CC BY
31
Пархоменко Т. В., Михайлова Н. Б., Афанасьев Б. В., Галибин О. В., Томсон В. В.
ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова» Минздрава РФ, Научно-исследовательский центр, Санкт-Петербург
Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Санкт-Петербург
ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСПЛАНТАТА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ПО УРОВНЮ ЕГО ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА
Parkhomenko T. V., Mikhailova N. B., Afanasyev B. V., Galibin O. V., Tomson V. V.
State Budget Educational Institution of Higher Professional Education «First Saint-Petersburg State I. P. Pavlov Medical
University» Ministry of Health Care of Russian Federation, Scientific research center, Saint-Petersburg
R. M. Gorbacheva Scientific Research Institute of Pediatric Oncology, Hematology and Transplantology, Saint-Petersburg
CHARACTERIZATION OF THE TRANSPLANT OF THE BONE MARROW CELLS BY THE LEVEL OF ITS ENERGY POTENTIAL
Резюме
Целью выполненной работы была разработка метода оценки качества трансплантата клеток костного мозга (ККМ) по изменению их энергетического состояния с помощью витального флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда иодида 2[п-(диметиламино) стирил]-1-метилпиридиния (2-Di-1-ASP).
Экспериментальные исследования выполнены на образцах суспензии нативных ККМ 20 доноров в стандартном растворе стабилизатора, которые хранились при комнатной температуре. После перемешивания суспензии клеток из нее отбирали пробы: исходную и через 1, 2, 3, 4, 5, 24, 48, 72 часа хранения, окрашивали с помощью зонда 2-Di-1-ASP и исследовали на люминесцентном микроскопе. Регистрировали величину интенсивности флуоресценции каждой индивидуальной клетки. В каждом препарате измеряли флуоресценцию 70-100 клеток и рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции ККМ (F усл. ед.); определяли количество ядросодержащих клеток (NC,%). Для оценки количества клеток с неповрежденными цито-плазматическими мембранами использовали тест с трипановым синим. Наличие митозов в суспензии через 6 и 24 часа хранения показано в мазках ККМ, окрашенных по методу Романовского.
Статистический анализ динамики изменений F и NC в каждом образце осуществляли при помощи дисперсионного анализа зависимых выборок ANOVA Repeated Measures. По всем образцам проведен кластерный анализ (метрика Эвклида, стратегия ближайшего среднего).
Abstract
The goal of this study was to develop a method for rapid and adequate assessment for assessing the quality of the graft bone marrow cells (BMC) on the change of their energy state using vital fluorescent potential-sensitive probe iodide 2 [p-(dimethylamino)styryl]-1-methylpyridinium (2-Di-1-ASP).
Experimental studies were performed on samples of native BMC suspension of 20 donors in a standard solution of the stabilizer that were kept at room temperature. After mixing the cell suspension were selected from it: the initial specimen and through 1, 2, 3, 4, 5, 24, 48, 72 — hours storage, stained with a probe 2-Di-1-ASP and examined for the fluorescent microscope. Each specimen was measured by fluorescence 70-100 single cells and mean fluorescence intensity of BMC (F, arb.uints) was calculated. In each specimen was determined by the number of nucleated cells (NC, %). Initially, the proportion of cells with intact cytoplasmic membranes in the specimens were 80-92 % (by trypan blue test). The presence of mitoses in the samples of the suspension after 5 and 24 hours storage is shown in smears of BMC, painted by the method Romanovsky. Statistical analysis of the dynamics of changes in F and NC in each sample was performed using analysis of variance dependent selections ANOVA Repeated Measures. For all 20 donors was carried out by cluster analysis (Euclidean metric, strategy nearest middle).
In all specimens, the BMC after 3 hours of storage at room temperature recorded F increase from baseline due to increase in the proportion of cells with fluorescence intensity higher than 100 arb.uints (Nf>100); the degree of this increase cor-
Во всех образцах ККМ через 3 часа хранения при комнатной температуре регистрировался рост Р, обусловленный увеличением количества клеток с интенсивностью флуоресценции выше 100 усл.ед. (^Р>100) по сравнению с исходными значениями, при этом степень этого нарастания коррелировала с увеличением N .„. Показано, что чем выше N 1ППчерез
Р>100 Р>100 г
3 часа хранения, тем больше прирост концентрации ядросодержащих клеток в суспензии, который начинался через 5 часов хранения. Этот факт может свидетельствовать о способности исследуемых клеток к делению. При возрастании НР>100 через 3 часа хранения ККМ менее чем в 1,66 раза по сравнению с исходной величиной, концентрация ядросодержа-щих клеток практически не изменялась, что свидетельствовало об утрате способности клеток к делению в данных условиях.
Предложен метод оценки качества трансплантата ККМ с помощью витального флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда 2-Di-1-ASP при комнатной температуре в растворе стандартного стабилизатора.
Ключевые слова: клетки костного мозга, энергетическая активность, качество трансплантата, витальный флуоресцентный потенциал-чувствительный зонд иодид 2-[п-диметиламино)стирил]-1-метилпиридиния, способность ККМ к делению.
relates with an increase in N .... It is shown that
F>100
the higher NF>100 3 hours after storage, the larger the increase in the concentration of nucleated cells in suspension, which started after 5 hours storage, being in accordance with revealed ability of cells to division. With increasing NF>100 through 3 hours storage BMC less than 1,66 times compared with the initial value, the concentration of nucleated cells remained almost unchanged, indicating that the inability of cells to division in these conditions.
Developed and proposed a method for assessing the quality of the graft BMC of using the vital fluorescent potential-sensitive probe 2-Di-1-ASP at room temperature in a solution of a standard stabilizer.
Key words: bone marrow cells, energetic activity, the quality of the graft, vital fluorescent potential-sensitive probe, 2-[p-(dimethylamino) styryl]-1-methylpyridinium iodide, the ability of BMC to division.
Введение. В настоящее время известно, что для оценки пролиферативной активности трансплантата клеток костного мозга (ККМ) и времени их адаптации используется способ определения колониеобразующей способности ККМ, основанный на культивировании их в различных полувязких и полутвердых питательных средах (метилцеллюлоза, коллаген, агар) с обязательным добавлением экзогенных ростовых факторов [1]. Культуральные среды предназначены для поддержания оптимального режима жизнедеятельности изолированных клеток, фрагментов тканей и органов в искусственно создаваемых системах. Однако чаще всего используемые в качестве питательных сред агар и метилцеллюлоза влияют на пролиферацию и дифференцировку ККМ.
Модифицированный метод лимитирующих разведений (ЬЛА) [2], основанный на выращивании гемопоэтических клеток-предшествен-
ников в жидкой среде, позволил исключить влияние агара и метилцеллюлозы на коло-ниеобразующую способность и исследовать воздействие фитогемагглютинина, гидро-спорина, колониестимулирующих факторов, рекомбинантных колониестимулирующих факторов [3], гидрокортизона, и различных цитокинов на гемопоэтические клетки-предшественники [4]. Метод лимитирующих разведений позволяет определять в костном мозге концентрацию полипотентных кроветворных предшественников, изучать их дифференцировку под влиянием гранулоци-тарного колониестимулирующего фактора в более зрелые кроветворные предшественники [5]. Общими недостатками приведённых способов являются: влияние ростовой среды на деление и дифференцировку клеток; методическая сложность и длительность (результаты получают через 7-14 дней).
Популяция костного мозга (КМ) чрезвычайно гетерогенна и содержит большое количество форменных элементов крови и клеток-предшественников разной степени зрелости [6]. Среди клеток-предшественников выделяют стволовые и прогениторные клетки, которые дают начало зрелым клеткам крови — колониеобразующие единицы (КОЕ). Стромальные клетки костного мозга вырабатывают фактор стволовых клеток, который стимулирует пролиферацию и диф-ференцировку гемопоэтических клеток. Согласно существующей в настоящее время концепции, функциональное состояние живых клеток тесно связано с их энергосопряженными характеристиками (количеством активных митохондрий в цитоплазме, суммарным трансмембранным потенциалом на плазматических и митохондриальных мембранах), за изменениями которых можно следить с помощью потенциал-чувствительных флуоресцентных зондов [7, 8, 9]. Применение методов с использованием флуоресцентных потенциал-чувствительных зондов позволяет исследовать реакцию клеток после воздействия на них различных физико-химических факторов [10-15] и оценить состояние митохондриальных функций и редокс-потенциала клеток КМ [16].
Целью работы была разработка метода экспрессной и адекватной оценки качества трансплантата ККМ по изменению его энергетического состояния с помощью витального флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда иодида 2[п-(диметиламино) стирил]-1-метилпиридиния (2-Di-1-ASP). Задачи:
1. Разработать оптимальные условия для выявления закономерности между интенсивностью флуоресценции зонда 2-Di-1-ASP, определяющей энергетическую активность ККМ, и их способностью к пролиферации.
2. Исследовать в динамике корреляцию между энергетической и пролиферативной активностью ККМ в процессе хранения.
3. Определить оптимальные характеристики энергетики ККМ, позволяющие адекватно и быстро оценивать их спонтанную способность к делению.
Материалы и методы
Объектом исследования служил костный мозг здоровых доноров, взятый для аллоген-
ной трансплантации. Получение суспензии ККМ проводили по опубликованной методике [17]. Полученные клетки помещали в стандартный раствор стабилизатора («Terumo Corporation, Tokyo, Japan», содержащий в 100 мл дистиллированной воды: 2,63 г цитрата натрия; 0,327 г лимонной кислоты; 0,251 г ди-гидрофосфата натрия; 2,9 г декстрозы безводной; 0,0275 г аденина). Выбор стандартного раствора стабилизатора был обусловлен тем, что входящие в него ингредиенты не содержат ростовых и колониестимулирующих факторов, что позволяет оценить собственную спонтанную способность ККМ к делению. Количество ядросодержащих клеток определяли по известному методу [18], результаты выражали в процентах по отношению к количеству клеток в исходной пробе (NC = C/ Сисхх100). Для оценки количества клеток с неповрежденными цитоплазматическими мембранами использовали тест с трипано-вым синим [19]. Для подсчета числа митозов суспензию клеток хранили при комнатной температуре (контроль). В ряде опытов в параллельные пробы через 1 час после начала хранения добавляли колхицин (ACROS ORGANICS, Бельгия) в конечной концентрации 4,3 мкг/мл и инкубировали в термостате при 37оС. Из суспензии ККМ (контроль и опыт) делали мазки (исходный, через 5, 6, 24 часа хранения), обрабатывали фиксатором по Май-Грюнвальду (Диахим-Гемистейн Май-Грюнвальд, Россия), затем окрашивали азур-эозином по методу Романовского (Диахим-Гемистейн-Романовский, Россия). Микроскопический анализ проводили на световом микроскопе Leica DM 750 (Германия) при увеличении в 1000 раз. Фотосъемку выполняли, используя микроскоп Leica DM 750 и фотокамеру ICC50 (Leica, Германия).
В работе использовали флуоресцентный потенциал-чувствительный витальный зонд катионного типа иодид 2[п-(диметиламино) стирил]-1-метилпиридиния (2-Di-1-ASP). (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR., USA). Ранее авторами этой работы было установлено, что флуоресценция 2-Di-1-ASP чувствительна к изменению энергетического потенциала ККМ [20]. Для работы с зондом суспензию клеток с концентрацией (~2-3)х107 объемом 0,9-1,0 мл хранили в пробирках типа Эппен-дорф емкостью 1,5 мл при комнатной температуре в растворе стандартного стабилизатора. Сразу после помещения клеток в пробирку
суспензию перемешивали и отбирали из нее пробы объемом 30,0 мкл: исходную и через 1, 2, 3, 4, 5, 24, 48, 72 часа хранения, помещали их в пробирку типа Эппендорф емкостью 0,6 мл, добавляли раствор 2-Di-1-ASP в конечной концентрации 40,0 мкМ и инкубировали в течение 50-60 мин при 37оС. После инкубации ~3 мкл суспензии клеток исследовали на люминесцентном микроскопе Люмам-И2 (ЛОМО, Россия) при увеличении в 900 раз. Флуоресценцию зонда возбуждали ртутной лампой с длиной волны 405-436 нм. Для регистрации флуоресценции использовали фотометрическую насадку ФМЭЛ-1 и интерференционный фильтр с максимумом пропускания 585 нм. Длина волны возбуждения 470 нм, интенсивность флуоресценции определяли при длине волны 560 нм. Регистрировали величину интенсивности флуоресценции каждой индивидуальной клетки. В каждом препарате измеряли флуоресценцию 70-100 клеток и рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции ККМ (F усл. ед.).
Всего было исследовано в 500 препаратах 9130 клеток. Изученные клетки в каждом препарате разделяли на 4 серии по величине средней интенсивности флуоресценции: I — от 10 до 30 усл.ед.; II — от 30 до 70 усл.ед.; III — от 70 до 100 усл. ед.; IV — от 100 усл. ед. и выше, рассчитывали долю клеток каждой серии. Фотосъемку препаратов клеток, окрашенных зондом 2-Di-1-ASP, выполняли, используя микроскоп Люмам-И2 (ЛОМО, Россия) и фотокамеру ТСА-5,0; программный пакет "Микро-Анализ View" (ООО "ЛОМО-Ми-кросистемы", Россия).
Статистический анализ динамики изменений F и NC осуществляли при помощи дисперсионного анализа зависимых выборок ANOVA Repeated Measures [21]. Для всех 20 доноров (500 препаратов) был проведен кластерный анализ (метрика Эвклида, стратегия ближайшего среднего) [22]. Достоверность различий оценивали по критерию Вилкоксона — Манна — Уитни. Различия между группами считали значимыми при P < 0,05.
Результаты и обсуждение
Экспериментальные исследования выполнены на образцах суспензии нативных
ККМ 20 доноров в стандартном растворе стабилизатора, которые хранились при комнатной температуре. Исходно доля клеток с неповрежденными цитоплазматическими мембранами в образцах составляла 80-92 %. В результате статистической обработки полученных данных было установлено, что через 3 часа хранения наблюдался рост Р по сравнению с исходными величинами, обусловленный увеличением доли клеток с интенсивностью флуоресценции выше 100 усл. ед. (Ыр>1оо,%) (Табл. 1).
Было установлено, что отношение ЫР>1003ч к ЫР>100 исх. (О) наиболее информативно отражает изменения, произошедшие с 0 момента до 3 часов, и позволяет предсказать возможные различия в дальнейшей динамике изменений Р и ЫС в течение исследуемых сроков хранения начиная с 5 часов и далее. Мы предположили, что О является основным параметром, определяющим свойства ККМ. Чтобы выделить однородные группы по О, был проведен кластерный анализ всех образцов ККМ и сформированы 3 группы, значимо различающиеся между собой по Д (Р<0,0001), что иллюстрирует Рис. 1. В группе первого типа через 3 часа хранения регистрировались минимальные степени нарастания Р и Ыр>100 (Табл. 1, рис. 4). В группе второго типа — максимальные степени нарастания Р и Ыр>100. В третьей группе оказались образцы, степени нарастания Р и Ыр>100 которых через 3 часа хранения были промежуточными между 1 и 3 типами.
После этого анализировалось состояние Р и ЫС в каждой группе, начиная с 5 часов хранения. Для исследования динамики изменений Р и ЫС использовался метод дисперсионного анализа ЛЫОУЛ для повторных измерений, где в качестве главного эффекта рассматривался фактор группы. У всех 20 доноров обнаружена статистически значимая динамика Р (Р = 0,0048) и ЫС (Р<0,0001) (Рис. 2, 3). Также существует значимая динамика различий между группами: для Р Р = 0,0048, для ЫС Р<0,0001. Таким образом, результаты дисперсионного анализа подтвердили правомочность разделения всех исследованных образцов ККМ на 3 группы.
Scatterplot (Книга2.э1а 24v*20c) 2,8 ..............................
2,6
F, усл.ед.
Рис. 1. Распределение по группам зависимости В от исходной интенсивности флуоресценции (Русл. ед.исх.) для 20 доноров. Примечание: по оси абсцисс отложены средние величины исходной флуоресценции (Русл. ед.исх.) каждого донора; по оси ординат — В (отношение №р>]003ч и NР>100 исх.). Группа 1 — минимальные степени нарастания Р и №р>]00 через 3 часа хранения; группа 2 — максимальные степени нарастания Р и №Р>100; группа 3 — промежуточные степени
нарастания Р и Кр>100 между 1 и 3 типами.
R1 *gn Unweighted Means Current effect: F(6, 51 )=3,5839, p=,00486 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals 140 --->-,-
130
5 24 48 72, часы
Рис. 2. Изменение интенсивности флуоресценции (Русл. ед.) ККМ в процессе хранения. Примечание: по оси абсцисс отложено время хранения в часах, по оси ординат — средние величины (Русл. ед.) флуоресценции для каждой временной точки по всем измеренным клеткам каждого донора. Группа 1- минимальные степени нарастания Р и Кр>100 через 3 часа хранения; группа 2 — максимальные степени нарастания Р и №Р>100. группа 3 — промежуточные
степени нарастания Р и КР>100 между 1 и 3 типами.
240 220 200 180
.о 160
и
2 140
120 100 80 60
R1 "gn Unweighted Means Current effect: F(6, 51 )=11,725, p=,00000 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
т >................. с~.....-----.....^ 1
т X
I _L —_ Т
1 1 1
24
48
72, часы
fcgr 1
2 gr
з
Рис. 3. Изменение количества ядросодержащих клеток (N0, %) ККМ в процессе хранения. Примечание: по оси абсцисс отложено время хранения в часах, по оси ординат — количество ядросодержащих клеток (N0, %) для каждой временной точки по всем измеренным клеткам каждого донора. Группа 1- минимальные степени нарастания Г и ^>]00 через 3 часа хранения; группа 2 — максимальные степени нарастания Г и ^>]00; группа 3 — промежуточные степени
нарастания Г и ^>]00между 1 и 3 типами.
Рис. 4. Изменение количества клеток с интенсивностью флуоресценции выше 100усл. ед. (N¡>10!, %0) в процессе хранения. Примечание: по оси абсцисс отложено время хранения в часах, по оси ординат- ^>]00, %. Группа 1- минимальные степени нарастания Г и ^>100 через 3 часа хранения; группа 2 — максимальные степени нарастания Г и NГ>]00_ группа 3 — промежуточные
степени нарастания Г и ^>100 между 1 и 3 типами.
Усредненные исследуемые показатели ККМ в исходных пробах и через 3 часа хранения для 3-х групп доноров.
Таблица 1.
Группа параметр Исх. 3 часа Р
1 Р усл. ед 69,99 ± 2,63 79,61 ± 2,50 0,043
1 N.....% 21,07 ± 2,17 27,7 ± 2,67 0,043 1,31
1 1\1С, % 100,00 100,18 ± 0,06 0,067
2 Ё усл. ед 89,04 ± 1,93 147,74 ± 8,71 0,043
2 N.....% 32,44 ± 1,83 76,73 ± 2,51 0,043 2,36
2 1\1С, % 100,00 118,60 ± 2,29 0,043
3 Р усл. ед 91,22 ± 1,40 122,27 ± 2,63 0,005
3 N.....% 40,39 ± 1,31 66,97 ± 1,74 0,005 1,66
3 1\1С, % 100,00 102,5 ± 0,62 0,0076
Примечание: Русл. ед. — средние величины флуоресценции в данных временных точках по всем измеренным клеткам доноров 1, 2 и 3 групп; №Р>100, % — усредненные величины количества клеток с интенсивностью флуоресценции выше 100 усл. ед. по каждой группе доноров; N0, % — средние величины количества ядросодержащих клеток в каждой группе доноров. Для каждой временной точки приведена величина среднего (М) и ошибка среднего (т).
Из таблицы 1 видно, что в группе 1 через 3 часа ЫР>100 возрастает в среднем в 1,31 раза, в группе 2 — в 2,36 раза, в группе 3 — в 1,66 раза по сравнению с исходными величинами. Нарастание ЫС наблюдалось в группах 2 и 3, где через 3 часа регистрировалось увеличение ЫР>100 не менее чем в 1,66 раз.
В результате проведенных исследований было установлено, что во всех образцах ККМ через 3 часа хранения при комнатной температуре регистрировался рост Р, обусловленный увеличением количества клеток с интенсивностью флуоресценции выше 100 усл. ед. (ЫР>100) по сравнению с исходными значениями, при этом степень этого нарастания коррелировала с увеличением ЫР>100. Показано, что чем выше ЫР>100 через 3 часа хранения,
тем больше прирост концентрации ядросо-держащих клеток в суспензии. Этот факт может свидетельствовать о способности исследуемых клеток к делению. При возрастании ЫР>100 через 3 часа хранения ККМ менее чем в 1,66 раза по сравнению с исходной величиной, концентрация ядросодержащих клеток практически не изменялась, что свидетельствовало об утрате способности клеток к делению в данных условиях.
Сохранность клеток при выбранных условиях хранения продемонстрирована с помощью стандартных кариологических методов. В частности, в суспензиях КМ на протяжении нескольких часов хранения выявлялись делящиеся клетки, окрашенные зондом 2-Ш-1-ASP (Рис. 5).
т
I*
Рис. 5. ККМ донора в процессе хранения (5 час). Интенсивность флуоресценции 110усл. ед.; деление клеток. Окрашивание зондом 2-В1-1-АБР.
Обнаружено наличие митозов в образцах ККМ доноров в группах 2 и 3, окрашенных по методу Романовского (рис. 6). Число метафазных форм в исходных пробах: 0,60 ±0,10%; в контроле через 5 часов хранения: 1,4 ±0,1%; в опыте (инкубация с колхицином при 37оС через 6 часов хранения): 1,8 ± 0,1 %.
Рис. 6. Митозы ККМ донора в процессе хранения через 5 часов (митоз в нейтрофильном гранулоцитарномряду).
Окрашивание по методу Романовского.
В публикации 2005г авторами (Ь^поу М. V., е1.а1.) обсуждался вопрос стабильности трансплантатов ККМ и стволовых клеток, выделенных из периферической крови (ПСК) при различных температурных режимах. По данным этих авторов, ККМ и ПСК могут сохраняться в течение нескольких дней при +40С без значительного снижения способности к воспроизведению. В противоположность этому, при комнатной температуре в образцах ПСК трансплантата число грануло-макрофагальных КОЕ составляло через 48 часов менее 20% от исходного, в то время как КОЕ в трансплантатах КМ оставалось неизменным в течение 72 часов. Наблюдаемые различия в стабильности стволовых клеток из различных источников могут быть вызваны несколькими причинами, например, присутствием в трансплантате
КМ поддерживающих стромальных клеток и/ или увеличенной метаболической активностью подвижных клеток по сравнению с КМ клетками [23]. По нашим данным, в процессе хранения в 15 образцах КМ было отмечено увеличение числа кариоцитов через 5-24 часа и далее сохранялось практически неизменным до 72 часов при комнатной температуре. Можно предположить, что клетки КМ при комнатной температуре и в отсутствии питательных веществ в стабилизирующей среде сохраняли жизнеспособность. Остаточная энергетическая активность клеток КМ через 72 часа указывает на наличие в суспензии КМ жизнеспособных клеток. Более подробные данные о жизнеспособности ККМ при хранении в течение 48 и 72 часов мы предполагаем получить в результате дальнейшего исследования.
Использование предлагаемого метода с применением витального флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда иодида 2[п-(диметиламино)стирил]-1-метилпиридиния (2-Di-1-ASP) позволило:
1. Установить факт энергетической активации суспензии ККМ по росту флуоресценции по сравнению с исходной во всех исследованных образцах через 3 часа хранения;
2. Исследовать в динамике и найти корреляцию между флуоресценцией ККМ и их способностью к пролиферации в процессе хранения;
3. Найти корреляцию между ростом флуоресценции и увеличением количества клеток с ЫР>100, а также между количеством клеток с ЫР>100 и пролиферативной активностью ККМ; 4. Подтвердить в опытах с использованием колхицина наличие реализованной митотической активности в ККМ, приводящей к пролиферации клеток, энергетическая активность которых выявлена с помощью зонда 2-Di-1-ASP.
Выяснение механизма энергетической активации ККМ через 3 часа хранения и их стабильности в течение 72 часов при комнатной температуре требуют проведения дальнейших исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1 C. Nissen-Druey, A. Tichelli, S. Meyer-Monard. Human Hematopoietic Colonies in Health and Disease.// Acta Haemotologica (ISSN0001-5792). 2005. Vol.113. № 1. P. 5-96.
2. Takaue Y., Reading C. L., Roome A. J., Dicke K. A., Tindle S., Chandran, M., Devaraj B. Limiting-Dilution Analysis of the Effects of Colony-Stimulating Factors, Phytohemagglutinin, and Hydrocortisone on Hematopoietic Progenitor Cell Growth // Blood. 1987. Vol. 70. № 5. P 16111618.
3. Takaue Y., Reading C. L., Watanabe T. et.al. Cell-mediated suppression of human hematopoiesis: evaluation by limiting-dilution analysis of hematopoietic progenitors // American Journal of Hematology. 1989. Vol. 32. № 3. P. 205-211.
4. Ventura G. J., Hester J. P., Buescher E. S., Vadhan-Raj S., Durrett A., Reading C. L. // Hematopoiesis in limiting dilution cultures: influence of cytokines on human hematopoietic progenitor cells. Experimental Hematology. 1990. Vol. 18. № 8. P. 878-882.
5. Дыгай А. М., Скурихин Е. Г., Першина О. В., Андреева Т. В., Хмелевская Е. С., Минакова М. Ю. // Роль кроветворных предшественников разных классов в механизмах действия грану-лоцитарного колониестимулирующего фактора на кроветворение при цитостатической миелосупрессии. 2010. Том. 149. С. 400-404.
6. Воробьев А. И., Дризе Н. И., Чертков И.Л. Схема кроветворения. Пробл. Гематологии. 1995. Том. 1. № 1. С. 7-14.
7. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеи-нов. М., Наука, 1989. 277 С.
8. Vida T. A., Emr S. D. A new vital stain visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. Journ. of Cell Biol. 1995. Vol. 228. № .5. P. 779-792.
9. Пархоменко Т. В., Михайлова Н. Б., Афанасьев Б. В., Галибин О. В., Томсон В. В. RU № 2537141, опубл. 27.12.2014, Бюлл. № 36.
10. Wandelt B., Mielniczak A., Turkewitsch P., Darling G. D., Stranix B. R. Substituted 4-[4-(dimethylamino)styryl]pyridinium salt as a fluorescent probe for cell microviscosity // Biosensors and Bioelectronics. 2003. Vol. 18. P. 465-471.
11. Parkhomenko T. V., Morozova G. I., Klytsenko O. A., Tomson V. V. Evaluation of restoring Erythropoietin (EPO) effect on rat T-lymphocytes after their treatment with some inhibitors in vitro // Annals of Hematology. 2003. Vol. 82. № 6. S. 114.
12. Parkhomenko T. V., Klytsenko O. A., Tomson V. V. Erythropoietin stimulates aerobic and anaerobic processes in rat cardiomyocytes // Focus uni-luebeck. Supplement. 2012. P. 37
13. Артюхов В. Г, Путинцева О. В., Брагина В. А., Пашков М. В., Василенко Д. В. Флуоресцентные методы в исследовании УФ — индуцированных изменений структурно-функционального состояния лимфоцитов крови человека // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2012. Том. 153. № 6. С. 891-895;
14. Морозова Г И., Пархоменко Т. В., Клыценко О. А., Томсон В. В. Стимулирующее влияние эри-тропоетина на энергетику тимоцитов, выявляемое in vitro по флуоресценции потенциал-чувствительного зонда в митохондриях. Биологические мембраны. 2007, Т. 24, № 6, С. 472-478;
15. ПархоменкоТ.В., Михайлова Н.Б., Афанасьев Б.В., Галибин О.В.,Томсон В.В.Оценка состояния клеток костного мозга по изменению интенсивности свечения флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда иодид 2-[п-(диметиламино)стирил]-1-метилпиридиния // Клинико-лабораторный Консилиум. 2014. Том. 48. № 1. С. 88-93].
16. Kaur A, Jankowska K, Pilgrim C, Fraser ST, New EJ. Studies of Hematopoietic Cell Differentiation with a Ratiometric and Reversible Sensor of Mitochondrial Reactive Oxygen Species// Antioxid. Redox Signal. 2016. Vol. 24. № 13. P. 667-679.
17. Фрегатова Л. М., Зубаровская Л. С., Эстрина М. А., Головачёва А. А., Бабенко Е. В., Платонова Г. Г., Зуева Е. Е., Афанасьев Б. В. Методы получения стволовых клеток у больных и доноров для их последующей трансплантации // СПб, Изд. СПбГМУ кафедра гематологии, трансфузиологии, трансплантологии ФПО. 2004. 36 С.
18. Клиническая лабораторная аналитика, том 2. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории. Под общей редакцией Меньшикова В. В., М., «Лабинформ», РАМЛД, 1999.
19. Phelan M. C. Basic techniques for mammalian cell tissue culture // Current Protocols in Cell Biology. 0:1.1.1-1.1.10. 1998.
20. Пархоменко Т. В., Галибин О. В., Михайлова Н. Б., Бабенко Е. В., Томсон В. В. RU №2488826, опубл. 27.07.2013, Бюлл. № 21.
21. Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ: подход с использованием ЭВМ. Под ред. Баша-рина Г. П. М.: Мир. 1982. 488 С.
22. Алексеева Н. П. Анализ медико-биологических систем. Реципрокность, эргодичность, синонимия. СПб: Изд-во С. — Петерб. Ун-та. 2012. 184 С.
23. Lioznov M. V., Freiberger P., Kroger N., Zander A. R., Fehse B. Aldehyde dehydrogenase activity as a marker for the quality of hematopoietic stem cell transplants // Bone Marrow Transplantation. 2005. Vol. 35. № 9. P. 909-914.
Благодарность:
Авторы приносят искреннюю благодарность Людмиле А. Беляковой (ст. научн. сотр. Лаборатории биомедицинской статистики отдела Фармакоэпидемиологии и биомедицинской статистики Института Фармакологии им. А. В. Вальдмана. ГБОУ ВПО ПСПб ГМУ им. акад. И. П. Павлова Минздрава России) за проведение статистического анализа полученных результатов.
