CC BY
8
УДК 577.175.8
ХАРАКТЕРИСТИКА УГЛЕВОД-РАСПОЗНАЮЩИХ ЦЕНТРОВ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ БЫКА И ЧЕЛОВЕКА
Чемоданова Е.Е.1, Орт Т.А1 , Насонов В.В.2, Бовин Н.В.2, Кост О.А.1*.
(Химический факультет, Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова, Москва 119899, Россия; Институт Биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, РАН, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Москва 117871, Россия, Fax: (7 ) (095) 9395417. Phone: (7) (095) 9393417. E-mail: kost@enzyme.chem.msu.ru)
Показано, что ангиотеюин-превращающие ферменты (АПФ) быка и человека могут существовать в системе обращенных мицелл, моделирующих мембранное окружение фермента, как в мономерной, так и димерной формах с сохранением каталитической активности. Димеризация является обратимым процессом и специфично контролируется углеводами. Изучено влияние углеводов различной структуры на образование димеров АПФ. Специфика действия углеводов на димеризацию АПФ быка и человека практически одинакова. Различия наблюдаются лишь во влиянии некоторых олигосахаридов, таких как 3'SiaLac, 6'SiaLac, Lac-ol. Показано, что асиало- и агалакто-АПФ быка и человека способны к формированию димеров в системе обращенных мицелл, в то время как асиало-агалакто-АПФ не образует димера.
Соматический ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидгидролаза, КФ 3.4.15.1) представляет собой один из физиологически важных гликопротеи-нов в организме человека и животных. Одной из наиболее изученных физиологических функций АПФ является участие в регуляции кровяного давления и водно-солевого обмена [1]. Соматический АПФ К-гликозилирован; содержание углеводов (7-33%), количество сайтов гликози-лирования, а также структура олигосахаридных цепей сильно зависят от источника выделения фермента [2, 3]. АПФ человека и быка имеют 17 и 16 потенциальных сайтов для К-гликозилирования, соответственно [4, 5], но количество реально гликозилированных сайтов для АПФ человека, крысы, кролика и морской свинки было оценено равным 7-8 [3]. Свои основные физиологические функции АПФ выполняет в составе биологических мембран. В этих условиях свойства фермента могут существенно отличаться от его свойств в водной гомогенной среде. Для выявления возможного влияния мембранного микроокружения на характеристики фермента используют модельные системы, такие как система обращенных мицелл АОТ-вода-октан [6]. Каталитическая активность ферментов в этой системе зависит от степени гидратации -параметра, определяющего размеры внутренней полости мицелл. Подобные зависимости обычно имеют колоколо-образный вид, где оптимум активности приходится на степень гидратации, которая отвечает радиусу внутренней полости мицеллы, совпадающему с радиусом глобулы фермента [6].
Использование этой системы позволило показать, что АПФ из легких быка может функционировать в мономер-
ной и димерной формах, причем образование димера специфично контролируется углеводами [7]. Эти данные позволили предположить существование на молекуле фермента углевод-распознающего центра.
В настоящей работе оценены структурные требования углевод-распознающих центров АПФ быка и человека.
Материалы и методы
Нейраминидаза (Е.С. 3.2.1.18) из Vibrio cholerae и b-га-лактозидаза из Aspergillus oryzae («Serva», Германия). Фурилакрилоил-Ь-фенилаланип-глицил-глицин (FA-Phe-Gly-Gly) («Sigma», США). Натриевая соль ди-(2-этил)гексило-вого эфира сульфоянтарной кислоты (аэрозоль ОТ, АОТ) («Fluka», Австрия). Моносахариды, метилгликозиды, лактоза, сиалиллактозы, сиалиллактозамин («Sigma», США). Олигосахаридные цепи АПФ быка, -кислого гликопроте-ина человека, овальбумина, фетуина, иммуноглобулина G и a-фибриногена получены гидразинолизом.
Получение АПФ. АПФ выделяли из легких быка или мембранной фракции почек человека экстракцией в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 150 мМ NaCl, 1 мкМ ZnCl2, 0,1% Тритон X-100. Затем ферменты очищали до электрофоретической гомогенности посредством аффинной хроматографии на лизиноприл-агарозе [8]. При выделении АПФ человека боратный буфер содержал 0,1% Тритона Х-100.
Получение асиало-АПФ. Десиалирование АПФ быка и человека проводили с помощью нейраминидазы (0,3 ед. на 0,05 мг АПФ) по [8].
Получение агалакто-АПФ. Дегалактозилирование на-тивного АПФ или асиало-АПФ осуществляли b-галактози-
*Адресат для переписки.
дазой (0,1 ед. на 0,05 мг АПФ) в 0,5 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера при рН 6,0. Реакцию проводили в течение 24 ч при 37°.
Кинетические эксперименты в обращенных мицеллах тройной системы АОТ-вода-октан проводили как описано в [7].
Результаты и их обсуждение
В работе мы исследовали АПФ, выделенный из легких быка, и АПФ, выделенный из коры почек человека. Полученные препараты ферментов были электрофоретически гомогенными. Содержание активных молекул для обоих ферментов составляло 95-97%.
В водных растворах фермент обычно функционирует в виде мономера [9], но есть данные о том, что в экстрактах и концентрированных растворах [10] АПФ может агрегировать. Более того, проведение электрофореза в неденатурирующих условиях показало [3],что АПФ из нескольких источников способны димеризоваться. Ранее мы продемонстрировали способность АПФ быка формировать димер в обращенных мицеллах тройной системы АОТ-в ода-октан [7]. В данной работе мы применили этот подход для фермента человека. Для обоих ферментов на зависимости каталитической активности от степени гидратации наблюдалось два оптимума при = 27 и 31 (рис. 1, кривая 1), указывающие на существование
100 -
80 -
60 -
40 -
20
25
30
35
Ж0, [И20]/[Л0Т]
Рис. 2. Влияние на образование димера АПФ человека в системе обращенных мицелл ^ацетилнейраминовой кислоты (№и5Лс), мМ: 1 - 1; 2 - 6 ; 3 - 10 (0,3 М АОТ в октане, 50 мМ Нере8-буфер с рН 7,5, содержащий 150 мМ КаС1, 10 мкМ 2пС12, концентрация АПФ 10-8 М, концентрация субстрата 7,5-10 5 М)
Т а б л и ц а 1
Влияние углеводов на образование димера АПФ быка и человека
100
80
60
40
20
25
30
"Т"
35
Ж0, [Н20]/[Л0Т]
Рис. 1. Зависимость каталитической активности АПФ от степени гидратации в обращенных мицеллах тройной системы АОТ-вода-октан (активность АПФ при степени гидратации = 27 принята за 100%): 1 - нативный, асиало- или агалакто-АПФ быка и человека; 2 - последовательно асиалированный, агалактозилированный АПФ быка и человека (0,3 М АОТ в октане, 50 мМ Нере8-буфер с рН 7,5, содержащий 150 мМ №С1, 1 мкМ 2пС12, концентрация АПФ 10 М, концентрация субстрата 7,5-10-5 М)
Концентрация углевода, при которой
Углеводы не наблюдается образование димера
фермента, М
АПФ быка АПФ человека
Моносахариды
О1о, ОаШЛе 10-1 10-1
ОШАс 10-2 10-2
Мап, №и5ЛсР-ОМе 10-3 10-3
Бис 10-4 10-4
Оаф-ОМе 10-4 10-4
Оа1 10-5 10-5
Оаф-ОМе 10-5 10-5
№и5Лс 10-5 10-5
№и5Лса-ОМе 10-5 10-5
Олигосахариды
Ьас 10-3 10-3
Ьас-о1 10-5 10-4
б^аЬас 10-5 10-6
З^аЬас 10-6 10-5
3^1аЬас-о1 10-6 10-6
З^аЬасКЛс 10-6 10-6
Пул олигосахаридов*
OSagp 10-7 10-7
10-' 10-7
OSIgG 10-7 10-7
OSf 10-6 10-5
10-3 10-3
* Пул ^цепей а 1-кислого гликопротеина (08^р ); асиало-биантенные цепи а-фибриногена (0Sfg) или иммуноглобулина О (08^о); триантенные цепи фетуина (08$; высокоманнозные цепи овальбумина (08оу)-
двух форм фермента. Результаты седиментационного анализа, проведенные для АИФ быка [7] показали, что при степенях гидратации ниже << 30 в системе находится мономерная форма АИФ, а при >> 30 - только его димерная форма. Таким образом, первый максимум активности при = 27 соответствует функционированию в системе мономера, а второй максимум при -
функционированию димера фермента. Таким образом, способность к образованию каталитически активной ди-мерной формы является общим свойством соматических двудоменных ангиотензин-превращающих ферментов из различных источников.
Димеризацию нативного соматического АИФ можно нарушить добавлением свободных углеводов в реакционную среду. Для АИФ человека были получены данные, демонстрирующие влияние углеводов на формирование второго оптимума при = 31, соответствующего функционированию димера. Так, например, увеличение содержания К-ацетилнейраминовой кислоты в системе приводило к постепенному уменьшению и, наконец, исчезновению второго пика активности АИФ (рис. 2), аналогично наблюдаемым ранее результатам [7] для АИФ быка. Ио-лученные данные позволяют заключить, что образование димеров обоих ферментов осуществляется за счет одинаковых взаимодействий с участием собственных олигосаха-ридных цепей АИФ, т.е. взаимодействие АИФ-АИФ происходит за счет образования углевод-белковых контактов с участием углевод-рас познающих центров этих ферментов.
Свободные углеводы, добавленные в реакционную среду, конкурируют с олигосахаридными цепями одной молекулы АИФ за центр связывания на другой. Таким образом, свободные углеводы могут быть рассмотрены как ингибиторы димеризации АИФ, а подавление димериза-ции АИФ углеводами разного строения, в свою очередь, может быть использовано как подход для изучения специфичности и структуры углевод-распознающего центра на молекуле фермента.
Данные по специфике влияния углеводов на образование димеров АИФ быка и человека приведены в табл. 1. За эффективность ингибирующей способности углеводов была взята концентрация углевода, необходимая для полного подавления димеризации. Оказалось, что степень влияния углеводов сильно зависит от их структуры. Из моносахаридов наибольшей ингибиторной способностью обладают галактоза и К-ацетилнейраминовая кислота, являющиеся концевыми в олигосахаридных цепях комплексного типа К-гликопротеинов. Лактоза обладает довольно слабой ингибирующей способностью по отношению к димеризации АИФ, но лактитол ингибирует димеризацию фермента гораздо более эффективно (особенно по отношению к ферменту быка). Таким образом, очевидно, остаток глюкозы в этом дисахариде нарушает связывание с углевод-распознающим центром фермента. Еще более эффективными оказались сиалиллактозы, причем 3'-сиалил-
Т а б л и ц а 2
Влияние углеводов на образование димера нативного, агалакто- и асиало-АПФ быка
Углеводы Концентрация углевода, при которой не наблюдается образование димера фермента, М
Нативный АПФ агалакто-АПФ асиало-АПФ
Neu5Ac 10-5 610-6 510-5
Gal 10-5 410-5 510-6
Lac 10-3 210-3 5-10-4
3 'SiaLac 810-7 410-7 210-6
Т а б л и ц а 3
Влияние углеводов на образование димера нативного, агалакто- и асиало- АПФ человека
Углеводы Концентрация углевода, при которой не наблюдается образование димера фермента, М
Нативный АПФ, М агалакто-АПФ, М асиало-АПФ, М
Neu5Ac 910-6 510-6 610-5
Gal 810-6 10-4 210-6
Lac 10-3 10-2 2-10-4
3'SiaLac 910-6 510-6 410-5
лактоза более эффективно ингибировала димеризацию АИФ быка, а 6'-сиалаллактоза - димеризацию АИФ человека. Более эффективное действие олигосахаридов по сравнению с моносахаридами свидетельствует о наличии протяженных контактов при взаимодействии АИФ с углеводом. Ири этом первый и второй углеводные остатки в олигосахаридной цепи оказываются наиболее важными для взаимодействия с углевод-распознающим центром АИФ. Структурные вариации в глюкозном остатке триса-харида 3'SiaLac (3'SiaLac, 3'SiaLac-ol, 3'SiaLacNAc) не влияли на ингибирование димеризации АИФ быка, однако влияли на ингибирование АИФ человека, что может указывать на связывание третьего остатка в олигосахарид-ной цепи углевод-распознающим центром АИФ человека, но не быка. С другой стороны, данные по влиянию Neu5Aca2-3Galß 1-4GlcNAc, Neu5Aca2-3Galß 1-3GlcNAc, Neu5Aca2-3Galß1-3GalNAc показывают незначительное влияние третьего моносахарида на димеризацию АИФ человека (810-6 M, 910-6 M и 510-6 M соответственно). Наиболее сильными ингибиторами димеризации АИФ как быка, так и человека оказались олигосахаридные биантен-ные цепи комплексного типа, выделенные из других гли-копротеинов (табл. 1).
Тот факт, что углевод-распознающий центр эффективно связывает терминальные остатки Gal и Neu5Ac N-це-пей комплексного типа и сами комплексные цепи, позволяет предположить, что критическую роль в ассоциации мономеров ферментов играют углеводные цепи АИФ
кoмплeкcнoгo типа, а именго вхoдящий в них тepминaль-ный диcaхapид Neu5Aca2-3Galß.
Незначительные oтличия в cпeцифичнocти yглeвoд-pac-пoзнaющих цeнтpoв AПФ быка и чeлoвeкa yкaзывaют на то, что этот цешр пpeдcтaвляeт coбoй кoнcepвaтивный yчacтoк на бeлкoвoй глoбyлe.
Как yжe былo oтмeчeнo, pafflbie пo cтpyктype мoнoca-хapиды - Gal и Neu5Ac - пpoявляют oдинaкoвoe cpoд-cтвo к мoлeкyлe AПФ. Oдним из oбъяcнeний этому фак^ мoглo быть cyщecтвoвaниe на белке двух pafflbk yглeвoд-pacпoзнaющих цeнтpoв c paзными cтpyктypными тpeбo-ваниями, из кoтopых пepвый отецифичен к Gal, а втopoй - к Neu5Ac. Oднaкo, ecли бы AПФ имел два цeнтpa, то димep acиaлo-AПФ фopмиpoвaлcя бы за cчeт взaимoдeй-cтвия кoнцeвых галактозильных ocтaткoв oднoй мoлeкyлы фepмeнтa и Gal-cвязывaющeгo цeнтpa дpyгoй. Этoт димep не был бы чyвcтвитeлeн к пpиcyтcтвию в cpeдe Neu5Ac. Димep же aгaлaктo-AПФ фopмиpoвaлcя бы в этом cnyHae за cчeт шнцевых ocтaткoв N-aцeтилнeйpaминoвoй rhcto-ты oднoй мoлeкyлы фepмeнтa и Neu5Ac-cвязывaющeгo цешра дpyгoй мoлeкyлы. Димep этoгo фepмeнтa не был бы чyвcтвитeлeн к пpиcyтcтвию в cpeдe Gal.
Нами были пoлyчeны как дecиaлиpoвaнный, так и де-гaлaктoзилиpoвaнный AПФ быка и чeлoвeкa. Oкaзaлocь,
что эти ферменты, как и их нативные предшественники, функционируют в системе обращенных мицелл как в виде мономера, так и в виде димера (рис. 1, кривая 1), т.е. отщепление концевых остатков сиаловых кислот или галактозы от олигосахаридных цепей АПФ не нарушало способности фермента к образованию димера (табл. 2). Оказалось, что, действительно, для десиалированного АПФ более эффективны углеводы, содержащие галактозу, и менее эффективны углеводы, содержащие Neu5Ac, по сравнению с нативным АПФ (табл. 2). В случае дегалак-тозилированного АПФ более эффективны сиалированные углеводы, а углеводы, содержащие Gal, менее эффективны. В то же время полученные данные не согласуются с гипотезой о существовании двух пространственно разделенных углевод-распознающих центров с разными требованиями к структуре углевода, но согласуются с вероятным нахождением в составе белковой глобулы АПФ одного центра, узнающего мотив Neu5Aca2-3Galb. На эту возможность прямо указывают полученные нами данные с последовательно десиалированным, дегалактозилирован-ным АПФ. Этот фермент функционирует в системе обращенных мицелл только в виде мономера (рис. 1, кривая 2), т.е. последовательность Neu5Aca2-3Gal критична для фермент-ферментного взаимодействия.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Corvol P., Williams T.A., Soubrier F. // Methods Enzymol. 1995.
248. P. 283.
2. Ehlers M.R. W., Chen Y.P., Riordan J.F. // Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1992. 183. P. 199.
3. Ripka J.E., Ryan J.W., Valido F.A., Chung A.Y.K.., Peterson C.M.,
Urry R.L. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. 196. P. 503.
4. Soubrier F., Alhenc-Gelas F., Hubert C., Allegrini J., John H.,
Tregear G., Corvol P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. 85. P. 9386.
5. Shai Sh.-Y., Fishel R.S., Martin B.M., Berk B.C., Bernstein K.E.
// Circ. Res. 1991. 70. P. 1274.
6. Klyachko N.L., Levashov A. V., Kabanov A. V., Khmelnisky Yu.L.,
Martinek K. / Surfactant science series: Kinetics and catalysis in microheterogeneous systems. Eds. M. Gratzel and K. Kalyanasundaram, N. Y., 1991. 38. P. 135.
7. Kost O.A., Orth T.A., Nikolskaya 1.1., Nametkin S.N., Levashov A.V. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. 44. P. 535.
8. Orth T., Voronov S., Binevski P., Saenger W., Kost O. // FEBS
Lett. 1998. 431. P. 255.
9. Meng Q. Ch., King S.J., Chen Y.-F., Delucas L.J., Oparil S. // J.
Chromatogr. 1989. 461. P. 271.
10. Lanzillo J.J., Stevens J., Dasarathy Y., Yotsumoto H., Fanburg B.L. // J. Biol. Chem. 1985. 260. P. 14938.
^^yn^a в peдaкцию 20.06.00
