахарозы + — + — + —
мальтозы + + + + + +
О-маннита + + + + + +
О-маннозы + + + + + +
О-трегалозы + + + + + +
в-лактозы + + + + + —
О-галактозы + + + + + +
О-фруктозы Образование кислоты (анаэробные условия) из: + + +
О-глюкозы + + + + + +
Восстановление нитрата + — + + + +
Фосфатаза + — + — + —
Уреаза + — + + + +
Коагулаза (кроличья плазма) + — + ± + —
Лецитиназа + — + — + +
Гемолиз + + + — + —
доантибиотический период, обнаружена устойчивость к тетрациклину.
По данным G. Dantas с соав. [17], возникновение генов устойчивости можно объяснить способностью почвенных бактерий использовать природные и синтетические антибиотики как единственный источник углерода. Бактерии, живущие на антибиотиках, удивительно филогенетически разнообразны и обладают множественной устойчивостью. Среди них также встречаются и патогенные для человека бактерии. Этот феномен предполагает существование недооцененного резервуара детерминантов анти-биотикорезистентности.
В связи с вышесказанным, закономерно обнаружение штаммов стафилококков, в популяции которых содержатся особи устойчивые к антибиотику, ограниченно применявшемуся для лечения. Индукция устойчивости к батумину у клинических изолятов S.aureus 26, 497, 505, 511 и 1448 происходила быстрее, чем у эталонного штамма S.aureus 209P [6]. В лабораторных условиях была получены резистентные штаммы стафилококков, для которых МПК батумина составляла 200 мкг/мл.
Устойчивые к батумину варианты стафилококков вырастали в виде очень мелких непигмен-тированных колоний и обладали нетипичным биохимическим профилем в отличие от исходных чувствительных к антибиотику штаммов S.aureus, типичных по изученным признакам. У них отсут-
ствовали фосфатазная, плазмокоагулазная, леци-тиназная активности, определялось атипичное отношение к утилизации таких углеводов, как сахароза, лактоза, фруктоза (табл. 2). Слабо выраженную плазмокоагулазную активность наблюдали у штаммов S.aureus 497 и 1448
Итак, изученные батуминорезистентные варианты S.aureus теряли ряд типичных для данного вида свойств. Им присущи изменённая морфология колоний, отсутствие пигментации, а также ряд изменений в биохимическом профиле.
По некоторым свойствам устойчивые к батумину варианты S.aureus подобны естественно встречающимся субпопуляциям стафилококков, но не являются их полными аналогами. Отмеченные субпопуляции S.aureus также образуют непигментированные колонии, медленно растут, характеризуются изменённой формой утилизации углеводов. Этот фенотип, названный small colony variants (SCV), предположительно объясняют дефектным электронным транспортом [18, 19].
Для большинства изученных батуминорезис-тентных вариантов характерно отсутствие факторов вирулентности — гемолитической, лецити-назной и плазмокоагулазной активностей. Представляло интерес изучить вирулентность ба-туминоустойчивых вариантов стафилококков в экспериментах in vivo. При внутрибрюшинном заражении батуминоустойчивыми штаммами 209Р, 26, 505, 511 и 1448 их летальность для мышей бы-
Є
Реверсия батуминоустойчивых вариантов стафило-коков в свой исходный фенотип.
По оси абсцисс - число пассажей; по оси ординат - частота ревертантов, %.
ла такой же, как и у исходных чувствительных штаммов: ЬБ50 составляла 5^109 КОЕ/мл.
Таким образом, у стафилококков не происходило повышения вирулентности, ассоциированной с формированием устойчивости к батумину.
Важной характеристикой антибиотикорезистентных вариантов стафилококков является их способность восстанавливать свой исходный фенотип. Устойчивые к батумину варианты Б.аигвт 497, 505, 511 и 1448 полностью восстанавливали свой первоначальный фенотип после 7 пассажей. В то же время батуминорезистент-ный вариант Б.аыгвт 26 ревертировал уже после 6 пассажей на среде без антибиотика (см. рисунок). По своей морфологии и физиолого-биохи-мическим характеристикам ревертанты были идентичны исходным чувствительным штаммам с МПК 0,2 мкг/мл.
Заключение
Из 20 изученных чувствительных штаммов стафилококков только у трёх в популяциях обнаруживались резистентные к батумину варианты с низкой частотой и низким уровнем устойчивости к антибиотику. Такой уровень резистентности не может быть существенным препятствием для клинического применения батуминовой мази, которая содержит 1000 мкг/мл антибиотика.
Батуминоустойчивые штаммы стафилококков клинического происхождения все еще не обнаружены, однако батуминорезистентность индуцировалась в лабораторных условиях и вызывала важные фенотипические и биохимические изменения патогена: отсутствие пигментации, изменение модели потребления углеводов, отсутствие у некоторых штаммов факторов вирулентности, которые определяются гемолитической, плазмокоа-гулазной и лецитиназной активностями.
Батуминорезистентные варианты S.aureus в экспериментах in vivo имели такую же степень вирулентности, как исходные чувствительные штаммы. У стафилококков не происходило повышение вирулентности, ассоциированной с формированием устойчивости к батумину
Устойчивые к батумину варианты S.aureus оказались нестабильными и полностью восстанавливали свой первоначальный фенотип после 6—7 пассажей на среде без батумина. По своей морфологии и физиолого-биохимическим характеристикам ревертанты были идентичны исходным чувствительным к батумину штаммам с МПК 0,2 мкг/мл.
ЛИТЕРАТУРА
1. Смирнов В. В., Чуркина Л. Н., Носенко Г. А. и др. Эффективность диагностических дисков с батумином при идентификации и индикации стафилококков. Врачебное дело 2002; 5—6: 27—31.
2. Witte W, Cuny C, Mollmann U. In vitro — Wirksamkeit von Batumin auf Staphylococcus aureus. Chemother J 1997; 6 (1): 48—50.
3. Чуркина Л. Н, Бидненко С. И., Лютко О. Б. и др. Изучение эффективности антистафилококкового антибиотика батумина в отношении метициллинрезистентных штаммов стафилококков. Антибиотики и химиотер 2007; 9—10: 19—23.
4. Smirnov V. V, Churkina L.N., Kiprianova E. A. Antibiotic batumin for diagnostics of staphylococci and treatment of Staphylococcus aureus nasal carriage. 10th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections; 2002 Oct 16—19; Tsukuba, Japan.
5. Смирнов В. В., Киприанова Е. А., Чуркина Л. Н. Антибиотик бату-мин в борьбе с госпитальной стафилококковой инфекцией. Международная научная конференция «Актуальные вопросы борьбы с инфекционными болезнями»; М.: 2003 Окг 23—24.
6. Смирнов В. В., Чуркина Л. Н., Васюренко 3. П. и др. Жирно-кислотный состав варианта S.aureus 209P, устойчивого к антибиотику АЛ-87. Антибиотики 1984; 29: 3: 201—205.
7. Смирнов В. В., Киприанова Е. А., Гвоздяк О. Р. и др. Использование дисков с батумином для экспресс-идентификации стафилококков. ЖМЭИ 1999; 5: 77—80.
8. Kloos W. E., Tornabene T. G. Schleifer K. H. Isolation and characterization of micrococci from human skin, including two new species: Micrococcus lylae and Micrococcus kristinae. Int J Syst Bacteriol 1974; 24: 79—101.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Hugh R., Leifson E. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative Gram-negative bacteria. J Bacteriol 1953; 66: 24—26.
Faller A., Schleifer K. H. Modified oxidase and benzidine tests for separation of staphylococci. J Clin Microbiol 1981; 13: 1031—1035.
Sperber W. H., Tatini S. R. Interpretation of the tube coagulase test for identification of Staphylococcus aureus. Appl Microbiol 1975; 29: 502—505. Акатов А. К., Зуева В. С. Стафилококки. M.: 1983.
Смирнов В. В., Чуркина Л. H., Васюренко З. П. и др. Индуцированный антибиотиком АЛ-87 жирно-кислотный состав стафилококков как маркер их устойчивости или чувствительности к данному антибиотику. Антибиотики и мед биотех 1985; 31: 5: 671—676. Casewell M. W., Hill R. L. R. In vitro activity of mupirocin («pseudomonic acid») against clinical isolates of Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 1985;: 15: 523—531
Richmond M. Antibiotic resistance and the evolution of bacteria. Nature
1983; 302: 5910: 657.
Hughes V.M., Datta N. Conjugative plasmids in bacteria of the 'preantibiotic' era. Nature 1983; 302: 5910: 725—726.
Dantas G., Sommer M. O., Oluwasegun R. D., Church G. M. Bacteria subsisting on antibiotics. Science 2008 320: 5872: 100—103
Looney W. J. Small colony variants of Staphylococcus aureus. Br J Biomed Sci 2000; 57: 317—322.
McNamara P. J., Proctor R. A. Staphylococcus aureus small colony variants, electron transport and persistent infections. Int J Antimicrob Agents 2000: 14: 117—122.
