CC BY
57
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Ильичева А.С., Фомина М.А., Медведев Д.В., 2014 УДК 577.1+616-008
ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ БЕЛКОВ МИОКАРДА НА ФОНЕ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ
А С. ИЛЬИЧЕВА, М.А. ФОМИНА, Д.В. МЕДВЕДЕВ
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань
CHARACTERISTIC PRODUCTS OF OXIDATIVE DAMAGE OF PROTEINS IN HEART MUSCLE WITH HYPERHOMOCYSTEINEMIA
A S. ILICHEVA, M.A. FOMINA, D.V. MEDVEDEV
Ryazan State Medical University, Ryazan
Изучены продукты окислительного повреждения белков в миокарде при выраженной гипергомоцистеинемии. Обнаружено значительное нарастание содержания динитрофенилгидразонов в экспериментальной группе, преимущественно за счет альдегидных производных.
Ключевые слова: окислительная модификация белков, динитрофенилгидра-зоны, сердечная мышца, гипергомоцистеинемия.
The products of oxidative damage of proteins in heart muscle with hyperho-mocysteinemia were investigated. The significance increasing of contents dinitro-phenylhydrazine (DNPH) was found in the experimental group, primary at the expense of aldehyde derivatives.
Keywords: oxidative modification of proteins, heart muscle, dinitrophenylhydra-zine (DNPH), hyperhomocysteinemia.
Введение
В основе развития оксидативно-го стресса лежит увеличение продукции свободных радикалов и (или) снижение эффективности антиокси-дантных систем организма. Повышенная концентрация окисленных макромолекул, особенно при длительной персистенции в организме, формирует различные патологические процессы, сопровождающиеся повышенным катаболизмом. Одно из значимых последствий оксидативного стресса - повреждение структуры нуклеиновых кислот, липидов, белков, что провоцирует генерацию вторичных активных форм [11, 12]. Из-за высокой распространенности в биологических системах белки являются главными мишенями для АФК/АФА [10]. Окислительные изменения структуры белка разнообразны и многочисленны, приводят к различным функциональным изменениям [5]. Помимо того, окислительномодифи-цированные белки способствуют вторичному повреждению других биомолекул. В настоящее время среди клинически значимых провокаторов свободно-радикальной патологии рассматривается гомоцистеин, являющийся промежуточным звеном в обмене незаменимой аминокислоты ме-тионина. Обладая прооксидантной активностью из-за наличия БИ-группы, гомоцистеин при высоких
концентрациях окисляется собразова-нием свободных радикалов, что ведет к развитию оксидативного стресса. Кроме того, известно, что гипергомо-цистеинемия влечет за собой развитие тромбоваскулярных осложнений [2], провоцирует коронарный атеросклероз и ассоциированный с ним ин-фарктмиокарда [3], изучение факторов риска которого, особенно в молодом возрасте, остается актуальной медико-социальной задачей [7].
Цель исследования
Охарактеризовать продукты окислительной модификации белков (ОМБ) в миокарде при экспериментальной гипергомоцистеинемии.
Материалы и методы
Исследование проводилось на 12 белых конвенциональных крысах-самцах линии Wistar массой 320 грамм, разделенных на 2 группы по 6 особей. Гипергомоцистеинемию моделировали введением растворов метио-нина в Твин 80 [4] в течение 21 суток с дополнительным добавлением метио-нина в питьевую воду. В качестве контрольной группы использовались животные, сопоставленные с экспериментальной по полу и массе, получавшие Твин 80 peros в течение 21 дня. Содержание гомоцистеина в сыворотке крови осуществляли методом имму-ноферментного анализа с использова-
нием коммерческого набора компании Axis Shield, Норвегия. После выведения животного из эксперимента, из навески тканей миокарда готовили го-могенат. ОМБ определяли во внелизо-сомальной фракции по методу R.l. Levineв модификации Е.Е. Дубининой [1]. Характеристика продуктов окислительного повреждения белков осуществлялась согласно авторской мето-
Результаты исследования выражались в е.о.п/г белка. Содержание белка измеряли по методу Лоури с использованием коммерческого набора Клини Тест-БЛ НПЦ «Эко-сервис», СПб. Статистический анализ данных проводили используя программное обеспечение Мicrosoft Excel и программу Statistika 10. Для каждой выборки рассчитывали медиану (Ме), верхний и нижний квартили [Q1; Q3]. Статистическую значимость отличий показателей экспериментальной
группы от группы сравнения оценивали по U - критерию Манна-Уитни.
дики [9], а именно, график спектра ОМБ делился на области видимого света (I 380-790 нм), ультрафиолетового излучения (I 100-400) нм и на сегменты, где регистрировались альдегидные (АДНФГ) и кетонные карбонильные производные (КДНФГ). Соответствие длины волны поглощения и продуктов окислительной модификации белков представлено в таблице1.
Результаты и их обсуждение
На фоне экспериментальной ги-пергомоцистеинемии получено достоверное увеличение динитрофенилгидра-зонов по сравнению с контрольной группой (рис. 1). При этом обнаружилось статистически значимое нарастание содержания альдегидных и кетоновых динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера (табл. 2).
Из данных таблицы 2 видно зна-чительноепревалирование содержания АДНФГ, которые выступают в роли первичных маркеров окислительного стресса [8] и показывают возможное накопление фрагментированных по-
Таблица 1
Соответствие длины волны поглощения и продуктов окислительной модификации белков
АДНФГ нейтрального характера КДНФГ нейтрального характера АДНФГ основного характера КДНФГ основного характера
Длина волны, нм 230, 254, 270, 280, 356 363, 370 428, 430 430, 434, 524, 535
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05).
0,25
230 254 270 280 356 363 370 428 430 434 520 535
Рис. 1. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов ОМБ миокарда
при ГГЦ и группы сравнения
Таблица 2
Площади под кривой спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков (е.о.п/г белка, Ме[01;03])
8 АДНФГ нейтр. 8 КДНФГ нейтр. 8 АДНФГ осн. 8 КДНФГ осн. 8 общая
Контроль п=6 1,86 [1,50; 5,33] 0,39 [0,24; 0,55] 0,22 [0,04;0,35] 0,018 [0,004; 0,1] 2,32 [2,19; 5,42]
ГГЦп=6 16,12* [11,46;16,53] 4,06* [3,03;4,41] 3,30* [3,04;3,76] 0,51* [0,45;0,68] 22,84* [19,96;24,1]
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05).
врежденных белков в тканях миокарда. Предположительно, высокие концентрации гомоцистеина приводят к формированию смешанных дисульфидов и дополнительному образованию активных форм кислорода, и, как следствие, возникновению оксидативных нарушений в ткани миокарда. Содержание КДНФГ также статистически значимо возросло, но изменения оказались менее выраженными. На рисунках 2, 3 представлено соотношение динитрофенилгидразонов различных
типов в контрольной и экспериментальной группах. Причем внутри контрольной группы доля АДНФГ оказалась выше, той же доли при ГГЦ, а вот доля КДНФГ, как вторичного маркера окислительного стресса, оказалась выше в экспериментальной выборке по сравнению с контрольной группой, что подтверждает развитие достаточно интенсивного оксидативного повреждения, сопровождающегося дополнительным формированием агрегированных окисленных молекул [9].
АДНФГ
84%
АДНФГ ■ КДНФГ
Рис. 2. Соотношение маркеров окислительного стресса в контрольной группе
АДНФГ 81%
АДНФГ ■ КДНФГ
Рис. 3. Соотношение маркеров окислительного стресса при экспериментальной гипергомоцистеинемии
По-видимому, цитотоксическое действие гомоцистеина, и как следствие, развитие окислительного стресса, может приводить к возникновению дисфункций различных органелл клет-
ки, нарушению транскрипции и трансляции нуклеиновых кислот [14]. Например, при дисфункции митохондрий может возрастать их способность к су-пероксидобразованию [6], что увеличи-
вает вероятность свободно радикального повреждения миокарда, выражаю-щегосяв повышенном окислении миог-лобина [13], нарушении процессов связывания Са2+ с тропонином и усилении взаимодействия с другими сократительными белками, что ведет к ослаблению сократительной способности миокарда. Развитие окислительного стресса может запускать процессы некроза или апоптоза кардиомиоцитов, с накоплением продуктов белковой деградации в клеточных компартментах или даже внеклеточно, тем самым подавляя функцию протеасом. Выраженная гипергомоцистеинемия приводит к так называемому порочному кругу, а именно, уменьшению протеолиза с одновременным накоплением окислительно-поврежденных белков.
Выводы
1. Общее содержание продуктов окислительной модификации бел-ковв миокарде при выраженной гипер-гомоцистеинемии резко возрастает по сравнению с контролем, что демонстрирует развитие оксидативного стресса.
2. Содержание первичных маркеров превышаетсодержание вторичных маркеров окислительного стресса.
3. Преобладание нарастания АДНФГ может свидетельствовать о большой вероятности запуска процесса фрагментации при накоплении поврежденных белков.
Литература
1. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения [Teкст] / Е.Е. Дубинина [и др.] // Вопросы медицинской химии. - 1995. - Т. 41, №1. - С. 24-26.
2. Костюченко Г.И. Гиперго-моцистеинемия: клиническое значение, возрастные особенности, диагностика и коррекция [Teкст] / Г.И. Кос-тюченко // Клинич. геронтология. -2007. - Т. 13, №4. - С. 32-40.
3. Маслов А.П. Гипергомоци-стеинемия и повышенный риск сердечно-сосудистых осложнений у больных ИБС с атерогенной гиперхолестерине-мией [Teкст] / А.П. Маслов, А.Т. Тепляков, А.В. Кузнецова // Сиб. мед. журн. -2009. - № 4, вып. 9. - С. 25-30.
4. Модель гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс [Teкст] / М.В. Корокин [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2011. - Т. 152, №8. - С. 173.
5. Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования [Teкст] / Л.Е. Муравлева [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2010. - №1. - С. 74-78.
6. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания [Teкст] / Е.Б. Меньщикова [и др.]. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
7. Селиверстова Д.В. Инфаркт миокарда у пациентов молодого возраста: факторы риска, течение, кли-
ника, ведение на госпитальном этапе [Текст] / Д.В. Селивертова, О.В. Ев-сина // Наука молодых (Eruditio Juvenium). - 2013. - № 4. - С. 110-114.
8. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях [Текст] / Ю.И. Губский [и др.] // Современные проблемы токсикологии. - 2005. - Т. 8, №3. - С. 20-27.
9. Фомина М.А. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях [Текст] / М.А. Фомина, Ю.В. Абаленихина; ГБОУ ВПО РязГМУ им. акад. И.П. Павлова. - Рязань, 2014. - 60 с.
10. Biomarkers of Oxidative Damage in Human Disease [Text] / Isabella
Dalle-Donne [et al.] // Clinical Chemistry.
- 2006. - Vol. 52, №4. - P. 601-623.
11. Colak E. New markers of oxidative damage to macromolecules [Text] / E. Colak // JMB. - 2008. - P. 1-16.
12. Stadtman E.R. Protein oxidation [Text] / E.R. Stadtman, R.L. Levine // Annals of N.Y. Academy of Sciences.
- 2000. - Vol. 899. - P. 191-208.
13. Hydrogen peroxide plays a key role in the oxidation reaction of myoglobin by molecular oxygen - A computer simulation [Text] / T. Wasawa [et al.] // Biophys. J. - 1992. - Vol. 63. -P. 544-550.
14. Weisfeldt ML. Oxygen-derived free radicals and myocardial ischemic injury [Text] / M.L. Weisfeldt, J.L. Zweier, J.T. Flaherty // Heart Dis. -1988. - № 3. - P. 60-72.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Ильичева А. С. - ассист. кафедры биохимии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, зав. КДЛ ФДПО МУЗ ГКБ Коломенская центр. районная больница, г. Рязань. E-mail: sergan52006@rambler.ru.
Фомина М.А. - к.м.н., доц. кафедры биохимии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.
E-mail: marya.fom@yandex.ru.
Медведев Д.В. - ассист. кафедры биохимии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.
E-mail: meddmit@mail.ru.
