CC BY
20
Получена: 25 октября 2020 / Принята: 21 декабря 2020 / Опубликована online: 30 декабря 2020
DOI 10.34689/SH.2020.22.6.004 УДК 616.831.9-002:616.28
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ N. MENINGITIDIS ЦИРКУЛИРОВАВШИХ В Г. НУР-СУЛТАН С 2010 ПО 2020 ГОДЫ
Алия Ж. Сейдуллаева1'2, https://orcid.org/0000-0002-0073-4405 Динагуль А. Баешева1,2, https://orcid.org/0000-0001-6843-9712 Баян Р. Турдалина1'2, https://orcid.org/0000-0001-5672-7370 Алёна В. Алтынбекова1'2, https://orcid.org/0000-0002-4407-4525 Айым М. Турарова1,
Асет Ж. Данияров3, https://orcid.org/0000-0003-3886-718X Улыкбек Е. Каиров3, https://orcid.org/0000-0001-8511-8064 Самат С. Кожахметов3,4* https://orcid.org/0000-0001-9668-0327
1 НАО «Медицинский университет Астана», г. Нур-Султан, Республика Казахстан;
2 Многопрофильная городская детская больница №3, г. Нур-Султан, Республика Казахстан;
3 Центр наук о жизни ЧУ "National Laboratory Astana" Назарбаев Университет, г. Нур-Султан, Республика Казахстан;
4 Инновационный центр ArtScience, г. Нур-Султан, Республика Казахстан.
Резюме
Введение. Эпидемиология менингококковой инфекции может измениться непредсказуемо, и тип изолятов Neisseria meningitidis имеет решающее значение для наблюдения за инвазивным менингококком.
Цель исследования. Проведение молекулярно-эпидемиологического и генетического исследования штаммов N.meningitidis, циркулирующих в г. Нур-Султан.
Материалы и методы. Поведен анализ историй болезни пациентов, пролеченных с диагнозом «менингококковый менингит» в Многопрофильной городской детской больнице №3 г. Нур-Султан за 2010-2020 гг. Характеристика изолятов Neisseria meningitidis, собранных из спинномозговой жидкости и крови у детей (n=120), были генотипированы с помощью мультилокусного типирования последовательностей (MLST) и секвенирования генов porB, porA, fetA, fHbp и penA. Серотипирование проводилось с помощью метода латекс-агглютинации. Чувствительность к противомикробным препаратам определялась с помощью диско-диффузного метода и протестирована на чувствительность к антибиотикам с использованием мультилокусного типирования последовательностей (MLST). Статистическую обработку клинико-лабораторных данных рассчитывали с использованием программы SPSS IBM Statists 20. Возраст различных линий выполнен с помощью теста MannWhitney U.
Результаты. Анализ показал наибольший удельный вес выявляемости среди серогрупп «А» -59,2% (n=71), на втором месте «В»- 24,2% (n=29), на третьем - «С»- 10,8% (n=13) и низкий показатель у серогрупп «W135»-4,2% (n=5) и «29Е»- 1,7% (n=2). Результаты полногеномного анализа N.meningitidis были депонированы в международную базу данных Genbank по следующим номерам: SRX7002979, SRX7002980, SRX7002981, SRX7002982.
Выводы. Полногеномный анализ внес значительный вклад в детальную молекулярную характеристику изолятов N. meningitidis, выделенных в Казахстане за 10-летний период. Позволил определить уровень генетического расхождения между полученными в Казахстане и других странах изолятами. Генетическая филогения полных геномов выявила географическую циркуляцию серотипов и штаммов, а также случаи передачи между странами. Ключевые слова: N. meningitidis, бактериальный менингит, секвенирование, дети.
Abstract
CHARACTERISTIC OF N. MENINGITIDIS STRAINS CIRCULATED IN NUR-SULTAN FROM 2010 TO 2020
Aliya Zh. Seidullayeva1,2, https://orcid.org/0000-0002-0073-4405 Dinagul A. Bayesheva1,2, https://orcid.org/0000-0001-6843-9712 Bayan R. Turdalina 1,2, https://orcid.org/0000-0001-5672-7370 Alyona V. Altynbekova1,2, https://orcid.org/0000-0002-4407-4525 Аiym М. Turarova1,
Asset Zh. Daniyarov3, https://orcid.org/0000-0003-3886-718X
Ulykbek E. Kairov3, https://orcid.org/0000-0001-8511-8064 Samat S. Kozhakhmetov3-4, https://orcid.org/0000-0001-9668-0327
1 NJSC "Medical University Astana", Nur-Sultan, Republic of Kazakhstan;
2 Multidisciplinary City Children's Hospital № 3, Nur-Sultan, Republic of Kazakhstan;
3 National Laboratory Astana, Nazarbayev University, Nur-Sultan, Republic of Kazakhstan;
4 ArtScience Innovative Center, Nur-Sultan, Republic of Kazakhstan.
Introduction. The epidemiology of meningococcal infection can change unpredictably, and the type of Neisseria meningitidis isolates play a crucial role for the surveillance of invasive meningococcus.
Purpose of the study. Conduct a molecular epidemiological study and determine the genetic characteristics of N. meningitidis strains that exist in Nur-Sultan city.
Methods. The investigation is based on the meningococcal infection registered cases in Nur-Sultan for the period 2010— 2020. For characterization, Neisseria meningitidis isolates were collected from cerebrospinal fluid and blood from children. N. meningitidis isolates (n = 120) from patients were genotyped using multilocus sequence typing (MLST) and sequencing of the porB, porA, fetA, fHbp, and penA genes. Serotyping was performed using the latex agglutination method. Antimicrobial susceptibility was determined using a disk diffusion method and tested for antibiotic susceptibility using multilocus sequence typing (MLST). Statistical treatment of clinical and laboratory data was calculated using the program SPSS IBM Statistics 20. Age of different lines performed with the help of the Mann-Whitney U. test.
Results. Thus, the analysis of case histories of patients treated with a diagnosis of meningococcal meningitis in the Multidisciplinary City Children's Hospital No. 3, Nur-Sultan for 2010-2020, showed the highest proportion of detection among serogroups "A" -59.2% (n = 71), in second place "B" - 24.2% (n = 29), in third place - "C" - 10.8% (n = 13) and a low rate in serogroups "W135" -4.2% (n = 5) and "29E" - 1.7% (n = 2). The results of genome-wide analysis of N.meningitidis were deposited in the international Genbank database at the following numbers: SRX7002979, SRX7002980, SRX7002981, SRX7002982 (PubMLST, https: // www.ncbi.nlm.nih.gov / sra / term).
Conclusions. Genome-wide analysis made a significant contribution to the detailed molecular characterization of N. meningitidis isolates that were isolated in Kazakhstan over a 10-year period. Allowed to determine the level of genetic discrepancy between isolates obtained in Kazakhstan and other countries. Genetic phylogeny of complete genomes has revealed the geographical circulation of serotypes and strains, as well as cases of transmission between countries. Key words: N. meningitidis, bacterial meningitis, sequencing, children.
Туйшдеме
Н¥Р-С¥ЛТАН КДПАСЫНЫН 2010-2020 ЖЫЛДАР АРАЛЫГЫНДАГЫ N.MENINGITIDIS ШТАМЫНЫН АЙНАЛЫМДАГЫ СИПАТТАМАСЫ
Алия Ж. Сейдуллаева1>2, https://orcid.org/0000-0002-0073-4405 Динагуль А. Баешева1,2, https://orcid.org/0000-0001-6843-9712 Баян Р. Турдалина1'2, https://orcid.org/0000-0001-5672-7370 Алёна В. Алтынбекова1,2, https://orcid.org/0000-0002-4407-4525 Айым М. Турарова1,
Асет Ж. Данияров3, https://orcid.org/0000-0003-3886-718X Улыкбек Е. Каиров3, https://orcid.org/0000-0001-8511-8064 Самат С. Кожахметов3-4* https://orcid.org/0000-0001-9668-0327
1 КеАК «Астана медицина университет», Нур-Султан к., Казахстан Республикасы;
2 Кenбейiндi калалык балалар ауруханасы №3, Нур-Султан к., Казахстан Республикасы;
3 @мiр туралы гылымдар орталыгы ЖМ "National Laboratory Astana" Назарбаев Университет^ Нур-Султан к., Казакстан Республикасы;
4 ArtScience инновациялык орталыгы, Нур-Султан к., Казакстан Республикасы.
Kipicne. Менингококк инфекциясыныч эпидемиологиясы 63repyi MYMKiH ж8не инвазивт менингококкты ауруды бакылау Yшiн Neisseria meningitidis изоляттарыныч тYрi ете мачызды.
Зерттеу максаты. Нурсултан каласында N. meningitidis штамыныч айналымдагы генетикалык сипаттамасы аныктау ж8не молекулярлык-эпидемиологиялык зерттеу жYргiзу.
Эдicтepi. Нурсултан каласыныныч 2010-2020 жылдар аралыгындагы менингококк инфекциясыныч тiркелген жавдайлары зерттелдi. Балалардан Neisseria meningitidis изоляттарын сипаттау Yшiн жулын суйыктыгы мен каннан материал жиналды. Наукастардан белЫген N. meningitidis (n=120) изоляттары мультилокустык тiзбектi типтеу (MLST) ж8не porB, porA, fetA, fHbp ж8не penA секвенстеу гендiк реттiлiгi аркылы генотиптелдк Серотиптеу латекс-агглютинация 8дiсi аркылы жYргiзiлдi. Микробтарка карсы препараттарга сезiмталдык диско-диффузды 8дiс ж8не мультилокустык тобекп типтеу (МЛТТ) 8дiсi аркылы аныкталды. Клиникалык ж8не зертханалык деректердi
статистикалык ечдеу SPSS IBM Statistiсs 20 бавдарламасын колдану аркылы есептелдi. Эр тYрлi сызыктардыщ жасы Mann-Whitney U тестЫщ кемегiмен жасалады.
Нэтижелерi. Осылайша, 2010-2020 жж.аралыгында Нур-Султан к. №3 Кепбей^ калалык балалар ауруханасында "менингококкты менингит" диагнозымен емделген пациенттердщ ауру тарихын талдау барысында еч Yлкен Yлес пайызды "А" серотипi - 59,2% (n=71), екiншi орында "В" - 24,2% (n=29), Yшiншi орында "с" - 10,8% (n=13) жэне темен керсеткiш 'ЗД135"серотит топтары -4,2% (n=13) (n=5) жэне "29E" - 1,7% (n = 2) керсетп. N. meningitidis толык геномдык талдау н8тижелерi Genbank халыкаралык дереккорына келес немiрлер бойынша орналастырылды: SRX7002979, SRX7002980, SRX7002981, SRX7002982.
Тужырымдар. Толык геномдык талдау н8тмижес ^азакстанда со^ы 10 жылдык кезечде белiнген N. meningitidis изоляттарыныщ егжей-тегжейлi молекулярлык сипаттамасына елеулi Yлес косты. ^азакстанда ж8не баска елдерде алынган изоляттар арасындагы генетикалык айырмашылык дечгейiн аныктауга мYмкiндiк бердк Толык геномдардыщ генетикалык филогениясы серотиптер мен штамдардыщ географиялык айналымын, сондай-ак елдер арасындагы берiлу жавдайларын аныктады.
TYurndi сездер: N. meningitidis, бактериялык менингит, секвенстеу, балалар.
Библиографическая ссылка:
Сейдуллаева А.Ж., Баешева Д.А., Турдалина Б.Р., Алтынбекова А.В., Турарова А.М., Данияров А.Ж., Каиров У.Е., Кожахметов С.С. Характеристика штаммов N. Meningitidis циркулировавших в г. Нур-Султан с 2010 по 2020 годы // Наука и Здравоохранение. 2020. 6 (Т.22). С. 26-34. doi 10.34689/SH.2020.22.6.004
Seidullayeva A.Zh., Bayesheva D.A., Turdalina B.R. , Altynbekova A.V., Turarova А.М., Daniyarov A.Zh., Kairov U.E., Kozhakhmetov S.S. Characteristic of N. Meningitidis strains circulated in Nur-Sultan from 2010 to 2020 // Nauka i Zdravookhranenie [Science & Healthcare]. 2020, (Vol.22) 6, pp. 26-34. doi 10.34689/SH.2020.22.6.004
Сейдуллаева А.Ж., Баешева Д.А., Турдалина Б.Р., Алтынбекова А.В., Турарова А.М., Данияров А.Ж., Каиров У.Е., Кожахметов С.С. Нур-Султан каласыныщ 2010-2020 жылдар аралыгындагы N.Meningitidis штамыныщ айналымдагы сипаттамасы // Гылым ж8не Денсаулык сактау. 2020. 6 (Т.22). Б. 26-34. doi 10.34689/SH.2020.22.6.004
Введение
Бактериальный менингит (БМ) - это актуальная проблема клинической педиатрии, которая приводит к высокой заболеваемости и смертности детей до 5 лет по всему миру [14]. По данным Всемирной организации здравоохранения (2016), заболеваемость БМ в странах с высоким уровнем дохода входит в десятку основных причин смерти детей в возрасте до 14 лет [17]. Заболевание при отсутствии лечения может привести к летальному исходу в 50% случаев. Как правило, 8-15% пациентов умирают, в течение 24 и 48 часов после появления симптомов, несмотря на раннюю диагностику и адекватное лечение. Кроме того, у 10-20% выживших наблюдается необратимые последствия, включающие повреждение головного мозга, потерю слуха, когнитивные и интеллектуальные нарушения [2].
Во всем мире среди бактериальных менингитов менингококковая инфекция (МИ) имеет наибольшую значимость, вследствие широкого распространения, при котором создаётся сложная эпидемическая ситуация не только для пораженных менингитом территорий, но и для соседних стран [5]. Для МИ характерно возрастное распределение, характеризующееся высокой частотой заболеваемости среди грудных детей в возрасте до 1 года, а также среди подростков и молодых людей до 30 лет [10].
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), менингококковый менингит (ММ) наблюдается на всех континентах, но самые высокие показатели этой болезни находятся в менингитном поясе Африки, к югу от Сахары, протянувшемуся от Сенегала на западе и до Эфиопии на востоке [4,17]. Ежегодно в этом районе регистрируется около 30 000 случаев заболеваний. Так,
например, во время эпидемического сезона в 2014 г. в 19 африканских странах, где осуществлялся усиленный эпиднадзор, было зарегистрировано 11 908 предполагаемых случаев заболевания, включая 1 146 случаев смерти [20].
Заметными атрибутами N. meningitidis высокий уровень генетической изменчивости. Геномное разнообразие менингококковых клонов обширно, и изменчивость происходит по большей мере при рекомбинации, это позволяет возбудителю быстро адаптироваться к меняющимся условиям окружающей среды. Инвазивные менингококковые заболевания вызываются N. Meningitidis, принадлежащим к серогруппам A, B, C, W, X и Y. В большинстве случаев заболевания вызываются штаммами, принадлежащими к таким гипервирулентным клонам как ST11 CC, ST32 CC, ST41 / 44 CC и т.д [18]. Вирулентность менингококков связана с основными компонентами внешней мембраны: капсульным полисахаридом, белками внешней мембраны (пили, порины, Opa, Opc) и липоолигосахаридом (эндотоксин).
Менингококковая инфекция в РК также сохраняет свою актуальность. Согласно статистическим данным, заболеваемость МИ у детей от 0 до 14 лет с 2012 по 2019 гг. имела разнообразные показатели. В среднем заболеваемость за анализируемый период составила 2,41% на 100 тыс. детского населения. Подъем заболеваемости был отмечен в 2015 г. и составил 5,52% (в 2012г.- 1,94%). Следует отметить, что по сравнению с 2012 г. (1,94%), наибольший подъем заболеваемости зарегистрирован в г. Нур-Султан, где показатель количества заболевших МИ увеличился в 16,1 раз (47,19%). Уровень заболеваемости по Казахстану в последующие годы имел тенденцию к
снижению данного показателя в сравнении с 2015 г (5,52%): в 2016 г. - в 1,6 раз (3,42%), с наименьшим уровнем показателей в 2017 г. и 2018 г. - в 7,1 раза (0,78%; 0,77%) соответственно, с незначительным изменением в 2019 г.- 6,8 раз (0,81%) [1].
Цель исследования: проведение молекулярно-эпидемиологического и генетического исследования штаммов N.meningitidis, циркулирующих в г. НурСултан.
Материалы исследования
Материалом для исследования послужили, как истории болезни (120 историй), с изолированной формой менингококковой инфекции «менингококковый менингит» и смешанной формой «менингококковый менингит + менингококцемия» у детей с января месяца 2010г. по сентябрь 2020г. так и микробные культуры N.meningitidis. Чистые культуры, сохранялись при -70 °C в триптиказо-соевом бульоне. Набор пациентов, включенных в исследование, проводился в отделении реанимации и интенсивной терапии, инфекционном отделении №1 и №2 Многопрофильной городской детской больницы №3 (МГДБ №3) акимата г. Нур-Султан. Все пациенты наблюдались во время стационарного лечения. Биоматериал от пациентов отбирался при поступлении в стационар. Всем больным для установления диагноза было проведено комплексное клинико-лабораторное и инструментальное исследование согласно клиническому протоколу «Диагностика и лечение менингококковой инфекции у детей» от 2014 и 2019 г. МЗ РК.
Критерии включения: дети от 1 месяца до 15 лет обоего пола, наличие бактериального возбудителя, идентифицированных в спинномозговой жидкости в сыворотке крови, результаты положительного посева на патогены и наличие клинических признаков менингита; информированное согласие для
родителей/усыновителей пациента на участие в клиническом исследовании, подписанное одним из родителей/усыновителей ребенка. Критерии исключения: дети с диагнозом туберкулезный менингит, доброкачественные и злокачественные опухоли головного мозга, вирусные менингиты и менингоэнцефалиты; дети получавшие антибиотики более 2-х доз амбулаторно; дети до 1 месяца и старше 15 лет;
Возрастная характеристика исследуемых пациентов выглядела следующим образом: наблюдались преимущественно дети в возрасте от 1 до 59 месяцев.
Методы
Бактериологический метод исследования, чувствительность к антибиотикам и серотипирование изолятов. Биоматериал (ликвор/кровь) собирали с использованием тампона (482C, COPAN Diagnostics Inc., Murrieta, CA), в соответствии с инструкцией изготовителя.
От детей в возрасте от 1 месяца до 15 лет было отобрано 120 образцов. Образцы анализировались в период с 2010 по 2020 гг. Проводилось как изучение среднего удельный вес заболеваемости, так и сезонные изменения числа случаев менингококковой инфекции. Для транспортировки образцов использовалась среда
LiquidAmies (Copan Diagnositics Inc.). Серотипирование N. meningitidis осуществлялось с использованием латекс-аглютинации, тест BIO-RADPASTOREXtm MENINGITIS.
Определение чувствительности к
антимикробным препаратам
Для определения чувствительности N. meningitidis к ципрофлоксацину, ванкомицину, меропенему, цефтриаксону, Цеф 4, рифампицину, пенициллину использовали диско-диффузионный метод (диски BioRad, США) использовали среду Мюллера-Хилтона с добавлением 5% крови человека [20].
Выделение ДНК N. meningitidis
Выделение ДНК из чистых культур N. meningitidis проводилось набором QIAamp UCP Pathogen Mini Kit согласно протоколу изготовителя.
Секвенирование N. meningitidis
Секвенирование N. meningitidis проводили на платформе MiSeq, Illumina, в соответствии с протоколом Nextera XTDNA Library Preparation Kit (24 samples) FC-131-1024.
Биоинформатический анализ
Для первичной оценки и обработки сиквенсовых прочтений применялся Trimmomatic [6] для удаления адаптерных последовательностей и фильтрации нуклеотидов по качеству. De novo сборка прочтений выполнена с использованием метода Velvet [19]. Контроль качества секвенирования: значения N50 (от 6 325 до 51 396), количество контигов (от 217 до 836).
Депонированные в базу данных Neisseria PubMLST сборки N. meningitidis были просканированы и помечены по определенным NEIS локусам с помощью подхода аннотации гена за геном [7]. Геномы сравнивались с публично доступными геномами из базы данных Neisseria PubMLST database (http://PubMLST.org/neisseria). Для сравнения были использованы 1 605 локусов N. meningitidis (встречаемость среди изолятов - 95%) в составе классификационной схемы N. meningitidis cgMLST v1.0 [9]. Неполные локусы были исключены, остальные сгруппированы на основе их типа (cgST).
В случае появления новых аллелей или неполных локусов проводилось секвенирование одного гена и ручная курация. Согласно инструментам обозначения, включенным в базу Neisseria pubMLST, изоляты характеризовались капсульным геногруппированием, тонким типированием белков внешней мембраны PorA и FetA и мультилокусным последовательным типированием (MLST) [11].
Инструментом сравнения сгенерированы матрицы расстояний на основе переменных аллелей в основных локусах, которые визуализировались с помощью SplitsTree4 (http://www.splitstree.org) [8].
Статистический анализ
Все полученные данные были внесены в разработанную регистрационную карту в бумажном и электронном вариантах, а также в базу данных Excel с шифрованием персональной информации пациентов.
Статистическую обработку полученных клинико-лабораторных данных проводили с использованием программы SPSS IBM Statists 20.
Исследовательская работа была одобрена Локальным этическим комитетом National Laboratory Astana (NLA) Назарбаев Университета (№20 от 22 сентября 2017 года). Пациенты и здоровые добровольцы были включены в исследование после подписания информированного согласия.
Результаты
С 2010 по 2020 гг в г. Нур-Султан было зарегистрировано 203 случая инвазивных менингококков. Для исследования случайным образом были отобраны 120 историй болезней пациентов с изолированными чистыми культурами возбудителей менингококковой инфекции.
Для определения серогрупп N.meningitidis, циркулирующих в г. Нур-Султан за период 2010-2020 года нами было проведено серотипирование штаммов (n=120) методом латекс агглютинации. Ранжирование серогрупп менингококка по убыванию показало, что
В таблице 1 представлена серогруппы менингококкового менингита по годам с 2010 по 2020гг. В результате исследования установлено, что из года в год отмечается вариабельность выделенных серогрупп менингококка. Как представлено на рисунке - 2 в г. НурСултан в 2010 году преобладала серогруппа «В» -77,7% (п=7), в 2011г. увеличилась частота серогуппы «А» - 75% (п=3), в 2013 году выявлена новая серогруппа «29Е» - 20% (п=2) и в 2015г. в период пика заболеваемости МИ наиболее часто регистрировалась серогруппа «А» - 78,4% (п=47) случаев. В 2016г. наблюдалось снижение частоты серогруппы «А» в 5 раз (в сравнении с 2015 годом от 47 до 8 случаев-66,7%), а серотип «В» составил 33,3% (п=4). В 2017г. вновь появилась серогруппа <^135»- 66,7% (п=2), снизилась частота серогруппы «В» до 33,1% (п=1), в 2018 г и 2019 г отмечены единичные случаи регистрации серотипов «А», «В», «С» и в 2020 г. до сентября месяца включительно «А»-25% (п=1), «С»-50% (п=2), «М135»-25% (п=1) (таблица 1).
Для выявления сезонности менингококка у исследуемых пациентов нами была проанализирована частота обращаемости пациентов в стационар с января по декабрь 2010 - 2020гг. Как показано на графике
серогруппа «А» встречается в 59,2% (n=71), серогруппа «В» - 24,2% (n=29) серогруппа «С» - 10,8% (n=13) и самый низкий процент «W135» - 4,2% (n=5) и «29Е» -1,7% (n=2) (рисунок 1).
Рисунок 1. Средний удельный вес серогрупп N.meningitidis за 2010-2020 гг. в г. Нур-Султан.
(Figure 1. Average specific gravity of N. meningitidis Serogroup for 2010-2020 in Nur-Sultan).
сезонный подъем регистрации менингита (N.meningitidis) приходился на март-май месяц (рисунок 2).
Наименьшие показатели встречаемости данной патологии отмечаются с одинаковой частотой в летне-осенний период (август-октябрь) в 0,08% случаев соответственно.
Также в рамках данной задачи у исследуемых детей мы определяли чувствительность N.meningitidis к антибиотикам. По нашему клиническому опыту пенициллин, по-прежнему, сохраняет высокую эффективность при лечении менингококкового менингита, а при пневмококковом менингите -цефтриаксон, цефотаксим в комбинации с ванкомицином. Проведенный анализ показал абсолютную чувствительность (100%) к ципрофлоксацину, ванкомицину, меропенему, цефтриаксону, Цеф 4, рифампицину, наименьшая чувствительность в 87,5% случаев была отмечена к пенициллину.
С целью дополнительной характеристики штаммов выделенных в период подъема заболеваемости (2015г.) нами проведена генетическая характеристика штаммов N.meningitidis методом полногеномного секвенирования.
Таблица 1.
Серогруппы менингококкового менингита циркулировавшие с 2010 по 2020 гг. в г. Нур-Султан.
(Table 1. Serogroups of meningococcal meningitis circulated from 2010 to 2020 in Nur-Sultan).___
A B C W135 29E итого
абс % абс % абс % абс % абс %
2010 2 22,3 7 77,7 0 0 0 0 0 0 9
2011 3 75 1 25 0 0 0 0 0 0 4
2012 2 33,4 3 50 0 0 1 16,4 0 0 6
2013 3 30 3 30 1 10 1 10 2 20 10
2014 4 50 4 50 0 0 0 0 0 0 8
2015 47 78,4 5 8,3 8 0 0 0 0 0 60
2016 8 66,6 4 33,4 0 0 0 0 0 0 12
2017 0 0 1 33,4 0 0 2 66,6 0 0 3
2018 0 0 1 50 1 0 0 50 0 0 2
2019 1 50 0 0 1 50 0 0 0 0 2
2020 1 25 0 0 2 50 1 0 0 0 4
итого 71 29 13 5 2 120
Рисунок 2. Средний удельный вес сезонного изменения числа случаев заболеваний менингококкового менингита за 2010-2020 гг. в г. Нур-Султан.
(Figure 2. Average share of seasonal changes in the number of cases of meningococcal meningitis for 2010-2020 in Nur-Sultan).
С целью дополнительной характеристики штаммов выделенных в период подъема заболеваемости (2015г.) нами проведена генетическая характеристика штаммов N.meningitidis методом полногеномного секвенирования.
Для полногеномного секвенирования (WGS) были отобраны 4 клинических изолятов N.meningitidis выделенные во время вспышки менингококковой инфекцией в г. Нур-Султан. Собранные de novo геномы были отсканированы платформой BIGSdb для определения: генотипических профилей, cgMLST, вариантов вакцинного антигена и аллельных типов
генов, связанных с резистентностью к антимикробным препаратам, а также локусов путей денитрификации. Количество контигов (от 136 до 407), кратность покрытия (от 55 до 163). Параметр длины K-mer варьировал между изолятами от 91 до 180 (в среднем 149). N. meningitidis 33 (размер генома 2 113 281 п.н., 261 контиг, GC контент 51,7%), N. meningitidis 41 (размер генома 2 235 228 п.н., 594 контигов, GC контент 51,0%), N. meningitidis 165 (размер генома 2 111 985 п.н., 343 контигов, GC контент 51,8%), N. meningitidis 197 (размер генома 2 205 055 п.н., 380 контигов, GC контент 51,6%).
Таблица 2.
Таблица 2. Определение PubMLST серогрупп и страны первичного изолирования N. meningitidis.
Table 2. Definition of PubMLST serogroups and country of primary isolation for N. meningitidis).
№ штамм Наименование изолята PubMLST серогруппа PubMLST Страна первичного изолята PubMLST ID
33 N. meningitidis Y Russia 63030
41 N. meningitidis A Russia 83978
165 N. meningitidis B USA 13795
197 N. meningitidis B USA 53516
Как известно, MLST является наиболее подходящим инструментом для характеристики популяции штаммов N. meningitidis, выявления эпидемически значимых клональных комплексов и циркулирующих штаммов. В нашем исследовании геномы сравнивались с публично доступными в Neisseria PubMLST database (http://PubMLST.org/neisseria). Для сравнения между геномами использовались 1 605 локусов N. meningitidis (локусы встречаются в 95% изолятов в Neisseria PubMLST database) в N. meningitidis cgMLST v1.0 (№27).
На основе полученных данных были определены серогруппы изученных возбудителей. Аллели,
обнаруженные и идентифицированные в каждой сборке, скринировали в отношении генов в областях A (синтез капсулы), B (транслокация капсулы), C (транспорт капсулы). Для серогрупп A, B, C, W и Y, и 10 капсульных генов, присутствующих в этих областях. Геногруппу капсулы определяли на основе идентификации по меньшей мере одного серогрупп-специфического гена. Серогруппы штаммов N. meningitidis №33, 41, 197 были подтверждены. Серогруппа штамма N. meningitidis №165 была уточнена, штамму была присвоена серогруппа «В» (таблица 3).
Таблица 3
Описание генов антибиотикорезистентности N. meningitidis.
(Table 3. Description of antibiotic-resistant genes genes of N. meningitidis)._
Механизм АМП Гены
Антибиотик-мишень у восприимчивых видов Alr, Ddl, dxr, EF-G, EF-Tu, folA, Dfr, folP, gyrA, gyrB, inhA, fabI, Iso-tRNA, kasA, MurA, rho, rpoB, rpoC, S10p, S12p
Дренажный насос, придающий устойчивость к антибиотикам EmrAB-TolC, MacA, MacB
Ген, придающий устойчивость через отсутствие gidB
Белок, изменяющий заряд клеточной стенки, придающий устойчивость к антибиотикам PgsA
Регулятор, модулирующий экспрессию генов устойчивости к антибиотикам OxyR
Обсуждение результатов
Таким образом, анализ историй болезни пациентов, пролеченных с диагнозом «менингококковый менингит» в МГДБ №3 г. Нур-Султан за 2010-2020 гг., показал наибольший удельный вес выявляемое™ среди серогрупп «А» - 59,2% (n=71), на втором месте «В» -24,2% (n=29), на третьем - «С» - 10,8% (n=13) и низкий показатель у серогрупп «W135» - 4,2% (n=5) и «29Е» -1,7% (n=2).
При полногеномном секвенировании выявлен аллельный профиль расширенного MLST клонального комплекса серогруппы N.meningitidis: «А» (ST11- ST12) -40%, «В» (ST- 6) - 20%, «Y» (ST-10) - 20% «С» (ST-1) -20%, определена их 100% чувствительность к рифампицину и 50% устойчивость к пенициллину. Результаты полногеномного анализа N.meningitidis были депонированы в международную базу данных Genbank со следующими номерами: SRX7002979, SRX7002980, SRX7002981, SRX7002982 (PubMLST, https: //www. ncbi. nlm. nih. gov/sra/term). Определен уровень генетического расхождения между изолятами полученными в Казахстане и других странах. Анализируемые штаммы имели аллели penA 83, кодирующих пенициллин-связывающий белок 2 (PBP2). Известно, что изменения в PBP2 напрямую связаны со снижением восприимчивости к менингококков к пенициллину [12]. Так, штаммы несли резистентеность к пенициллину 50% (pen Aallele: 83) и чувствительность к рифампицину 100% (rpo B allele: 1 (rifampicin MIC: <=1). Что также подтверждено культуральными методами. Наши данные согласуются с литературными данными [13].
Также анализ нуклеотидных последовательностей выявил присутствие и других генов, связанных с антибиотикорезистентностью, таблица 2. Хотя пенициллин не является первым препаратом выбора для лечения, его все же рекомендуется использовать, если может быть задержка доступа к цефалоспоринам третьего поколения. Вместе с тем в этом исследовании нам не удалось генетически подтвердить фенотипические характеристики
анатибиотикорезистентности к другим исследованным противомикробным препаратам у изученных штаммов, кроме пенициллина и рифампицина, что требуют дальнейшей проработки.
Характеристика сезонности бактериального менингита имеет важное значение для углубленного
понимания эпидемиологии, экологии и динамики передачи заболевания и является ключом к разработке и реализации оптимальных стратегий профилактики и контроля. По данным Paireau J. с соавт. (2016) в странах Африканского пояса менингита сезонный пик заболеваемости приходится на засушлевый сезон. МИ имеет значительные сезонные закономерности в странах, анализируемых за пределами пояса, где более высокая заболеваемость наблюдается зимой как в северном, так и в южном полушариях [13,16].
Mueller J.E. (2013) также отмечал сезонность заболеваемости менингитами, которая характеризуется увеличением числа бактериальных менингитов зимой и серозных менингитов в летний период, что подтверждает результаты нашего исследования [15].
Анализ сезонности при заболеваемости МИ в г. НурСултан показал, что наиболее часто заболевание регистрируется в весеннее время (март-май).
Расшифровка этиологического агента при менингитах имеет важное значение для обоснования лечебно-профилактических и противоэпидемических мероприятий [2].
Несмотря на возможности эффективного проведения антимикробной и интенсивной терапии, общие показатели смертности при бактериальных менингитах остаются высокими, в среднем составляя от 20 до 25% [3].
Аналогичная ситуация у детей с БМ отмечается в МГДБ №3, г. Нур-Султан, в связи с чем нами определялась чувствительность выделенных патогенов к антибиотикам, в результате которого, высокая чувствительность (100%) отмечена к ципрофлоксацину, ванкомицину, меропенему, цефтриаксону, Цеф 4, рифампицину, наименьшая чувствительность в 87,5% случаев была определена к пенициллину. Наши данные относительно чувствительности к антибиотикам согласуются с отчетами многих европейских стран [21].
Эти результаты убедительно подтверждают использование цефалоспоринов третьего поколения для эмпирического лечения ИМИ в РК. Наблюдаемая устойчивость к часто используемым антибиотикам может быть связана с широким распространением использования безрецептурных антибиотиков.
Наши результаты подчеркивают важность молекулярного эпиднадзора за менингококками в регионе, а также потенциальной разработки доступной вакцины против циркулирующих серотипов.
Вклад авторов:
Сейдуллаева А.Ж. - набор данных, описательная часть, формальный анализ.
Баешева Д.А., Турдалина Б.Р. - научное руководство, концепция и концептуализация.
Алтынбекова А.В. - набор данных и менеджмент ресурсов исследования.
Турарова А.М. - набор данных.
Данияров А.Ж. - биоинформатический и статистический анализ.
Каиров У.Е. - биоинформатический анализ.
Кожахметов С.С. - критический анализ, научное сопровождение статьи, ревизия статьи.
Финансирование: Данное исследование проводилось в рамках проекта МОН РК по грантовому финансированию АР05135091.
Конфликтов интересов не заявлен.
Сведения о публикации: ни один фрагмент данной статьи не был опубликован в других журналах и не находится на рассмотрении другими издательствами.
Литература:
1. Баешева Д.А., Жаксылыкова Г.А., Сейдуллаева А.Ж. Мониторинг заболеваемости менингококковой инфекцией в Республике Казахстан за 2012-2017 гг. среди детского населения // Валеология. 2018. № 3: С. 41-47.
2. Ералиева Л.Т. Совершенствование диагностики бактериальных менингитов у детей и иммунопатогенетические подходы к терапии: дис. ...д-ра мед.наук. Алматы. 2010, 210 с.
3. Ералиева Л.Т., Мусаев А.Т., Ешманова А.К., Уалиева С.Т. Характеристика клинико-биохимических критериев пневмококкового менингита у детей // Вестник КазНМУ. 2014. №4. С. 246-250.
4. Ahmed M.M., Nour M.A.K., Soheir S.M. Detection of Neisseria meningitidis DNA in blood samples using direct-PCR test // Egyptian pharmaceutical journal, 2013. 1(1): р. 115-119.
5. Batista, R.S., Gomes A.P., Gazineo J.L.D., Miguel P.S.P. Santana L.A., Geller L.O.M. Meningococcal disease, a clinical and epidemiological review // Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 2017. 10(11): P. 1019-1029.
6. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data // Bioinformatics, 2014. 30(15): P. 2114-2120.
7. Bratche, H.B., Corton C., Jolley K.A., Parkhill J., Maiden M.C.J. A gene-by-gene population genomics platform: de novo assembly, annotation and genealogical analysis of 108 representative Neisseria meningitidis genomes // BMC Genomics, 2014. 15(1): p. 1138.
8. Huson D.H., Bryant D. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies // Mol Biol Evol, 2006. 23(2): P. 254-67.
9. Jolley K.A., Bray J.E. Maiden M.C.J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications // Wellcome open research, 2018. 3: p. 124-124.
10. Kambire D., Soeters H.M., Ouedraogo-Traore R., Medah I., Sangare L. Nationwide Trends in Bacterial Meningitis before the Introduction of 13-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine-Burkina Faso, 20112013 // PloS one, 20. 11(11): P. e0166384-e0166384.
11. Kim H.-J., Fay M.P., Feuer E.J. Midthune D.N. Permutation tests for joinpoint regression with applications to cancer rates // Statistics in Medicine, 2000. 19(3): P. 335351.
12. Kim K.S. Acute bacterial meningitis in infants and children // Lancet Infect Dis. 2010. Vol. 10. P. 32-42.
13. Levy C., de La Rocque F, Cohen R. Epidemiology of pediatric bacterial meningitis in France // Med Mal Infect. 2009.39. P. 419-431.
14. Martin N.G., Sadarangani M, Pollard A.J., Goldacre M.J. Hospital admission rates for meningitis and septicaemia caused by Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, and Streptococcus pneumoniae in children in England overfive decades: a population-based observational study // Lancet Infect Dis. 2014. 14. P. 397405.
15. Mueller J.E. Conjugate vaccine introduction in the African meningitis belt: meeting surveillance objectives // Tropical Medicine and International Health. 2013. Vol. 18. 1. P. 58-64.
16. Paireau J., Chen A., Broutin H. Grenfell B., Basta N.E. Seasonal dynamics of bacterial meningitis: a time-series analysis // Lancet Glob Health. 2016 Jun; 4(6): e370-e377.
17. WHO, Global burden of disease estimates. Geneva: World Health Organization, 2016. 01.09.2020.
18. Yazdankhah S.P., Kriz P., Tzanakaki G., Kalmusova J., Musilek M., Alvestad T., Jolley K.A., Wilson D.J., McCarthy N.D., Caugant D.A., Maiden M.C.J. Distribution of serogroups and genotypes among disease-associated and carried isolates of Neisseria meningitidis from the Czech Republic, Greece, and Norway // J Clin Microbiol. 2014. 42. P. 5146-5153.
19. Zerbino D.R., Birney E. Velvet: Algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs // Genome Research, 2008. 18(5): P. 821-829.
20. Zhang Y, Wei D, Guo X., Han M., Yuan L. Kyaw H.M. Burden of Neisseria meningitidis infections in China: a systematic review and meta-analysis // Journal of global health, 2016. 6(2): P. 020409-020409.
21. Zouheir Y., Atany T. Boudebouch N. Emergence and spread of resistant N. meningitidis implicated in invasive meningococcal diseases during the past decade (2008-2017) // The Journal of Antibiotics. 2019. Vol. 72. P. 185-188.
References:
1. Baesheva D.A., Zhaksylykova, G.A., Seidullaeva, A.Zh. Monitoring zabolevaemosti meningokokkovoi infektsiei v Respublike Kazakhstan za 2012-2017 gg. sredi detskogo naseleniya [Monitoring the incidence of meningococcal infection in the Republic of Kazakhstan for 2012-2017 among the child population]. Valeologiya [Valeology]. 2018. Vol. 3: pp. 41-47 [in Russian].
2. Eralieva L.T. Sovershenstvovanie diagnostiki bakterial'nykh meningitov u detei i immunopatogeneticheskie podkhody k terapii [Improving the diagnosis of bacterial meningitis in children and immunopathogenetic approaches to therapy]: dokt. diss. Almaty. 2010. 210p. [in Russian].
3. Eralieva L.T., Musayeva A.T., Echmanova A., Ualiyeva S. Kharakteristika kliniko-biokhimicheskikh kriteriev pnevmokokkovogo meningita u detei [Characteristics of clinical and biochemical criteria for pneumococcal meningitis in children]. Vestnik KazNMU [Bulletin KazNMU]. 2014. 4. pp. 246-250 [in Russian].
4. Ahmed M.M., Nour M.A.K., Soheir S.M. Detection of Neisseria meningitidis DNA in blood samples using direct-PCR test. Egyptian pharmaceutical journal. 2013. 1(1): p. 115-119.
5. Batista R.S., Gomes A.P., Gazineo J.L.D., Miguel P.S.P., Santana L.A. Geller L.O.M. Meningococcal disease, a clinical and epidemiological review. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2017. 10(11): P. 1019-1029.
6. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014. 30(15): p. 2114-2120.
7. Bratcher H.B., Corton C., Jolley K.A., Parkhill J., Maiden M.C.J. A gene-by-gene population genomics platform: de novo assembly, annotation and genealogical analysis of 108 representative Neisseria meningitidis genomes. BMC Genomics. 2014. 15(1): P. 1138.
8. Huson D.H., Bryant D. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Mol Biol Evol. 2006. 23(2): P. 254-67.
9. Jolley K.A., Bray J.E., Maiden M.C.J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome open research. 2018. 3: P. 124-124.
10. Kambire D., Soeters H.M. Ouedraogo-Traore R., Medah I., Sangare L. Nationwide Trends in Bacterial Meningitis before the Introduction of 13-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine-Burkina Faso, 20112013. PloS one. 20. 11(11): p. e0166384-e0166384.
11. Kim H.-J., Fay M.P., Feuer E.J., Midthune D.N. Permutation tests for joinpoint regression with applications to cancer rates. Statistics in Medicine. 2000. 19(3): P. 335351.
12. Kim K.S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infect Dis. 2010. Vol. 10. P. 32-42.
13. Levy C., de La Rocque F., Cohen R. Epidemiology of pediatric bacterial meningitis in France. Med Mal Infect. 2009.39. P. 419-431.
14. Martin N.G., Sadarangani M., Pollard A.J., Goldacre M.J. Hospital admission rates for meningitis and septicaemia caused by Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, and Streptococcus pneumoniae in children in England overfive decades: a population-based observational study. Lancet Infect Dis. 2014. 14. P. 397-405.
15. Mueller J.E. Conjugate vaccine introduction in the African meningitis belt:meeting surveillance objectives. Tropical Medicine and International Health. 2013. Vol. 18. 1. P. 58-64.
16. Paireau J., Chen A., Broutin H., Grenfell B., Basta N.E. Seasonal dynamics of bacterial meningitis: a time-series analysis. Lancet Glob Health. 2016 Jun; 4(6): e370-e377.
17. WHO., Global burden of disease estimates. Geneva: World Health Organization, 2016. 01.09.2020.
18. Yazdankhah S.P., Kriz P., Tzanakaki G. Kalmusova J., Musilek M., Alvestad T., Jolley K.A., Wilson D.J., McCarthy N.D., Caugant D.A., Maiden M.C.J. Distribution of serogroups and genotypes among disease-associated and carried isolates of Neisseria meningitidis from the Czech Republic, Greece, and Norway. J Clin Microbiol. 2014. 42. P. 5146-5153.
19. Zerbino D.R., Birney E. Velvet: Algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Research. 2008. 18(5): P. 821-829.
20. Zhang Y., Wei D., Guo X., Han M., Yuan L. Kyaw H.M. Burden of Neisseria meningitidis infections in China: a systematic review and meta-analysis. Journal of global health. 2016. 6(2): P. 020409-020409.
21. Zouheir Y., Atany T., Boudebouch N. Emergence and spread of resistant N. meningitidis implicated in invasive meningococcal diseases during the past decade (2008-2017). The Journal of Antibiotics. 2019. Vol. 72. P. 185-188.
Контактная информация:
Кожахметов Самат Серикович - к.б.н., ведущий научный сотрудник, Центр наук о жизни, National Laboratory Astana, Назарбаев Университет, Нур-Султан, Республика Казахстан.
Почтовый адрес: Республика Казахстан, 010000, г. Нур-Султан, пр. Кабанбай батыра 53, Астана. E-mail: skozhakhmetov@nu.edu..kz Телефон: +7 705 910 0932
