CC BY
02024 т 14 № 1 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
УДК 618.11:616-001.2 DOI: 10.29039/2224-6444-2024-12-1-24-28
ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЛОКНИСТОГО КОМПОНЕНТА ЯИЧНИКА В МОДЕЛИ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ОВАРИАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
Демяшкин Г. А.1,2, Пугачева Е. Н.2, Муртазалиева З. М.2, Вадюхин М. А.2
'ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава России, 249036, ул. Королева, 4, Обнинск, Россия
2ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), 119048, ул. Трубецкая, 8 стр.2, Москва, Россия
Для корреспонденции: Демяшкин Григорий Александрович, д.м.н., заведующий лабораторией гистологии и иммуногистохимии ИТМиБ Первого МГМУ им. И.М. ( „еченова (Сеченовский Университет); e-mail: dr.dga@ mail.ru
For correspondence: Grigory Demyashkin, MD, Head of Department of Histology, ITM of Sechenov University, e-mail: dr.dga@mail.ru
Information about authors:
Demyashkin G. A., https://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Pugacheva E. N., https://orcid.org/0009-0009-2268-3838 Murtazalieva Z. M., https://orcid.org/0009-0000-2361-7618 Vadyukhin M. A., https://orcid.org/0000-0002-6235-1020
РЕЗЮМЕ
Большинство авторов в специализированной литературе описывают развитие фиброза яичника в поздние сроки после воздействия ионизирующего излучения. Применение аскорбиновой кислоты, обладающей доказанным антиоксидантным эффектом, потенциально может снизить диапазон и глубину радиационно-индуцированного фиброза яичника в отдаленные сроки. Цель исследования: оценка состояния волокнистого компонента яичника при хроническом лучевом повреждении и предлучевом введении аскорбиновой кислоты. Материал и методы. Экспериментальные животные (крысы Wistar) были случайным образом поделены на 4 группы: контрольная группа (n=10); группа, фракционно облученная электронами в суммарной дозе 30 Гр (n=10); группа, которой вводили аскорбиновую кислоту перед фракционным воздействием электронами (n=10); группа, которой вводили только аскорбиновую кислоту. Сроки выведения из эксперимента - 90-е сутки. Затем, фрагменты яичников исследовали гистологическим и гистохимическим (окраска волокнистого компонента трихромом по Массону) методами. Результаты. После гистохимического окрашивания трихромом по Массону выявили, что воздействие облучения электронами на третьем месяце привело к усилению интенсивности окрашивания и увеличению площади соединительной ткани. В III-ей группе на фоне введения аскорбиновой кислоты перед облучением электронами отмечали снижение степени и площади окрашивания. Обсуждение. Обнаруженные в настоящем исследовании морфологический и гистохимический паттерны свидетельствуют о развитии признаков постлучевого фиброза яичников, вероятно, путем активации каскадов фактора роста TGF-р. Степень фиброзирования снижалась в группе предлучевого введения аскорбиновой кислоты, обладающей радиопротективными свойствами. Заключение. Предлучевое введение аскорбиновой кислоты приводит к снижению степени фиброза в модели поздней радиационно-индуцированной овариальной недостаточности после облучения электронами в суммарной дозе 30 Гр.
Ключевые слова: фиброз, электроны, яичник, аскорбиновая кислота, гистохимия
CHARACTERISTICS OF THE FIBROUS COMPONENT OF THE OVARY IN THE MODEL OF RADIATION-INDUCED OVARIAL INSUFFICIENCY
Demyashkin G. A.12, Pugacheva E. N.2, Murtazalieva Z. M.2, Vadyukhin M. A.2
1National Medical Research Center for Radiology, 249036, st. Koroleva, 4, Obninsk, Russia.
2First Moscow State Medical University named after I. M. Sechenov (Sechenov University), 119048, st. Trubetskaya, 8/2, Moscow, Russia.
SUMMARY
Most authors in the specialized literature describe the development of ovarian fibrosis in the late stages after exposure to ionizing radiation. The use of ascorbic acid, which has a proven antioxidant effect, can potentially reduce the range and depth of radiation-induced ovarian fibrosis in the long term. Aim of the study: to assess the degree of ovarian fibrosis in a model of chronic radiation damage and against the background of the administration of ascorbic acid. Material and methods. Experimental animals (Wistar rats) were randomly divided into 4 groups: control group (n=10); group fractionally irradiated with electrons at a total dose of 30 Gy (n=10); group that was administered ascorbic acid before fractional exposure to electrons (n=10); group that was administered only ascorbic acid. The withdrawal period from the experiment is the 90th day. Then, the ovarian fragments were examined by histological and histochemical (Masson trichrome staining of the fibrous component) methods. Results. After histochemical staining with Masson's trichrome, it was revealed that exposure to electron irradiation in the third month led to an increase in the intensity of
staining and an increase in the area of connective tissue. In group III, with the administration of ascorbic acid before electron irradiation, a decrease in the degree and area of staining was noted. Discussion. The morphological and histochemical patterns found in the present study indicate the development of signs of post-radiation ovarian fibrosis, probably through activation of the TGF-p growth factor cascades. The degree of fibrosis decreased in the group of pre-radiation administration of ascorbic acid, which has radioprotective properties. Conclusion. Pre-irradiation administration of ascorbic acid leads to a decrease in the fibrosis' degree in a model of late radiation-induced ovarian failure after electron irradiation with a total dose of 30 Gy.
Key words: fibrosis, electrons, ovary, ascorbic acid, histochemistry
Воздействие ионизирующего излучения как при проведении лучевой терапии злокачественных новообразований, так и при хроническом облучении организма (например, при техногенных катастрофах) может приводить к развитию отдаленных (поздних) радиационно-индуцированных осложнений. К наиболее частым из них в яичниках относятся атрофия, некроз, и фиброз, особенно при Х- и у-облучении [1; 2]. Считается, что увеличение мощности и дозы облучения прямо пропорционально приводит к усилению постлучевых токсических эффектов, как ранних, так и поздних [3]. Потенциально, среди всех видов ионизирующего излучения одним из наиболее «щадящих» является электронотерапия [4], однако величина «эффекта наблюдателя» в соседних органах и диапазон постлучевого повреждения органов при этом виде облучения остаются малоизученными.
Большинство авторов наблюдали развитие фиброза яичника в поздние сроки после воздействия ионизирующего излучения [5; 6], однако некоторые заявляют о его отсутствии [7]. Поэтому, противоречивость данных в специализированной литературе о фиброзировании яичников побуждает к проведению дополнительных исследований, а риск развития бесплодия еще более актуализирует тему.
Кроме того, в контексте защиты овофоллику-логенеза от воздействия ионизирующего излучения представляется интересным предлучевое введение аскорбиновой кислоты, которая обладает доказанным антиоксидантным эффектом и была апробирована на многих органах в качестве радиопротектора [8; 9], а ее применение потенциально может снизить диапазон и глубину радиа-ционно-индуцированного повреждения яичника.
Цель исследования: оценка состояния волокнистого компонента яичника при хроническом лучевом повреждении и предлучевом введении аскорбиновой кислоты.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Экспериментальное исследование проводили на крысах породы Wistar (п=40), которых рандом-ным образом делили на четыре группы:
I группа (п=10) - контрольная;
II группа (п=10) - фракционное локальное облучение электронами в суммарной очаговой дозе (СОД) 30 Гр;
III группа (n=10) - предлучевое введение аскорбиновой кислоты (интраперитонеально) в дозе 50 мг / кг за 1 час до локального облучения электронами в СОД 30 Гр;
IV группа (n=10) - предлучевое введение аскорбиновой кислоты (интраперитонеально) в дозе 50 мг / кг.
Сроки выведения из эксперимента. Через 3 месяца экспериментальных животных умерщвляли путем введения комбинированного препарата с высокой концентрацией анестетика. Болезненные процедуры проводились в строгом соответствии с требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации.
Гистологическое исследование.
Яичники экспериментальных животных оценивались макроскопически, после чего их нарезали параллельно сагиттальной плоскости с интервалом в 2 мм. Затем проводили фиксацию фрагментов в растворе формалина. По окончании проводки (аппарат гистологической проводки тканей, «Leica Biosystems», Германия) полученные фрагменты заливали в парафиновые блоки, которые использовали для подготовки гистологических срезов толщиной 3 мкм. Их депарафини-ровали, дегидратировали, после чего окрашивали гематоксилином и эозином.
По одному микропрепарату окрашивали с для гистохимического исследования по Массону с целью оценки волокнистого компонента яичника. Морфометрическую оценку после гистохимического окрашивания по Массону переводили в баллы на основании показателей площади и оптической плотности (хромогенности), выраженных в относительных единицах: «1» - слабое (0 - 0,3); «2» - умеренное (0,3 - 0,6); «3» - выраженное (>0,6).
Микропрепараты анализировали в десяти рандомных полях зрения светового микроскопа при увеличении ><400 в каждом из пяти срезов, случайным образом выбранных для каждого из образцов. Цифровые аналоговые изображения с полученных срезов были получены с использованием системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM3000, Германия; камера DFC450 C) и
2024, т. 14, № 1
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
программы, позволяющей морфометрически анализировать полученные изображения (Leica Application Suite V. 4.9.0).
Статистический анализ.
Полученные данные были обработаны в программе SPSS 12 (IBM Analytics, США). Количественные и полуколичественные данные выражены в форме среднее значение ± стандартная ошибка, а статистически значимым считали показатель р <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Гистологическое исследование.
В контрольной группе яичники снаружи были покрыты мезотелием, паренхима представлена корковым и мозговым веществом. В корковом веществе наблюдали фолликулы разных стадий овофолликулогенеза. Строма органа представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью и кровеносными сосудами (Рис. 1).
Через 3 месяца после воздействия фракционного облучения электронами в суммарной дозе 30 Гр отмечали развитие признаков фиброза: умеренное разрастание волокнистого компонента и резкое увеличение толщины стромальных соединительнотканных тяжей, строма при этом занимает до 1/Зчастиобъема органа, что согфо-вождается резким снижением доли примордиаль-ных фоллизнлов чкоркомомвещесове яичника (Рис. 1).
В то же время, введение аскообиловтй кмо-лоты перед облучением привело к уменьшению степени ралиационно-индуцированного фиброза
яичника после облучения электронами: волокнистый компонент занимал до 1/5 части объема органа, располагаясь преимущественно в корковом веществе. Кроме того, отмечали незначительное уменьшение доли примордиальных фолликулов по сравнению с контролем (Рис. 1).
Морфологическая картина яичников после введения аскорбиновой кислоты животным, не подвергнутым фракционному облучению электронами, визуально не отличалась от таковой в контрольной группе.
Гистохимическое исследование.
После гистохимического окрашивания трих-ромом по Массону выявили, что воздействие фракционного локального облучения электронами в суммарной дозе 30 Гр на третьем месяце привело к усилению интенсивности окрашивания анилиновым синим и увеличению площади коллагеновых и ретикулярных волокон (синий цвет), что указывает на выраженное разрастание волокнистого компонента, преимущественно в корковом веществе.
В Ш-ей группе на фоне введения аскорбиновой кислоты перед облучением электронами отмечали снижение степени и площади окрашивания анилиновым синим по сравнению с показателями 11-ой группы, что указывает на уме ньшение степени фиброзирования (Рис. 1).
Гистгошмическ^картинаялниковсо еле введения аскорбиновой кислоты животным, не под-верчнутым облучению электронами, не отличалась от таковой в контрольной группе на третьем месяцеэксперимента.
ГЭ
Моссои
Облучение Облучение + АК
Рис.1. Фрагменты яичников контрольной и опытных групп. Морфологическое (окрашивание гематоксилином и эозином) и гистохимическое(окрашиваниепоМассону) исследования, увелич.*400. Fig.1. Fragments of ovaries of the control and experimental groups. Morphological (hematoxylin and eosin staining) and histochemical (Masson staining) studies, magnification x400.
ОБСУЖДЕНИЕ
Настоящее исследование посвящено оценке степени радиационно-индуцированного фиброза яичника после воздействия фракционного локального облучения электронами в суммарной дозе 30 Гр и введения аскорбиновой кислоты.
Проведенное гистохимическое исследование с применением окрашивания по Массону демонстрировало преобладание волокнистого компонента в корковом веществе яичника через три месяца после воздействия фракционного локального облучения электронами. Вероятно, это связано с активацией сигнальных путей, ответственных за фиброзирование, наиболее изученным из которых в контексте радиационного поражения считается TGF-p/митоген-активиру-емая протеинкиназа (МАРК). Mantawy Е. с со-авт. доказали его круциальную роль в развитии радиационно-индуцированного фиброза яичника как исхода постлучевой овариальной недостаточности с резким увеличением концентраций всех ключевых участников этого пути: TGF-P, мито-ген-активируемых протеинкиназ, р38 и С^ип п-терминальных киназ (ЖК) [10]. Кроме того, наши результаты согласуются с данными некоторых авторов при исследовании воздействия других видов ионизирующего излучения на яичники с развитием радиационно-индуцированного фиброза в отдаленные сроки [5; 6].
Известно, что ионизирующее излучение запускает как прямые (лучевое повреждение генетического материала), так и косвенные (генерация продуктов радиолиза клеточной воды, перекис-ного окисления липидов и др.) механизмы ци-тотоксичности, что инициирует и индуцирует клеточную гибель в радиочувствительных органах посредством апоптотического каскада (не исключена роль митохондриально-опосредован-ной гибели клеток и ферроптоза) [11; 12]. Это объясняет значительное снижение количества фолликулов, особенно примордиальных, фрак-ционно облученных электронами. Кроме того, в соответствии с базовыми представлениями о репарации, лучевая гибель большого числа клеток фолликулов сопровождается высвобождением провоспалительных факторов и воспалением с последующим замещением дефекта соединительной тканью, то есть - развитием фиброза в отдаленные сроки.
Учитывая невозможность медикаментозного влияния на прямой механизм радиационных повреждений, большинство исследований в области разработки радиопротекторов основаны на поиске субстратов, способных снижать оксидативный стресс в тканях, тем самым предотвращая гибель клеток косвенным механизмом [1; 13]. Многообе-
щающим является применение антиоксидантов, например, аскорбиновая кислота.
Предлучевое введение аскорбиновой кислоты привело к менее выраженному радиацион-но-индуцированному фиброзу в яичниках III-ей группы спустя три месяца после фракционного облучения электронами в суммарной дозе 30 Гр, что подтверждено результатами гистохимического исследования с применением окрашивания по Массону. Вероятно, такой эффект связан со способностью аскорбиновой кислоты связывать свободные радикалы, тем самым купируя оксида-тивный стресс и поддерживая функциональную состоятельность физиологической антиоксидант-ной защиты [8].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предлучевое введение аскорбиновой кислоты приводит к снижению степени фиброза в модели поздней радиационно-индуцированной овари-альной недостаточности, возникшей в результате фракционного воздействия электронов в суммарной дозе 30 Гр.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Mantawy E. M., Said R. S., Kassem D. H., Abdel-Aziz A. K., Badr A. M. Novel molecular mechanisms underlying the ameliorative effect of N-acetyl-L-cysteine against Y-radiation-induced premature ovarian failure in rats. Ecotoxicol Environ Saf. 2020;206:111190. doi:10.1016/j. ecoenv.2020.111190.
2. Skrzypek M., Wdowiak A., Panasiuk L. Effect of ionizing radiation on the female reproductive system. Ann Agric Environ Med. 2019;26(4):606-616. doi:10.26444/aaem/112837.
3. Kim S., Kim S. W., Han S. J. Molecular Mechanism and Prevention Strategy of Chemotherapy- and Radiotherapy-Induced Ovarian Damage. Int J Mol Sci. 2021;22(14):7484. doi:10.3390/ijms22147484.
4. Demyashkin G., Koryakin S., Moiseev A. Assessment of Proliferation and Apoptosis in Testes of Rats after Experimental Localized Electron Irradiation. Curr Issues Mol Biol. 2022;44(11):5768-5777. doi:10.3390/cimb44110391.
5. Reiser E., Bazzano M. V., Solano M. E. Unlaid Eggs: Ovarian Damage after Low-Dose Radiation. Cells. 2022;11(7):1219. doi:10.3390/ cells11071219.
6. Haddad Y. H., Said R. S., Kamel R., Morsy E. M. E., El-Demerdash E. Phytoestrogen genistein hinders ovarian oxidative damage and apoptotic cell
2024, т. 14, № 1
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
death-induced by ionizing radiation: co-operative role of ER-ß, TGF-ß, and FOXL-2. Sci Rep. 2020;10(1):13551. doi:10.1038/s41598-020-70309-2.
7. Kimler B. F., Briley S. M., Johnson B. W., Armstrong A. G., Jasti S., Duncan F. E. Radiation-induced ovarian follicle loss occurs without overt stromal changes. Reproduction. 2018;155(6):553-562. doi:10.1530/REP-18-0089.
8. Attia A. A., Hamad H. A., Fawzy M. A. The Prophylactic Effect of Vitamin C and Vitamin B12 against Ultraviolet-C-Induced Hepatotoxicity in Male Rats. Molecules. 2023;28(11):4302.
9. Zarei H., Bahreinipour M., Sefidbakht Y. Radioprotective Role of Vitamins C and E against the Gamma Ray-Induced Damage to the Chemical Structure of Bovine Serum Albumin. Antioxidants (Basel). 2021;10(12):1875. doi:10.3390/ antiox10121875.
10. Mantawy E. M., Said R. S., Abdel-Aziz A. K. Mechanistic approach of the inhibitory effect of chrysin on inflammatory and apoptotic events
implicated in radiation-induced premature ovarian failure: Emphasis on TGF-p/MAPKs signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2019;109:293-303. doi:10.1016/j.biopha.2018.10.092.
11. Zhao J., Tang M., Tang H. Sphingosine 1-phosphate alleviates radiation-induced ferroptosis in ovarian granulosa cells by upregulating glutathione peroxidase 4. Reprod Toxicol. 2023;115:49-55. doi:10.1016/j.reprotox.2022.12.002.
12. Reisz J. A., Bansal N., Qian J., Zhao W., Furdui C. M. Effects of ionizing radiation on biological molecules-mechanisms of damage and emerging methods of detection. Antioxid Redox Signal. 2014;21(2):260-292. doi:10.1089/ ars.2013.5489.
13. Joshi D., Mittal D. K., Shukla S., Srivastav A. K., Srivastav S. K. N-acetyl cysteine and selenium protects mercuric chloride-induced oxidative stress and antioxidant defense system in liver and kidney of rats: a histopathological approach. J Trace Elem Med Biol. 2014;28(2):218-226. doi:10.1016/j. jtemb.2013.12.006
