CC BY
38
5 Характеристика нового бактериофага
{S диагностического сибиреязвенного
£ Гамма А-26 жидкого
2 1Саяпина Л.В., 1Абдрашитова А.С., 1Касина И.В., 1Малахаева А.Н., 1Ращепкин Л.И., 1,2Осин А.В.,
■С 2Ляшова О.Ю., 2Валова Т.В., 2Попов Ю.А., 2Микшис Н.И., 3Буравцева Н.П., 2Миронова Н.П.,
І» 2Лобовикова О.А., 4Мокриевич А.Н., 5Гефан Н.Г.
Св 1ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России, [email protected]
Ї 2ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов, Россия, [email protected]
3ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора, Ставрополь, Россия, [email protected] 5 4ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Оболенск, Россия, [email protected]
§ -ФГУЗ И„тс„ НИПЧИ Сибири и ДВ Роспотребнадзора, ^ Юса* оЬ&ЬшШНШ.*
Characteristics of new diagnostic anthracis bacteriophage Gamma A-26 liquid
1Sayapina L.V., 1Abdrashitova A.S., 1Kasina I.V., 1Malakhaeva A.N., 1Raschepkin L.I., 2Osin A.V., 2Lyashova O.Y., 2Valova T.V., 2Popov Y.A., 2Mikshis N.I., 3Buravzeva N.P., 2Mironova N.P., 2Lobovikova O.A., 4Mokrievich A.N., 5Gefan N.G.
1Federal State Budgetary Institution «Tarasevich State Research Institute of Standardization and Control of Biological Medicines», Minzdravsocrazvitia RF, [email protected]
2Federal State Healthcare Institution Russian Antiplague Scientific and Research Institute «Microbe», [email protected]
3Federal State Healthcare Institution Stavropol Antiplague Scientific and Research Institute of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being, Stavropol, Russia, snipchi©mail.stv.ru
4Federal State Institution of Science State Scientific Center of the Applied Microbiology and Biotechnology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being, Obolensk, Russia, [email protected]
5Federal State Healthcare Institution Antiplague Scientific and Research Institute of Siberia and Far East of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being, Irkutsk, Russia, [email protected]
f > В результате проведенных медицинских испытаний диагностической ценности нового бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого показана его высокая эффективность. Бактериофаг лизировал 97,9% штаммов Bacillus anthracis из 47 исследованных. При изучении 72 штаммов гетерологичных микроорганизмов 69 были резистентны к бактериофагу, что составило 95,8%. Метод определения чувствительности испытуемых штаммов к лизирующе-мудействию сибиреязвенного бактериофага является технически простым, информативным и легко воспроизводимым. Препарат рекомендован к регистрации в качестве изделия медицинского назначения.
Ключевые слова: сибиреязвенные бактерии, сибиреязвенный бактериофаг, диагностическая эффективность, фагодиагностика
Библиографическое описание: Саяпина Л.В., Абдрашитова А.С., Касина И.В. с соавт. Характеристика нового бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого // Биопрепараты. — 2011. — № 1. — С. 36-39.
The results of medical trials of diagnostic value of the new bacteriophage anthracis Gamma A-26 liquid showed it’s high efficacy. The bacteriophage has bacteriolyzed 97,9% Bacillus anthracis strains of 47 examined. When studying 72 strains of heterologous microorganisms, 69 of them were resistant to bacteriophage equal to 95,8%. The method of determining test strains sensibility to bacteriolyzing activity of anthracis bacteriophage is technically simple, informative and easily repeatable. The medicine is recommended for marketing authorization as a medical product.
Key words: anthracis bacterias, anthracis bacteriophage, diagnostic efficacy, phage based diagnostics Bibliographical entry: Sayapina L.V., Abdrashitova A.S., Kasina I.V. et al. Characteristics of new diagnostic anthracis bacteriophage Gamma A-26 liquid // Biopreparats (Biopharmaceuticals). — 2011. — № 1 — P. 36-39.
ПРЕПАРАТЫ
Для корреспонденции:
Саяпина Л.В. — заведующая лабораторией препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ФГУН «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ.
Адрес: ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ.
119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41, [email protected] Статья поступила 03.12.2011 г, принята к печати 23.12.2010 г
Сибирская язва во многих странах мира продолжает представлять серьезную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства [1-3, 6]. На территории Российской Федерации спорадические заболевания людей сибирской язвой регистрируются постоянно [1, 2]. В настоящее время диагностика этой инфекции осуществляется в соответствии с требованиями МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы», в которых одним из опорных тестов, позволяющих идентифицировать штаммы Bacillus snthraois, является лизабельность бактериофагом. Особую ценность приобретает этот метод при идентификации атипичных по капсулообразова-нию, вирулентности и биохимическим свойствам штаммов сибиреязвенного микроба. По данным
A.Г. Рязановой с соавт. [4] частота выделения атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы приблизительно равна частоте выделения штаммов, ошибочно идентифицированных как B. anthracis. Это объясняется общностью свойств B. anthracis с близкородственными микроорганизмами рода Bacillus, что значительно затрудняет их идентификацию.
Учитывая вышеизложенное, в ФГУЗ СтавНИПЧИ разработан бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-2б жидкий, представляющий собой стерильный фильтрат фаголизата бульонной культуры сибиреязвенного штамма B. anthracis 228/8, содержащий взвесь частиц фага Гамма А-26, обладающих лизирующим действием в отношении штаммов B. anthracis.
Цель настоящего исследования — изучение диагностической ценности препарата бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого (специфическая активность, специфичность, воспроизводимость).
Материалы и методы
В строго контролируемых опытах использовали чистые культуры Bacillus anthracis 47 штаммов и гетеро-логичные микроорганизмы: B. cereus (25 штаммов),
B. subtilis (15 штаммов), B. thuringiensis (12 штаммов),
B. megaterium (10 штаммов), B. anthracoides (7 штаммов) и B. mesentericus (3 штамма). Испытуемые штаммы были получены из коллекций «ГКПМ» ГИСК им. Л.А.Тарасевича, «ГКПБ» ФГУЗ «Микроб», «ГКПМ» ФГУН ГНЦ ПМБ, коллекции микроорганизмов ФГУЗ ИркутскНИПЧИ. Все они были типичными по культурально-морфологическим, биохимическим и генетическим свойствам. Перед постановкой опыта штаммы были зашифрованы, их дешифровку проводили после учета результатов.
Контрольным препаратом служил бактериофаг диагностический сибиреязвенный жидкий Fah ВНИИВВиМ, производства РАСН ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии. Бактериофаги были отконтро-лированы в ФГУН «ГИСК им. Л.А.Тарасевича».
Препараты оценивали по физическим свойствам (внешний вид, рН), специфической активности, специфичности и воспроизводимости. Представленные серии бактериофагов соответствовали требованиям нормативной документации. По физическим свойствам испытуемый и контрольный препараты представляли собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета. Препарат сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 имел рН 6,6 и содержал 4,7х109 фаговых частиц/мл, бактериофаг РаИ ВНИИВВиМ — 1,2х109 фаговых частиц/мл и имел рН 7,1.
Изучение специфической активности и специфичности испытуемого и контрольного препаратов проводили путем высева исследуемых штаммов на чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,2+0,1. Выросшую культуру через 24 ч инкубации при температуре (36±1)оС пересевали в пробирки, содержащие (з,5+0,5) мл бульона Хоттингера. Через (5±1) ч инкубации бульонную культуру одного из исследуемых штаммов наносили бактериологической петлей на агаровую пластинку и растирали диаметром до 1,5 см. После подсушивания в центр пятна наносили по капле неразведенных бактериофагов Гамма А-26 или РаИ ВНИИВВиМ и инкубировали при температуре (36±1)оС в течение (18±2) ч.
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований показана возможность использования бактериофага Гамма А-26 для идентификации штаммов В. anthracis в вегетативной форме. Продолжительность анализа с учетом подготовки штаммов составила около 30 ч. Результаты учитывали через (5±1) ч (предварительный учет) и через (18±2) ч (окончательный учет) путем визуального просмотра невооруженным глазом участков нанесения культуры исследуемого штамма и бактериофага. Положительной считали пробу при степени лизиса не менее, чем на три креста.
Учет результатов не вызывал затруднений ни в одном случае как при окончательном, так и при предварительном просмотре чашек с посевами. Через (5±1) ч инкубации на месте нанесения культуры с бактериофагом пятна лизиса были полупрозрачными или полностью прозрачными. Через (18±2) ч отмечался полный лизис культур с прозрачным дном литического пятна или с единичными колониями вторичного роста. Вместе с тем было отмечено, что размер литического пятна бактериофага Гамма А-26 со штаммами В. anthracis был значительно больше, чем у бактериофага РаИ ВНИИВВиМ (10 и 6 мм соответственно).
Сводные данные о диагностической ценности опытного и контрольного бактериофагов представлены в таблице. В результате проведенных сравнительных испытаний на четырех базах (ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича, ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», ФГУЗ ИркутскНИПЧИ, ФГУП ГНЦ ПМБ, Оболенск) показана
О7
диагностическая равноценность испытуемого бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 и препарата сравнения бактериофага сибиреязвенного РаИ ВНИИВВиМ. Установлено, что бактериофаг Гамма А-26 лизировал 97,9% штаммов В. anthracis из 47 исследованных. Устойчивым к бактериофагу был один штамм В. anthra-cis ПС-4от. С помощью препарата сравнения процент правильно идентифицированных чистых культур штаммов В. anthracis к числу исследованных составил 89,4.
Известно, что существующие сибиреязвенные бактериофаги различаются по широте спектра лизируе-мых ими штаммов возбудителя сибирской язвы, а также по специфичности их действия. Феномены чувствительности и фагорезистентности представляют интерес не только с точки зрения надежности теста фаголизабельности при идентификации сибиреязвенных культур, но и как основа метода выделения штаммов В. anthracisс разной чувствительностью к действию бактериофагов [4, 5].
При изучении спектра литической активности бактериофагов в отношении 72 штаммов гетерологичных микроорганизмов показано, что 69 штаммов были резистентны к сибиреязвенному бактериофагу Гамма А-26, а два штамма В. cereus и один штамм В. subtilis уаг. mesentericus лизировались испытуемым препаратом. Бактериофаг РаИ ВНИИВВиМ не лизировал 71 штамм гетерологичных микроорганизмов и лизировал штамм В. subtilis уаг. mesentericus.
При анализе полученных данных установлено, что специфичность испытуемого бактериофага составила 95,8%, контрольного — 98,6%. Следует отметить, что фаголизабельность не является строго специфичным видовым признаком, так как возбудитель сибирской язвы входит в группу близкородственных бацилл и имеет ряд общих свойств с другими ее представителями. По данным П.Г. Васильева с соавт. [5] умеренные бакте-
риофаги, названные сибиреязвенными в связи с выделением их из лизогенных штаммов B. anthracis, оказались способными лизировать культуры штаммов близкородственных бацилл.
Проведенные исследования позволили установить достаточно высокую информативность нового препарата. Однако следует отметить, что выделяемые штаммы, не лизирующиеся сибиреязвенным бактериофагом, но по некоторым признакам соответствующие сибиреязвенному микробу, требуют дополнительных исследований. У всех выделенных культур, подозрительных на принадлежность к возбудителю сибирской язвы, должны определяться свойства, характеризующие их видовую принадлежность, а при необходимости изучать и дополнительные свойства по внутривидовому типиро-ванию. В связи с этим изучение фаголизабельности в качестве дополнительного критерия, наряду с методами ускоренной идентификации (МФА, ПЦР-метод), основными идентификационными тестами, такими как обнаружение капсулы in vitro, гемолиза, чувствительности к пенициллину, подвижности и др., позволит значительно улучшить диагностику при идентификации типичных и атипичных штаммов B. anthracis.
Метод изучения чувствительности испытуемых штаммов к лизирующему действию сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 является технически простым, информативным и легко воспроизводимым. Проведенные эксперименты это подтверждают. При постановке теста с помощью испытуемого бактериофага со штаммами B. anthracis и B. cereus в 10 повторностях в разные дни и разными исполнителями во всех случаях установлено совпадение результатов как с фагочувствительным, так и с фагорезистентным штаммами.
Полученные данные явились основанием для внесения изменений в нормативную документацию. В проект технических условий дополнительно включен метод
Сводные данные испытаний диагностической ценности бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого
Показатели Количество штаммов Результаты исследований
бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 сибиреязвенный бактериофаг ВНИИВВиМ
Процент(Р±р)правильно идентифицированных штаммов В. апґЬгасів к числу исследованных 47 97,9±2,1 89,4±4,5
Процент (Р±р) отрицательных результатов при исследовании гетерологичных микроорганизмов 72 95,8±2,3 98,б±1,4
Воспроизводимость - процент (Р±р) совпадений результатов исследования положительных и отрицательных проб 20 100±0 100±0
Скорость учета результатов, процент правильности идентификации штаммов 119 (5±1)ч (предварительный учет) 100 % (5±1)ч (предварительный учет) 100 %
(18±2) ч (окончательный учет) 100 % (18±2) ч (окончательный учет) 100 %
ПРЕПАРАТЫ
постановки пробы при определении спектра литиче-ской активности бактериофага, а именно, для получения более четкого литического пятна рекомендовано растирать исследуемую культуру на агаровой пластинке диаметром до 1,5 см. При проведения контроля по проекту ТУ, представленному авторами, при нанесении капли культуры без растирания, из-за малого «газона» роста культуры невозможно было определить степень лизиса. В Инструкцию по применению внесено дополнение: «Ввиду наличия генетического родства сибиреязвенного микроба с другими представителями рода Bacillus, допускается лизис гетерологичных штаммов не более, чем у 5% от числа исследуемых». В связи с этим применение сибиреязвенного бактериофага
должно использоваться в комплексе с другими методами идентификации микрооорганизмов рода Bacillus, изложенными в МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы».
Вывод:
Проведенные испытания, свидетельствующие о диагностической ценности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого, позволили рекомендовать его к регистрации в качестве изделия медицинского назначения в Российской Федерации для использования при идентификации штаммов B. anthracis.
Литература:
1. Сибирская язва: актуальные проблемы разработки и внедрения медицинских средств защиты: руководство для врачей / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кожухова. — М., 2010.
2. Сибирская язва: Актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики // Г.Г. Онищенко, Н.Т. Васильев, Н.В. Литусов и др. — М., 1999.
3. Маринин Л.И., Тюрин Е.А. Опасность заноса (завоза) сибирской язвы из зарубежных стран // Матер. VIII Межгосударст. науч.-практ. конфер. государств-участников СНГ. — Саратов, 2007. —
С. 79-81.
4. Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Рязанова А.Г. и др. Усовершенствование методов идентифика-
ции атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы и их дифференциация от близкородственных бацилл // Журн. гиг, эпид., микробиол. и иммунолог. —2009. — № 3. — С. 76-80.
5. Васильев П.Г., Иванов Ю.И., Сенькин А.В. и др. Типирование штаммов B. anthracis и близкород-ственныз бацилл с помощью умеренных бактериофагов // Матер. юбилейн. науч. конфер., посвящ. 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ. — Екатеринбург, 1999. — С. 35-36.
6. Bush L.M., Abrams B.H., Beall A., Johnson C.C. Index case of fatal inhalational anthrax due to bioterrorism in the United States // Nl. Engl. J. Med. — 2001. — Vol. 345. — P. 1607-1610.
