CC BY
52
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И БИОЛОГИЯ
УДК 547.562.33:615.9:591.463.1:577.121.7]-092.9:599.323.4 © К.В. Булыгин, 2009
К.В. Булыгин
ХАРАКТЕРИСТИКА ОКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ЭЯКУЛЯТА САМЦОВ КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ
БИФЕНИЛОВ
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Изучены отдельные звенья антиоксидантной системы эякулята крыс, подвергшихся подострому отравлению промышленной смесью ПХБ «Совол» в суммарных дозах 0,05 LD50 и 0,1 LD50. Установлено, что при воздействии полихлорбифе-нилов наблюдаются нарушения количественных и качественных параметров спермы, накопление продуктов липоперокси-дации, угнетение активности глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и уменьшение содержания неферментативного звена антиоксидантной системы, что приводит к развитию окислительного стресса в эякуляте экспериментальных животных.
Ключевые слова: полихлорированные бифенилы, эякулят, окислительный стресс.
K.V. Bulygin
THE CARACTERIZATION OF THE OXIDANT-ANTIOXIDANT SYSTEM OF MALE RATS' EJACULATE EXPOSED TO POLYCHLORINATED BIPHENYLS
We have studied certain links of the antioxidant system of rats' ejaculate exposed to acute poisoning by an industrial mixture of "Sovol" polychlorinated biphenyl at doses of 0,05 LD50 and 0,1 LD50. It has been established that with polychlorbiphenyls impact, there are disorders of sperm qualitative and quantitative parameters, accumulation of lipoperoxidation products, glutationperoxidase activity suppression and a decrease in nonenzyme link of the antioxidant system. This brings about the development of oxidation stress in the ejaculate of experimental animals.
Key words: polychlorinated biphenyls, ejaculation, oxidation stress.
Популяционные исследования, выполненные в разных странах, подтверждают, что на протяжении последних десятилетий наблюдается постоянное снижение качества спермы человека и животных [1,2,3]. Большинство авторов при попытке объяснения причин данного феномена отмечают связь выявленных тенденций с изменявшимися на протяжении прошлого века внешними факторами и прежде всего прогрессивным ростом уровня загрязнения окружающей среды [4,5]. В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что абсолютное большинство экополлютантов появилось именно в середине прошлого века, и они имеют искусственное антропогенное происхождение [6].
Особое место среди них занимают полихлорированные бифенилы (ПХБ) как отдельный класс стойких органических загрязнителей. По некоторым оценкам, в мире было произведено всего от 1 до 2 млн. тонн поли-хлорбифенилов [6]. Сейчас их промышленный выпуск, осуществлявшийся на протяжении более половины прошлого столетия, запрещен международными соглашениями, однако эксплуатация содержащего бифенилы оборудования продолжается и до сих пор. Об-
ладая чрезвычайно высокой физикохимической стабильностью и исключительными свойствами диэлектрика, ПХБ в нашей стране выпускались в виде технологических смесей «Совол» и «Совтол», предназначавшихся преимущественно для трансформаторов, конденсаторов, рефрижераторов [6,7].
Благодаря высокой липофильности и низкой водорастворимости бифенилы обладают выраженной способностью к аккумуляции в звеньях пищевой цепи и в последующем в органах с высоким содержанием липидов и интенсивным стероидогенезом, таких как нервная ткань, надпочечники, яичники, яички [8,9,10,11]. В результате интоксикации ПХБ развиваются многоуровневые патохимические сдвиги, лежащие в основе нейро-, гепато-, иммунотоксичности, эндокринных, кардиоваскулярных, репродуктивных, канцерогенных и других эффектов ПХБ [3,5,6,12,13,14].
В то же время имеющиеся в литературе сведения о механизмах токсического поражения мужской половой системы противоречивы и требуют углублённого исследования. Ранее нами было показано [15], что подострая интоксикация ПХБ сопровождается угнетением стероидо- и сперматогенеза у эксперимен-
тальных крыс-самцов. Для уточнения возможных причин обнаруженных сдвигов предпринято настоящее исследование, целью которого явилось изучение оксидантного статуса эякулята в условиях подострого отравления ПХБ в различных дозах.
Материал и методы
Объектом исследования явились 60 белых беспородных самцов крыс. При выполнении экспериментов соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных». Интоксикацию вызывали внутрижелудочным введением с помощью специального металлического зонда отечественной смеси ПХБ «Совол», включающей 26% тетра-, 65% пента-, 9% гекса-хлорбифенилов и следовые количества гепта-хлорбифенилов.
Животные были разделены на 3 группы по 10 крыс в каждой. Подострое отравление осуществляли ежедневным введением токсиканта в течение 28 дней в суммарных дозах 300 мг/кг (0,05 LD50) и 600 мг/кг (0,1 LD50). Животным контрольной группы вводили оливковое масло. По достижении срока исследования у части подопытных животных путем трансректальной электростимуляции получали эякулят и проводили качественноколичественное исследование в камере Горяева. В эякуляте определяли также концентрацию глутатиона восстановленного [16], ас-корбата [17], токоферола [18], содержание свободных сульфгидрильных групп (ССГ)
[19], активность глутатионпероксидазы (ГПО)
[20], глутатионредуктазы (ГР) [21]. Содержа-
ние активных соединений тиобарбитуровой кислоты (ТБК-РП) и общую антиоксидантную активность (ОАА) соответственно оценивали с помощью диагностических наборов производства ООО «Агат-Мед» (Россия) и
«Randox» (Великобритания). Активность су-пероксиддисмутазы (СОД) оценивали с помощью реактивов набора RANSOD фирмы Randox Labor. Ltd., каталазы - по методу М. А. Королюк с соавт. [22].
Математическую обработку данных проводили с помощью пакета Statistica 6,0 фирмы Stat Soft для обработки статистической информации. В группах выборки оценивали следующие параметры: значения медианы, нижний и верхний квартили. Сравнение групп проводили с использованием непараметрического (критерий Манна-Уитни) метода.
Результаты и их обсуждение
Морфометрическое исследование спермы экспериментальных животных выявило серьезные изменения её количественных и
особенно качественных параметров (табл.1).
Таблица 1
Спермограмма на 28-й день подострой интоксикации
«Соволом» в различных дозах, Me [25%;75%]
Показатель Контроль 0,05 LD50 0,1 ld50
Общая концентрация сперматозоидов, млн/мл 41,50 [33,00;52,00] 36,50 [30,00;46,00] Р1-2=0,3074 32,00 [25,00;39,00] Р1-3=0,0539 Р2-3=0,2899
Сперматозоиды с поступательным движением, млн/мл 64,79 [63,64;65,39] 26,04 [25,81;26,32] pi_2=0,0001 18,56 [18,19;19,05] р1.3=0,0001 р2.3=0,0001
Сперматозоиды с колебательным движением, млн/мл 32,53 [30,77;33,34] 57,55 [57,15;58,00] p1.2=0,0001 48,57 [48,15;48,84] р1.3=0,0001 р2.3=0,0001
Сперматозоиды без двигательной активности, млн/мл 3,34 [2,78;3,71] 16,67 [16,00;16,67] p1.2=0,0001 32,58 [32,26;33,34] р1.3=0,0001 р2.3=0,0001
Существенное падение общей концентрации сперматозоидов в эякуляте крыс, получавших большую дозу токсиканта (0,1 ЬБ5о), составило 24,12%, однако оно не достигало уровня статистически значимых отличий (р>0,05). Более заметные сдвиги наблюдались при оценке функциональной активности мужских половых клеток. Содержание гамет с поступательным движением оказалось сниженным в условиях интоксикации бифенилами в обеих суммарных дозах (0,05 ЬБ50 и
0,1 ЬБ5о) - на 59,76% (р<0,0001) и 71,16% (р<0,0001) соответственно по сравнению с показателями интактных самцов. При этом закономерно возрастала доля спермиев с колебательным движением на 27,54% и особенно заметно сперматозоидов без двигательной активности - в 5-10 раз.
Установлено, что развитие окислительного стресса лежит в основе патогенеза суб-фертильного состояния при заболеваниях различной природы [23]. Выявленные нами сдвиги также могут являться следствием нарушения редокс-баланса оксидантного статуса эякулята. Действительно, как показало биохимическое исследование спермоплазмы экспериментальных крыс, подострое отравление «Соволом» приводило к приросту содержания продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, на 54,92% (р<0,0057) - 107,49% (р<0,0002) (рис.).
При этом наблюдалось прогрессивное снижение общей антиоксидантной активности спермы, достигающее при воздействии ксенобиотика в дозе 0,1 ЬБ50 68,55% (р<0,0101) относительно контрольного уровня (табл. 2). В этих условиях происходило истощение пула неферментных антиоксидантов (АО) прямого действия - аскорбиновой кислоты и токоферола. Так, спермальный уровень водораство-
римого АО снижался по мере увеличения токсической экспозиции дозой 0,05 ЬБ50 на 22,7% (р<0,0493), дозой 0,1 ЬБз0 - на 32,81% (р<0,0072) по сравнению с контролем. Содержание важнейшего мембранопротектора -токоферола - составило в эякуляте этих животных 74,57% (р<0,0283) и 76,37%
(р<0,0283) соответственно.
Рис. Содержание ТБК-РП в эякуляте крыс на 28-й день подострой интоксикации «Соволом» в различных дозах * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой
Поддержание восстановленного состояния указанных неферментных АО осуществляется с помощью восстановленного глута-тиона, участвующего на всех уровнях антиок-сидантной защиты тканей [24].
Таблица 2
Содержание общей антиоксидантной активности и неферментативных антиоксидантов в эякуляте крыс на 28-й день подострой интоксикации «Соволом» ____________в различных дозах, Ме [25%;75%]_________
Показатель Контроль 0,05 ЬБ50 0,1 ЬБз0
ОАА, % торможения 68,31 [55,73;86,98] 59,99 [49,19;76,90] р1-2=0,2899 47,20 [38,41;59,56] р1-3=0,0101 р2-3=0,0587
Глутатион, мкг/мг белка 0,96 [0,73;1,36] 0,73 [0,58;0,92] рі-2=0,0696 0,59 [0,47;0,76] р1-3=0,0065 р2-3=0,1041
ССГ, мг/г белка 29,25 [23,24;36,17] 23,46 [18,35;29,41] р1-2=0,0963 21,96 [17,36;27,28] р1-3=0,0283 р2-3=0,7054
Аскорбат, мкг/мг белка 1,15 [0,94;1,47] 0,89 [0,73;1,14] р1-2=0,0493 0,78 [0,64;0,99] р1-3=0,0072 р2-3=0,2568
Токоферол, мкг/мг белка 2,39 [1,93;2,91] 1,77 [1,40;2,21] р1-2=0,0283 1,82 [1,45;2,24] р1-3=0,0283 р2-3=0,7054
Его содержание в эякуляте крыс, подвергшихся максимальной токсической нагрузке, снижалось до 58,46% (р<0,0065) от показателей самцов контрольной группы. Регенерация низкомолекулярного тиола также оказывалась неэффективной в условиях воздействия «Совола» в суммарной дозе 0,1 ЬБ50, поскольку наблюдалось падение глутатионре-дуктазной активности эякулята экспериментальных крыс (табл.3). Нарастающий дефицит
восстановленной формы тиолсодержащего трипептида, выполняющего важнейшие ко-факторные функции, является наиболее вероятной причиной угнетения глутатионперокси-дазы, активность которой составила 60,30% (р<0,0030; 0,05 ЬБ5о) и 66,86% (р<0,0081; 0,1 ЬБ5о).
Таблица 3
Активность ферментов антиоксидантной системы в эякуляте крыс на 28-й день подострой интоксикации «Соволом» в раз________________личных дозах, Ме [25%;75%] ____________
Показатель Контроль 0,05 ЬБз0 0,1 ЬБз0
Глутатионперокси-даза, мкмоль/мин/мг белка 3,44 [2,74;4,25] 2,08 [1,67;2,54] р1-2=0,0019 2,30 [1,81;2,86] р1-3=0,0081 р2-3=0,4496
Глутатионредуктаза, нмоль/мин/мг белка 1,56 [1,26;1,91] 1,25 [0,98;1,56] р1-2=0,0963 1,15 [0,91;1,44] р1-3=0,0283 р2-3=0,6231
Супероксиддисму-таза, Е/мг белка 1,04 [0,83;1,27] 0,83 [0,65;1,04] р1-2=0,0963 0.76 [0,59;0,95] р1-3=0,0283 р2-3=0,4726
Каталаза, мкмоль/мин/мг белка 10,37 [8,57;12,38] 7,24 [6,04;8,59] р1-2=0,0051 7,57 [6,23;9,09] р1-3=0,0081 р2-3=0,7054
Параллельно этому наблюдалось угнетение активности ферментов - супероксид-дисмутазы на 26,89% (р<0,0283) и каталазы на 26,88%, (р<0,0081). Обнаруженное уменьшение емкости антиоксидантной системы приводит к тому, что мишенью для атаки свободными радикалами становятся структурные компоненты клеток, в том числе белки, что подтверждается снижением уровня свободных сульфгидрильных групп в эякуляте крыс на 24,84% (р<0,0283; 0,1 ЬБ5о) (табл. 2).
Рассматривая обнаруженные патохимические сдвиги оксидантного статуса эякулята крыс в условиях интоксикации полихлорби-фенилами в совокупности, необходимо подчеркнуть их тесную связь и взаимообусловленность. Полученные в результате разных методологических подходов экспериментальные данные убедительно доказывают развитие окислительного стресса в семенной жидкости экспериментальных животных. Интенсификация микросомального окисления, как источника свободных радикалов, влечет за собой инициацию с последующей эскалацией процессов липопероксидации клеточных структур [23] и, очевидно, может считаться одним из пусковых механизмов токсичности полихлорбифенилов. Наблюдавшееся значительное снижение низкомолекулярных антиоксидантов - аскорбиновой кислоты, особенно, восстановленного глутатиона, очевидно, является следствием повышенного расходовании последнего в реакциях нейтрализации свободных радикалов.
Самые заметные сдвиги активности зафиксированы со стороны глутатионредукта-зы, осуществляющей редукцию глутатиона, участвующего как в глутатионпероксидазной реакции, так и в поддержании восстановленного состояния сульфгидрильных групп белковых молекул, редокс-статуса аскорбата и клетки в целом. Истощение антиоксидантных ресурсов клетки приводит к накоплению су-пероксиданион-радикала, пероксида водорода, гидроксил-радикала, способных путем модификации молекулярной структуры ингибировать каталитическую активность ферментов [24]. В итоге длительное воздействие бифенилов приводит к декомпенсации оксидантного баланса.
Резюмируя полученные данные, необходимо отметить, что воздействие ксенобиотика сопровождается интенсификацией свободнорадикальных реакций на фоне параллельного снижения антиокислительной ак-
тивности эякулята крыс за счет угнетения ферментативного звена АОС и истощения ли-пофильных и водорастворимых антиоксидантов прямого действия. Наиболее важными изменениями, лежащими в основе других выявленных сдвигов, на наш взгляд, следует считать обнаруженные серьёзные нарушения тиол-дисульфидного равновесия и значительное снижение функциональной эффективности системы регенерации глутатиона.
Таким образом, результаты настоящего экспериментального исследования подтверждают выраженные спермотоксические свойства полихлорбифенилов, показывают важную роль развития окислительного стресса в механизме репротоксичности стойких органических загрязнителей и позволяют выделить перспективные направления патогенетической коррекции ПХБ-индуцированной субфертильности.
Сведения об авторах статьи
Булыгин Кирилл Владимирович
аспирант кафедры биологической и биоорганической химии ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава», 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, E-mail: kirill-bh-red@yandex.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Prolactin, fructose, and zinc levels found in human seminal plasma / C. Schoenfeld, R.D. Amelar, L. Dubin, M. Numeroff // Fertil Steril. - 1979. - Vol. 32(2). - P. 206-208.
2. Trends in semen parameters in the northeast of Scotland / S. Sripada, S. Fonseca [et al.] // J Androl.
- 2007. - Vol. 28(2). - P. 313-319.
3. Toxicity of polychlorobiphenyls and its bioremediation / De Supriyo, Pramanik Saroj K., Williams Arthur L. [et al.] // Int. J. of Human Genetics. - 2004. - Vol. 4. - P. 281-290.
4. Comhaire, F. Sperm quality, birth rates and the environment in Flanders (Belgium) / F. Comhaire,
A. Mahmoud, F. Schoonjans // Reprod Toxicol. - 2007. - Vol. 23(2). - P. 133-137.
5. Hauser, R. Environmental organochlorines and semen quality: results of a pilot study / R. Hauser, L. Altshul // Environ Health Perspect - 2002. - Vol. 110(3). - P. 229-233.
2. Майстренко, В.Н. Эколого-аналитический мониторинг стойких органических загрязнителей / В.Н. Майстренко, Н.А. Клюев. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2004. - 323 с.
8. Медицина труда и промышленная экология // Р.Б. Ибатуллина, В.А. Мышкин [и др.] - 2002.
- № 5. - С. 16-19.
9. Гонадотоксическое действие полихлорбифенилов / Д.С. Громенко, Ш.Н. Галимов, З.К. Амирова, А.З. Абдуллина [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008. - Т. 146, №7. - С. 76-79.
10. Inhibition of rat testicular androgenesis by a polychlorinated biphenyl mixture Aroclor 1248 / S.A. Andric , T.S. Kostic , S.S. Stojilkovic , R.Z. Kovacevic // Biol. Reprod. - 2000. - Vol. 62. - P. 18821888.
11. Bessmann, A. Accumulation of polychlorinated biphenyls in steroidogenic tissue of gonads and adrenals in Japanese quail. // Arch Environ Contam Toxicol - 1981. - Vol. 10. - P. 653-662.
12. Bioaccumulation and Distribution of PCBs in Hens and Chickens / D.B. Feshin, K.A. Komarova [et al.] // Organohalogen compounds. - 2005. - P. 1498-1501.
13. Cooke, P.S. Neonatal polychlorinated biphenyls treatment increases adult testis size and sperm production in the rat / P.S. Cooke, Y.D. Zhao, L.G. Hansen // Toxicol Appl Pharmacol. - 1996. - Vol. 136. - P. 112-117.
14. Lee, Y.W. 2,2',4,6,6'-pentachlorobiphenyl (PCB 104) induces apoptosis of human microvascular endothelial cells through the caspasedependent activation of CREB / Y.W. Lee, H.J. Park // Toxicol Appl Pharmacol. - 2003. - Vol. 189.
5. P. 1-10.
15. Toft, G Semen quality and exposure to persistent organochlorine pollutants / G. Toft, A. Rignell-Hydbom // Epidemiology. - 2006. - Vol. 17(4). - P. 450-458.
16. Патохимические механизмы тестикулярной токсичности стойких органических загрязнителей / Э.Ф. Аглетдинов, Ф.Х. Камилов, Е.К. Алехин, К.В. Булыгин [и др.] // Медицинская наука и образование Урала - 2008. - №6. - С. 44-46.
17. Ellman, G.L. Tissue sulfhydryl groups / G.L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. - 1959. - Vol. 82, №1. - Р. 70-77
18. Omaye, S.T. Selected methods for the determination of ascorbic acid in animal cells, tissues and fluids / S.T. Omaye, J.W. Turnball, H.E. Sauberlich // Methods in Enzymology. - 1971. - Vol. 62. -Р. 1-11.
19. Desai, I.D. Vitamin E analysis methods for animal tissues / I.D. Desai // Methods in Enzymology.
- 1984. - Vol. 105. - P. 138-147.
20. Bellomo, G. Modulation of cellular glutathione and protein thiol status during quinone metabolism / G. Bellomo, H. Thor, S. Orrenius //Methods in Enzymology. - 1990. -V. 186. - P. 627-635.
21. Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase / J.K. Rotruck, A.L. Pope, H.E. Ganther, A.B. Swanson [et al.] // Science. - 1973 - Vol. 179. - Р. 588-590.
22. Stall, G.E. Purification and properties of glutathione reductase of human erythrocytes / G.E. Stall, C. Vegel // Biochim Biophys Ada. - 1969. - Vol. 185. - Р. 39-48.
23. Метод определения каталазы / М. А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова, В.Е. Токарев // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
24. Halliwell, B. Biologically significant scavenging of the myeloperoxidase-derived oxidant hypoch-lorous acid by ascorbic acid. Implications for antioxidant protection in the inflamed rheumatoid joint /
B. Halliwell, M. Wasil, M. Grootveld // FEBS Letter. - 1987. - Vol. 213 - P. 15-17.
25. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньщикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь [и др.]. - М.: Фирма «Слово», 2006. - 554 с.
УДК 614.72:613.63
© Т.К. Валеев, Р.А. Сулейманов, Ф.С. Фархутдинова, Л.Н. Мустаева, 2009
Т.К. Валеев, Р.А. Сулейманов, Ф.С. Фархутдинова, Л.Н. Мустаева ГИГИЕНИЧЕСКАЯ РЕГЛАМЕНТАЦИЯ АГИДОЛА-21 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
ФГУН УфНИИ медицины труда и экологии человекаРоспотребнадзора, г. Уфа
Объектами исследований являлись: лабораторные животные - кролики, морские свинки, белые крысы, белые мыши; химическое вещество - производное класса алкилфенолов: агидол-21.
Цель работы - гигиеническое обоснование ПДК в атмосфере населенных мест агидола-21. В процессе работы осуществлялись экспериментальные исследования по изучению токсичности агидола-21 на лабораторных животных.
Рекомендуемый уровень среднесуточной ПДК агидола-21 - 0,3 мг/м3, максимальной разовой - 0,5 мг/м3. Лимитирующий показатель резорбтивное действие.
Ключевые слова: токсичность, экспериментальные исследования, лабораторные животные, агидол-21.
T.K. Valeyev, R.A. Suleimanov, F.S. Farkhutdinova, L.N. Mustayeva HYGIENIC REGULATION OF AGIDOL-21 IN THE AIR OF POPULATION SITES
The objects of the study were laboratory animals including rabbits, guinea pigs, white rats, white mice; a chemical - alkilphenol compound - agidol 21. The purpose of the study was hygienic ground of agidol-21 permissible exposure limits (PELs) in the air of population sites. Experimental studies on agidol-21 toxicity were conducted on laboratory animals. The recommended level of agi-dol-21 daily PEL - 0,3 mg/m3, maximal single - 0,5 mg/m3. Resorption effect is a limiting indicator.
Key words: toxicity, experimental studies, laboratory animals, agidol-21.
Для придания горюче-смазочным материалам, моющим средствам и многим химическим товарам улучшенных эксплуатационных показателей (минимальная коррозийная активность, максимальная устойчивость к окислению, стандартная вязкость и др.), к ним
в небольшом количестве добавляются особые компоненты - стабилизаторы и присадки. В настоящее время широко распространены ал-килфенольные стабилизаторы и присадки, получаемые на основе фенола. К одной из эффективных и широко применяемых групп
