CC BY
24regulatory mutants Using 1D-PAGE and nanocapillary LC coupled with tandem MS. J. Bacteriol. 2008, 190 (15): 5265-5278.
17. King J.T., Goulet J.L., Perkal M.F., Rosenthal R.A. Glicemic control and infections in patients with diabetes undergoing noncardiac surgery. Ann. Surg. 2011, 253: 158-165.
18. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage. Nature. 1970, 4 (227): 680-685.
19. Mohan V., Unnikrishnan R., Thomas N. et al. Pneumococcal infection and immunization in diabetic patients. J. Postgrad. Med. 2011, 57: 78-81.
20. Nakano M., Kawano Y., Kawagish M. et al. Two-dimensional analysis of exoproteins of me-thicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) for possible epidemiological applications. Microbiol Immunol. 2002, 46: 11-22.
21. Sibbald M.J., Ziebandt A.K., Engelmann S. et al. Mapping the pathways to staphylococcal pathogenesis by comparative secretomics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006,70: 755-788.
22. The UniProt Consortium. The universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 2007, 35: D193-D197.
23. Ziebandt A.K., Becher D., Ohlsen K. et al. The influence of agr and sigmaB in growth phase dependent regulation of virulence factors in Staphylococcus aureus. Proteomics. 2004, 4: 3034-3047.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Грубер Ирина Мироновна,
105064, Москва, М.Казенный пер.,5а, р. т. (495)916-20-47
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
О.В.Бухарин1, И.В.Валышева1, О.Л.Карташова1, М.В.Сычева2
ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУЛЕНТНОГО ПОТЕНЦИАЛА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ЭНТЕРОКОККОВ
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург; 2Оренбургский государственный аграрный университет
Цель. Определение вирулентности штаммов энтерококков, выделенных из клинического материала от человека, на фено- и генотипическом уровне. Материалы и методы. В исследовании использовано 30 штаммов энтерококков, выделенных из раневого экссудата, мочи, смыва с кожи новорожденных. Идентификацию штаммов осуществляли с помощью мультиплексной ПЦР. Гемолитическую активность определяли чашечным методом, желатиназную — по разжижению столбика желатины, про-теолитическую — биуретовым методом; гены, кодирующие синтез факторов вирулентности (gelE, sprE, cylM, cylB, cylA, cylLs, cylLl, ESP, HYL, ASA) — с помощью ПЦР. Результаты. Клинические изоляты энтерококков отнесены к видам E. faecalis и E. faecium. Выявлены факторы вирулентности на фенотипическом и генотипическом уровне у обоих видов. Заключение. Генетические детерминанты вирулентности более широко распространены среди клинических изолятов вида E. faecalis. Набор генов, кодирующих факторы вирулентности, у E. faecalis зависит от биотопа. Для E. faecium характерен ген, кодирующий синтез гиалуронидазы. Выявлена корреляционная связь между фенотипическим проявлением признаков и генотипом энтерококков.
Журн. микробиол., 2013, № 3, С. 12—18
Ключевые слова: Enterococcus, инфекция, вирулентность, ПЦР, гены вирулентности
O.V.Bukharin1, I.V.Valysheva1, O.L.Kartashova1, M.V.Sycheva2
CHARACTERISTIC OF VIRULENCE POTENTIAL OF CLINICAL ISOLATES OF ENTE-ROCOCCI
1Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg; Orenburg State Agrarian University, Russia
Aim. Determination of virulence of enterococci strains isolated from clinical material from humans on pheno- and genotype levels. Materials and methods. 30 strains of enterococci isolated from wound exudate, urine, newborn skin lavage were used in the study. Strain identification was carried out by multiplex PCR. Hemolytic activity was determined by dish method, gelatinase — by dissolution of gelatin column, proteolytic — by biuret method; genes coding virulence factor synthesis (gelE, sprE, cylM, cylB, cylA, cylLs, cylLl, ESP, HYL, ASA) — by using PCR. Results. Clinical isolates of enterococci were assigned to E. faecalis and E. faecium species. Virulence factors on phenotype and genotype levels were detected in both species. Conclusion. Genetic determinants of virulence are more widespread among clinical isolates of E. faecalis species. Set of genes coding virulence factors in E. faecalis depends on biotope. Gene coding hyaluronidase synthesis is characteristic for E. faecium. A correlation between phenotypic manifestation of features and enterococci genotype was detected.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 3, P. 12—18
Key words: Enterococcus, infection, virulence, PCR, virulence genes
ВВЕДЕНИЕ
Нозокомиальные и оппортунистические инфекции являются одной из проблем современной медицины. Ведущими возбудителями этих инфекций длительное время считали Escherichia coli и Staphylococcus aureus. В настоящее время список этиологических агентов данной патологии значительно расширился. При этом, на лидирующие позиции вышли и микроорганизмы рода Enterococcus.
Большое внимание оппортунистическим и нозокомиальным инфекциям эн-терококковой этиологии уделяют зарубежные исследователи [1].
На территории РФ данные инфекции, включая энтерококковую, в настоящее время также приобрели характер серьезной медико-социальной проблемы [2].
Энтерококки со значительной частотой поражают мочевыводящие пути, занимая 2 место после кишечной палочки [3]. В гинекологическом стационаре микроорганизмы рода Enterococcus часто выделяются от пациенток с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта и имеют большое количество генов вирулентности [4].
Достаточно часто энтерококки рассматривают как контаминанты, клиническая значимость которых возрастает в зависимости от тяжести соматического состояния больных. В то же время, при энтерококковых инфекциях кровотока, ассоциированных с введением катетера, смертность достигает 33% (Reigadas E. et al., 2012). В качестве осложнений, возникающих при нозокомиальных и оппортунистических инфекциях, вызванных микроорганизмами рода Enterococcus, называют эндокардит (Lin Y.T et al., 2012), остеомиелит (Kow N., Ferzandi T.R., 2012), которые могут привести к летальному исходу.
Микроорганизмы рода Enterococcus могут обладать широким спектром факторов вирулентности, что повышает вероятность возникновения энтерококковой инфекции и развития осложнений [8].
К факторам, способствующим развитию энтерококковых инфекций, относят
детский и пожилой возраст, наличие иммунодефицита, длительное нахождение в стационаре, инвазивные воздействия (катетеры, искусственная вентиляция легких) [12].
По данным С.В. Сидоренко (2003), среди клинических изолятов 80 — 90% приходится на E. faecalis и 5 — 10% — на E. faecium. Ограниченное значение имеют такие виды, как E. gallinarum, E. flavescens, E. casseliflavus, E. hirae [6].
Учитывая усиливающееся клиническое значение энтерококков как возбудителей оппортунистических и нозокомиальных инфекций представляется важным идентификация возбудителя и определение набора генов вирулентности.
Отсутствие данных по комплексной фенотипической и генетической характеристике факторов вирулентности энтерококков, выделенных на территории Оренбурга, предопределило цель настоящего исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования явились 30 штаммов энтерококков, выделенных из клинического материала от человека. Из них 14 штаммов — из мочи при инфекции мочевыводящих путей; 7 штаммов — из раневого экссудата; 9 штаммов
— из смывов с кожи новорожденных при наличии воспалительных заболеваний урогенитального тракта у рожениц.
Энтерококки выделяли путем посева исследуемого материала на среду Enterococcosel agar (BD, США). Микроорганизмы идентифицировали до вида с помощью мультиплексной ПЦР по наличию видовых генов [7].
Гемолитическую активность определяли чашечным методом, желатиназную
— по разжижению столбика желатины, протеолитическую — биуретовым методом [5]; гены, кодирующие синтез факторов вирулентности (gelE, sprE, cylM, cylB, cylA, cylLs, cylLl, esp, HYL, ASA) — с помощью ПЦР [9 — 11].
Для ПЦР-амплификации использовали известные праймеры, синтез которых осуществляла компания «Синтол» (Москва) (табл.).
Для постановки ПЦР бактериальные лизаты получали с помощью реагента «ДНК-ЭКСПРЕСС» (Литех, Россия). Амплификацию проводили в термоцикле-ре «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). Реакционная смесь включала бактериальный лизат (1 мкл), специфические праймеры (по 1 мкл), дезоксирибонуклео-зидтрифосфаты, буфер, фермент Taq-полимеразу, хлорид магния. Реакционную смесь доводили до 25 мкл водой без нуклеаз.
ПЦР для выявления генов, кодирующих факторы вирулентности, проводили по протоколу: 1 цикл — 92°C, 3 мин; 5 циклов — 92°C, 5 с, 59°C, 5 с, 72°C, 5 с; 25 циклов — 1 мин при 92°C, 1 мин при 59°C, 1 мин при 72°C; последний цикл включал 20 с при 92°C, 1 мин — 59°C и элонгацию в течение 10 мин при 72°C. Протокол амплификации видоспецифических генов содержал денатурацию при 92°C в течение 4 минут, затем 30 циклов, включающих 30 с при 92°C, 1 мин при 55°C, 1 мин при 72°C, после чего проведение элонгации в течение 10 мин при 72°C.
Продукты амплификации генов анализировали путем электрофоретиче-ского разделения в горизонтальном 1% или 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете. В качестве маркеров использовали GeneRuler 1 kbp DNA Ladder и GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определенной массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс. Для документирования полученных результатов гелевые пластины фотографировали.
Праймеры, использованные для выявления генов энтерококков
Продукт Ген Последовательность 5'-3' Размер продукта реакции, п.н.
Желатиназа Ее1Е ACCCCGTATCATTGGTTT ACGCATTGCTTTTCCATC 419
Синтез цитолизина суШ GATGGAGGGTAAGAATTATGG GCTTCACCTCACTAAGTTTTATAG 253
Синтез цитолизина су^ GAAGCACAGTGCTAAATAAGG GTATAAGAGGGCTAGTTTCAC 240
Посттрансляционная модификация цитолизина су1М CTGATGGAAAGAAGATAGTAT TGAGTTGGTCTGATTACATTT 742
Транспорт цитолизина су1В ATTCCTACCTATGTTCTGTTA AATAAACTCTTCTTTTCCAAC 843
Активация цитолизина су1А TGGATGATAGTGATAGGAAGT TCTACAGTAAATCTTTCGTCA 517
Гиалуронидаза HYL ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG GACTGACGTCCAAGTTTCCAA 276
Поверхностный белок-адгезин АБА GCACGCTATTACGAACTATGA TAAGAAAGAACATCACCACGA 375
Сериновая протеиназа БргЕ GCGTCAATCGGAAGAATCAT CGGGGAAAAAGCTACATCAA 233
Белок-иммуносупрессор Е. ГаесаШ еБрГз TTGCTAATGCTAGTCCACGACC GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA 933
Белок-иммуносупрессор Е. Гаесшт еБрГт TTGCTAATGCAAGTCACGTCC GCATCAACACTTGCATTACCGAA 955
Сериновая протеаза БргЕ GCGTCAATCGGAAGAATCAT CGGGGAAAAAGCTACATCAA 233
Супероксиддисмутаза (1 группа) Е. ёигап БоёА DU CCTACTGATATTAAGACAGCG TAATCCTAAGATAGGTGTTTG 295
Супероксиддисмутаза (1 группа) Е. ГаесаШ БоёА FL ACTTATGTGACTAACTTAACC TAATGGTGAATCTTGGTTTGG 360
Супероксиддисмутаза (1 группа) Е. Гаесшт БоёА FM GAAAAAACAATAGAAGAATTAT TGCTTTTTTGAATTCTTCTTTA 215
Супероксиддисмутаза БоёА GTAACGAACTTGAATGAAGTG 134
(1 группа) Е. таЬёогаШБ МА TTGATCGCACCTGTTGGTTTT РЕЗУЛЬТАТЫ
Микроорганизмы рода ЕПетососсш были выделены из 13% проб раневого экссудата, 18% проб мочи и из 39% смывов с кожи новорожденных.
В результате идентификации, проведенной с помощью мультиплексной ПЦР, 26 изолятов (87%) были отнесены к виду ЕПегососсш ГаесаШ, 4 (13%) — к виду ЕПетососсш Гаесшт. Е. Гаесшт были выделены из мочи и составляли 29% от общего числа урокультур энтерококков.
Гемолитическая активность выявлена у 62% штаммов Е. ГаесаШ. Большинство гемолитических штаммов Е. ГаесаШ выделено с кожи новорожденных (89%) и из мочи (70%). Только 14% культур из раневого экссудата обладало способностью разрушать эритроциты человека (рис.).
у 'Jf с/ ^ </ & V & Г
□ Моча Ш эчиздщгг Щ Kwa щмщхведвчшч
Вирулентный потенциал клинических изолятов E. faecalis.
По оси абсцисс — факторы вирулентности, по оси ординат — %
Желатиназная активность выявлена у 50% штаммов вида E. faecalis и 25% культур E. faecium (1 штамм). Чаще всего желатиназную активность проявляли штаммы, выделенные с кожи новорожденных (78%), реже — культуры, выделенные из мочи (50%), и очень редко — штаммы, выделенные из раневого экссудата (14%).
Протеолитическая активность выявлена у всех изученных штаммов энтерококков обоих видов.
Комплекс генов, кодирующих синтез цитолизина (cylA, cylB, cylM, cylLl), обнаружен только у штаммов E. faecalis. Большинство штаммов (67%), выделенных с кожи новорожденных, содержали ген cylA, отвечающий за активацию цитолизина, ген cylM, обеспечивающий посттрансляционную модификацию, ген cylB, необходимый для транспорта цитолизина, и ген cylLl, отвечающий за синтез структурных единиц цитолизина. Среди культур E. faecalis, выделенных из мочи, данный комплекс генов встречался в 40% случаев. Ген cylA обнаружен у 14% штаммов, выделенных из раневого экссудата, комплекс остальных генов cyl-оперона — у 29% изолятов. Ни у одного из изученных штаммов не обнаружен ген cylLs.
Гены, обусловливающие протеолитическую активность (GelE и sprE), выявлены у 73% культур E. faecalis, выделенных из раневого экссудата, у 78% клинических изолятов с кожи новорожденных и у 90% штаммов, выделенных из мочи.
Ген, ответственный за продукцию гиалуронидазы, был выявлен только у 50% клинических изолятов, принадлежащих к виду E. faecium.
Ген, кодирующий белки клеточной стенки, ответственные за уклонение от иммунных сил макроорганизма (ESP), содержали 73% штаммов E. faecalis, выделенных из раневого экссудата, 70% урокультур E. faecalis и 67% изолятов с кожи новорожденных. Установлено, что ген, отвечающий за синтез поверхностного белка-адгезина (ASA), содержали 78% штаммов, выделенных с кожи новорожденных, 90% изолятов из мочи и 43% штаммов из раневого экссудата.
Методом корреляционного анализа выявлена связь между фенотипическим проявлением некоторых признаков и генотипом энтерококков, выделенных из различных источников. Такая связь была обнаружена у E. faecalis между проявле-
нием гемолитической активности и наличием комплекса генов Cy1-оперона. Данные коэффициента корреляции (г) составили 0,53 для штаммов, выделенных из мочи, 0,65 — из гноя, 0,50 — из смывов с кожи новорожденных (р>0,05). Прямая корреляционная связь также выявлена между проявлением гемолитической активности и наличием гена, кодирующего адгезины. Коэффициент корреляции составил соответственно 0,51; 0,47 и 0,66. Коэффициенты корреляции между наличием у энтерококков других фенотипических признаков и генов были на низком уровне.
ОБСУЖДЕНИЕ
Таким образом, совокупность микробиологических и молекулярно-генетических методов исследования показала, что подавляющее большинство клинических изолятов энтерококков обладает факторами вирулентности на фе-нотипическом и генотипическом уровне.
Генетические детерминанты вирулентности более широко распространены среди клинических изолятов вида Е. ГаесаШ по сравнению с видом Е. Гаесшт.
Ген, кодирующий синтез гиалуронидазы, оказался характерным только для Е. Гаесшт. Вероятно, клиническая значимость данных культур связана с наличием антибиотикорезистентности, широко распространенной среди микроорганизмов вида Е. Гаесшт.
У Е. ГаесаШ набор факторов вирулентности изменялся в зависимости от локализации. Так, для урокультур Е. ГаесаШ характерна широкая распространенность гемолитической активности, а также генов, кодирующих протеолитические ферменты и адгезины (выявлены у 90% штаммов).
Среди Е. ГаесаШ, выделенных из раневого экссудата, были распространены гены, кодирующие протеолитические ферменты и белки, способствующие уклонению от иммунной системы.
Штаммы, выделенные с кожи новорожденных, характеризовались широкой распространенностью всех изученных факторов вирулентности как на феноти-пическом, так и на генотипическом уровне.
Прямая корреляция между гемолитической активностью и наличием генов су1-оперона у микроорганизмов вида Е. ГаесаШ связана с функцией цитолизина. Данный бактериоцин является одновременно и гемолизином [8]. Наличие адгезии, обусловленное соответствующим геном, вероятно, повышает эффективность мембранолизинов, что, в свою очередь, зарегистрировано нами по наличию прямой корреляционной связи между данными признаками.
Вероятно, особенности вирулентного генотипа штаммов Е. ГаесаШ, выделенных из различного клинического материала, связаны с присутствующими в том или ином биотопе факторами естественной резистентности и специфического иммунитета. В частности, широкая распространенность генов су1-оперона среди культур, выделенных с кожи новорожденных, говорит о способности данных изолятов колонизировать биотоп за счет бактериоциногенной активности. У культур, выделенных из материала, в норме не содержащего микроорганизмы, гены су1-оперона встречались значительно реже. В то же время, эти штаммы обладали протеолитическими ферментами, обеспечивающими инвазию и инактивацию факторов врожденного и приобретенного иммунитета.
Наличие выраженного вирулентного потенциала у штаммов, выделенных с кожи новорожденных, от рожениц с воспалительными заболеваниями урогени-тального тракта позволяет предположить высокую вероятность развития оппортунистической энтерококковой инфекции у детей и прогнозировать риск развития осложнений.
Работа выполнена по программе Президиума РАН«Механизмы интеграции молекулярных систем при реализации физиологических функций» в рамках проекта № 12-П-4-1045 «Изучение интегра-
2. ЖМЭИ 3 № 5184
17
ционных механизмов межмикробных взаимоотношений микросимбионтов кишечной микробиоты
человека».
ЛИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В., Валышев А.В. Биология и экология энтерококков. Екатеринбург, УрО РАН, 2012.
2. Вершинин А.Е., Колоджиева В.В., Ермоленко Е.И. и др. Генетическая идентификация как способ выявления патогенных и симбиотических штаммов энтерококков. Журн. микробиол. 2008, 5: 83-87.
3. Габриэлян Н.И., Горская Е.М., Спирина Т.С. и др. Энтерококки как возбудители послеоперационных инфекционных осложнений. Журн. микробиол. 2007, 4: 50-53.
4. Колоджиева В.В. Эпидемиологические особенности гнойно-септических инфекций, вызванных энтерококками и стрептококками группы В у пациентов гинекологического стационара и женской консультации. Автореф. канд. дис. СПб., 2006.
5. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии. М., Академия, 2005.
6. Сидоренко С.В. Клиническое значение антибиотикорезистентности грамположитель-ных микроорганизмов. Инфекции и антимикробная терапия. 2003, 5 (2): 3-5.
7. Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. J. Clin. Microbiol. 2004, 42 (8): 3558-3565.
8. Jett B.D., Huycke M.M., Gilmore M.S. Virulence of enterococci. Clin. Microbiol. Rev. 1994, 7 (4): 462-478.
9. Reviriego C., Eaton T., Martin R. et al. Screening of virulence determinants in Enterococcus faecium strains isolated from breast milk. J. Hum. Lact. 2005, 21 (2): 131-137.
10. Semedo T., Santos M.A., Martins P. et al. Comparative study using type strains and clinical and food isolates to examine hemolytic activity and occurrence of the cyl operon in enterococci. J. Clin. Microbiol. 2003, 6 (41): 2569-2576.
11. Vankerckhoven V., Van Autgaerden T., Vael C. et al. Development of a Multiplex PCR for the detection of asa1, gelE, cylA, esp, and hyl genes in enterococci and survey for virulence determinants among european hospital isolates of Enterococcus faecium. J. Clin. Microbiol. 2004, 10 (42): 4473-4479.
12. Zhang L., Liu Z.Y., Xu Y.C. et al. Clinical analysis of adult primary bloodstream infection. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2012, 92 (13): 894-898.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Валышева Ирина Викторовна, к.б.н.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532) 77-54-17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 Л.В.Лагун, Ю.В.Атанасова, Д.В.Тапальский
ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОБНЫХ БИОПЛЕНОК У ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСТРОГО И ХРОНИЧЕСКОГО ПИЕЛОНЕФРИТА
Гомельский государственный медицинский университет, Республика Беларусь
Цель. Изучение интенсивности формирования микробных биопленок штаммами Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, выделенными при различных формах пиелонефрита. Материалы и методы. В исследование включено 150 клинических изолятов микроорганизмов, выделенных из мочи пациентов с острым и хроническим пиелонефритом. Определение интенсивности плен-кообразования проводили путем окрашивания сформированных биопленок кристаллическим фиолетовым с последующей экстракцией красителя и измерением его концентрации в отмывочном растворе. Результаты. Среди возбудителей пиелонефрита максимальной пленкообразующей способностью обладали изоляты P. aeruginosa. Интенсивность формирования биопленок данных изолятов была в 2 — 3 раза выше, чем
